KONDENSATY WYDYCHANEGO POWIETRZA – ŹRÓDŁ ŁO BIOMARKERÓW CHORÓB UKŁ ŁADU ODDECHOWEGO W. Hewelt-Belka, M. Kroplewska, A. Kot-Wasik
J. Namieś śnik Katedra Chemii Analitycznej, Wydział Chemiczny, Politechnika Gdańska, ul. Gabriela Narutowicza 11/12 80-233 Gdańsk
1 Nowoczesne techniki badawcze w analizie farmaceutycznej i medycznej. Collegium Medicum UMK, Bydgoszcz, 10-12.09.2014
Diagnostyka medyczna Poszukiwanie biomarkerów objawów chorobowych w trakcie analizy próbek materiału biologicznego: – tkanki (biopsja), – krew, – mocz, – wydychane powietrze – próbki kondensatów oddechowych.
2 Nowoczesne techniki badawcze w analizie farmaceutycznej i medycznej. Collegium Medicum UMK, Bydgoszcz, 10-12.09.2014
Problemy z prowadzeniem badań ń próbek pobieranych w sposób inwazyjny (tkanki, krew)
1. Konieczna zgoda komisji bioetycznej. 2. Ograniczony dostęp do próbek. 3. Opóźnienie czasowe w uzyskiwaniu informacji.
3 Nowoczesne techniki badawcze w analizie farmaceutycznej i medycznej. Collegium Medicum UMK, Bydgoszcz, 10-12.09.2014
Analityka i monitoring wydychanego powietrza
•
techniki bezpośredniego pomiaru poziomów zawartości poszczególnych składników w czasie rzeczywistym (real time) z wykorzystaniem automatycznych analizatorów i monitorów
•
wykorzystanie elektronicznego nosa (e-nose)
4 Nowoczesne techniki badawcze w analizie farmaceutycznej i medycznej. Collegium Medicum UMK, Bydgoszcz, 10-12.09.2014
Pobieranie próbek analitów z wydychanego powietrza Pojemniki na próbkę:
Worki o różnej pojemności wykonane z tworzywa Tedlar Analiza próbek z worków (zawór, strzykawka) NIEBEZPIECZEŃSTWO ZMIANY SKŁADU!
5 Nowoczesne techniki badawcze w analizie farmaceutycznej i medycznej. Collegium Medicum UMK, Bydgoszcz, 10-12.09.2014
Pobieranie próbek analitów z wydychanego powietrza Wykorzystanie próbników pasywnych w połączeniu z : Ekstrakcją analitów za pomocą rozpuszczalnika, Desorpcją termiczną analitów.
6 Nowoczesne techniki badawcze w analizie farmaceutycznej i medycznej. Collegium Medicum UMK, Bydgoszcz, 10-12.09.2014
Pobieranie próbek analitów z wydychanego powietrza Zatrzymywanie analitów ze strumienia wydychanego powietrza w pułapce w procesie: – absorpcji, – adsorpcji, – reakcji chemicznej, – wymraż żania (puł łapka kriogeniczna).
7 Nowoczesne techniki badawcze w analizie farmaceutycznej i medycznej. Collegium Medicum UMK, Bydgoszcz, 10-12.09.2014
Powstawanie kondensatów oddechowych Przepł ływ strumienia powietrza
Powierzchnia dróg oddechowych Przepł ływ strumienia powietrza
Powierzchnia kondensatora • krople płynu wyściełającego drogi oddechowe odrywają się od śluzówki i są rozcieńczone poprzez parę wodną kondensującą się na powierzchni kondensatora
8 Nowoczesne techniki badawcze w analizie farmaceutycznej i medycznej. Collegium Medicum UMK, Bydgoszcz, 10-12.09.2014
Pobieranie próbek kondensatów oddechowych objętość zbieranych próbek: 1,5-2 mL czas zbierania próbki: 15 minut [1]
Zalety: - prostota realizacji, - nieinwazyjny charakter techniki pobierania próbek. [1] Lema J.B. et al., Arch Bronconeumol., 2005, 41:584-586
9
Nowoczesne techniki badawcze w analizie farmaceutycznej i medycznej. Collegium Medicum UMK, Bydgoszcz, 10-12.09.2014
Urzą ądzenia do pobierania próbek EBC dostę ępne na rynku
schemat
EcoScreen
RTube
10 Nowoczesne techniki badawcze w analizie farmaceutycznej i medycznej. Collegium Medicum UMK, Bydgoszcz, 10-12.09.2014
Wykorzystanie wyników analizy próbek EBC w diagnostyce chorób ukł ładu oddechowego: • • • • • •
katar sienny, astma, przewlekła obturacyjna choroba płuc (COPD), mukowiscydoza, nowotwory płuc, obturacyjny zespół bezdechu śródsennego (OSA).
11 Nowoczesne techniki badawcze w analizie farmaceutycznej i medycznej. Collegium Medicum UMK, Bydgoszcz, 10-12.09.2014
BIOMARKERY Czynniki molekularne, genetyczne lub biochemiczne służące do precyzyjnej diagnostyki chorób oraz oceny prawdopodobieństwa wystąpienia danej choroby.
12 Nowoczesne techniki badawcze w analizie farmaceutycznej i medycznej. Collegium Medicum UMK, Bydgoszcz, 10-12.09.2014
pH Osoby zdrowe: pH EBC: 7.4-8.8 [1]. Spadek pH EBC zaobserwowano w przypadku występowania: - astmy [2], - COPD [3], - mukowiscydozy [4]. pH - marker stanów zapalnych dróg oddechowych [1] Paget-Brown A. et al. Chest. 2006; 129:426-30 [2] Kostikas K. et al. 2008; 38:557-65 [3] Kostikas K. et al. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2002;165:1364–70 [4] Tate S. et al. Thorax 2002; 57: 926–929
13
Nowoczesne techniki badawcze w analizie farmaceutycznej i medycznej. Collegium Medicum UMK, Bydgoszcz, 10-12.09.2014
Tlenek azotu (NO) i jego metabolity •
NO jest synetyzowany przez syntazę tlenku azotu (Nitric Oxide Synthase - NOS)
•
poziom NO wzrasta w obecności utleniaczy i prozapalnych cytokin
•
NO jest biomarkerem astmy, COPD, nowotworu płuc [1,2] RSNO L-arginina
NO
Snitrozotiole
H RS
S
-•
O2
NO
NNOO-/ONOOH
N 2O O2
Fe 2+
nadtlenoazotyn O2 NO3 • NO2NO3-
N 2O 4
N 2O 3
•NO
2
[1] American Thoracic Society Workshop Am J Respir Crit Care Med.,2006; 173: 811–813 [2] Alves Vento D., et al., Arch Bronconeumol. 2012;48:120-5
Nowoczesne techniki badawcze w analizie farmaceutycznej i medycznej. Collegium Medicum UMK, Bydgoszcz, 10-12.09.2014
14
NOx – azotany i azotyny • podwyższony poziom azotynów i azotanów zaobserwowano u pacjentów z objawami astmy [1] • podwyższony poziom NO2- zaobserwowano u pacjentów ze stwierdzoną chorobą ą COPD [2]
• podwyższony poziom zaobserwowano u pacjentów z objawami astmy oskrzelowej oraz COPD [2]
[1] Ratnawati. et al., Pediatr. Pulmonol. 2006;41:929–36 [2] Corradi M. et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2001;163:854–8
15
Nowoczesne techniki badawcze w analizie farmaceutycznej i medycznej. Collegium Medicum UMK, Bydgoszcz, 10-12.09.2014
3-nitrotyrozyna • powstaje w wyniku reakcji nadtlenoazotynu z tyrozyną • podwyższony poziom zaobserwowano u pacjentów z objawami astmy [1]
O
O 2N HO
OH NH2
[1] Hanazawa T. et al., Am J Respir Crit Care Med. 2000 Oct;162 (4 Pt 1):1273-6
Nowoczesne techniki badawcze w analizie farmaceutycznej i medycznej. Collegium Medicum UMK, Bydgoszcz, 10-12.09.2014
16
Eikozanoidy związki aktywne biologicznie, które powstają w procesie enzymatycznego przekształcenia kwasu arachidonowego i innych kwasów C20, posiadających wiązania podwójne OH
•
ArA
O
HO
OH
HO
O
O
HO
O
O O
HO
CH3
CH3
PGF2
OH
OH
OH
PG(G)H2
O(O)H
PGI2
OH
CH3
OH
OH
O
O
O
O OH
O
HO
HO
O CH3
O
HO
O
O
OH
CH3
HO
CH3
PGE2
PGD2
HO
CH3
OH
TXA2
TXB2
17
Nowoczesne techniki badawcze w analizie farmaceutycznej i medycznej. Collegium Medicum UMK, Bydgoszcz, 10-12.09.2014
Eikozanoidy Akronim
Peł łna nazwa
Prostaglandyna D2 (PGD2)
kwas 9α,15S-dihydroksy-11-okso-prosta-5Z,13E-dien-1-owy
Prostaglandyna E2 (PGE2)
kwas 9-okso-11α α,15S-dihydroksy-prosta-5Z,13E-dien-1-owy
Prostaglandyna F2 (PGF2)
kwas (Z)-7-[(1R,2R,3R,5S)-3,5-dihydroksy-2-[(E,3S)- 3-hydroksyokt-1enyl]cyklopentyl]hept-5-enowy
Prostaglandyna H2 (PGH2)
kwas 9α,11α-epidioksy-15S-hydroksy-prosta-5Z,13E-dien-1-owy
Prostaglandyna I2 (PGI2)
kwas 6,9α-epoksy-11α,15S-dihydroksy-prosta-5Z,13E-dien-1-owy
Tromboksan A2 (TXA2)
kwas (Z)-7-[(1S,2S,3R,5S)-3-[(E,3S)-3-hydroksyokt-1-enyl]-4, 6-dioksabicyklo[3.1.1]heptan-2-yl]hept-5-enowy
Tromboksan B2 (TXB2)
kwas 9α,11,15S-trihydroksytromba-5Z,13E-dien-1-owy
18 Nowoczesne techniki badawcze w analizie farmaceutycznej i medycznej. Collegium Medicum UMK, Bydgoszcz, 10-12.09.2014
Prostaglandyna E2 •
produkt enzymatycznego przekształcenia kwasu arachidonowego
•
podwyższony poziom zaobserwowano u palaczy papierosów cierpiących na astmę ę [1]
•
podwyższony poziom zaobserwowano również u pacjentów z COPD [2]
•
oznaczanie zawartości PGE2 stosowane w diagnostyce stanów zapalnych dróg oddechowych i w ocenie skuteczności nowych terapii COPD (np. inhibitory cyklooksygenazy) [3]
[1] Kostikas K. et al., Eur. Respir. J. 2003;22:743–7 [2] Montuschi P. et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2000;162:1175–7 [3] Montuschi P. et al., Thorax. 2005;60:827–33
19
Nowoczesne techniki badawcze w analizie farmaceutycznej i medycznej. Collegium Medicum UMK, Bydgoszcz, 10-12.09.2014
Leukotrieny •
metabolity kwasu arachidonowego
•
biorą udział w procesie powstawania reakcji alergicznej i podtrzymywaniu przewlekłego zapalenia w drogach oddechowych
•
leukotrieny zawierające w swojej cząsteczce cystynę, nazywane są leukotrienami cysteinylowymi Akronim
Peł łna nazwa
Leukotrien B4 (LTB4)
kwas 5S,12R-dihydroksy-6Z,8E,10E,14Zeikozatetraenowy
Leukotrien C4 (LTC4)
kwas 5S-hydroksy-6R-(S-glutationyl)7E,9E,11Z,14Z-eikozatetraenowy
Leukotrien D4 (LTD4)
kwas 5S-hydroksy-6R-(S-cysteinylglicynyl)7E,9E,11Z,14Z-eikozatetraenowy
Leukotrien E4 (LTE4)
kwas 5S-hydroksy-6R-(S-cysteinyl)-7E,9E,11Z,14Zeikozatetraenowy
Struktura chemiczna
•
podwyższony poziom leukotrienu B4 u pacjentów z objawami astmy oraz COPD [1, 2]
•
podwyższony poziom leukotrienów cysteinylowych u pacjentów cierpiących na katar sienny lub astmę [3, 4]
[1] Montuschi P. et al., J. Allergy Clin. Immunol. 2002;109:615–20 [2] Montuschi P. et al., Thorax. 2003;58:585–8 [3] Failla M. et al. Clin. Exp. Allergy. 2006;36:325–30 [4] Čáp P. et al., Thorax. 2004;59:465–70
Nowoczesne techniki badawcze w analizie farmaceutycznej i medycznej. Collegium Medicum UMK, Bydgoszcz, 10-12.09.2014
20
Izoprostany Powstają w trakcie procesu wolnorodnikowego, nieenzymatycznego utleniania wielonienasyconych kwasów tłuszczowych: • kwasu arachidonowego - ArA, • kwasu eikozapentaenowego - EPA oraz • kwasu dokozaheksaenowego - DHA) O
AA
OH CH3
O
OOH O
OOH
OH
O
OH
O
O
O
O
O
CH3
O
O
OH
OH CH3
O
O CH3
OH OOH
5-izoprostany
OOH
12-izoprostany O
HO
8-izoprostany
HO R
R
R
R
R
O
R
HO
1
HO
F2-isoP
E2-isoP
15-izoprostany
R
1
R
O
O
1
D2-isoP
R
R
O
R
1
J2-isoP
CH3
O R
H3C
1
IsoTxA2
R O 1
O
D2-isoK
R O
R
R
1
A2-isoP
1
O
E2-isoK
OH R
IsoTxB2 HO
O
R
1
21
Nowoczesne techniki badawcze w analizie farmaceutycznej i medycznej. Collegium Medicum UMK, Bydgoszcz, 10-12.09.2014
Izoprostany
OH
Najczęściej w badaniach nad oddziaływaniem
O
F2-izoprostanów wykorzystuje się 8-iso-PGF2α
HO
Podwyższony poziom w próbkach EBC od pacjentów z objawami:
HO
8-iso-PGF2α α HO
CH3
[1] Montuschi P. et al. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 1999;160:216–20 [2] Biernacki W. A. et al., Thorax. 2003;58:294–8 [3] Lucidi V. et al., Free Radical Bio. Med.2008, 45, 913–919 [4] Montuschi, P. et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med. 1998, 58, 1524–1527 [5] Psathakis K. et al., Chest 2004,125, 1005–1011. [6] Carpenter C.T. et al., Chest 1998, 114, 1653–1659. [7] Carpagnano G.E. et al., Chest 2002, 122, 1162–1167
-
astmy [1],
-
COPD [2],
-
mukowiscydozy [3],
-
choroby śródmiąż ąższowej pł łuc [4], ąż
-
obturacyjnego zespoł łu bezdechu sennego [5],
-
zespoł łu ostrej niewydolnoś ści oddechowej [6],
-
sarkoidozy [7].
biomarkery stresu oksydacyjnego dróg oddechowych
Nowoczesne techniki badawcze w analizie farmaceutycznej i medycznej. Collegium Medicum UMK, Bydgoszcz, 10-12.09.2014
22
F2 - izoprostany Akronim
Peł łna nazwa
8-iso-PGF2α
Kwas 9α,11α,15S-trihydroksy-(8β)-prosta-5Z,13Edien-1-owy
8-iso-15(R)-PGF2α
Kwas 9α,11α,15R-trihydroksy-(8β)-prosta-5Z,13Edien-1-owy
11β-PGF2α
Kwas 9α,11β,15S-trihydroxy-prosta-5Z,13E-dien-1owy
15(R)-PGF2α
Kwas 9α,11α,15R-trihydroksy-prosta-5Z,13E-dien-1owy 23
Nowoczesne techniki badawcze w analizie farmaceutycznej i medycznej. Collegium Medicum UMK, Bydgoszcz, 10-12.09.2014
EBC - astma pH Stabilna astma
↓
Zaostrzona astma
↓
Astma u palaczy papierosów Odpowiedź na terapię
NO i metabolity
prostanoidy
lukotrieny
8-isoP
↑ Nox ↑ Nitrotyrozyna ↑ S-nitrozotiole
↔ PGE2 ↑ TBX2
↑ Cys-LTs
↑
↑ Cys-LTs
↑
↓
↓NOx
↑PGE2
↑LTB4
ICS ↓
ICS ↓ NOx ↓
ICS ↔ PGE2 Montelukast ↔ PGE2
Unikanie alergenów ↓Cys-LTs Steroidy donosowe ↓Cys-LTs Montelukast ↓LTE4 ICS ↓Cys-LTs
Grob N.M. Et al., J Breath Res. 2008 September; 2(3): 037004
ICS ↓ lub ↔
kortykosteroidy wziewne (Inhaled Corticosteroids - ICS) Montelukast - lek przeciwastmatyczny i przeciwalergiczny, należący do grupy leków przeciwleukotrienowych Nowoczesne techniki badawcze w analizie farmaceutycznej i medycznej. Collegium Medicum UMK, Bydgoszcz, 10-12.09.2014
24
Techniki analityczne stosowane w badaniach próbek EBC Skł ładnik EBC
Technika analityczna
Leukotrieny
ELISA, GC-MS
Białka
Metoda Bradforda Spektrofotometria fluorescencyjna ELISA Western Blot
Puryny (ATP, ADP, AMP, adenozyna)
HPLC
Mocznik
LC-MS
Malondialdehyd
Spektrofotometria fluorescencyjna
8-Izoprostany
ELISA LC-MS
3-nitrotyrozyna
ELISA HPLC LC-MS
NOx
Spektrofotometria fluorescencyjna
25 Nowoczesne techniki badawcze w analizie farmaceutycznej i medycznej. Collegium Medicum UMK, Bydgoszcz, 10-12.09.2014
Metody oznaczania biał łek •
Metoda Bradforda
Określenie zawartości białka w badanej próbce poprzez pomiar zmiany absorbancji (przy długości fali 595 nm), wywołanej przez związanie się białka z barwnikiem Coomasie Brillant Blue. •
ELISA (ang. enzyme-linked immunosorbent assay)
Wykrywanie określonych białek w badanej próbce z użyciem przeciwciał poliklonalnych lub monoklonalnych skoniugowanych z odpowiednim enzymem. •
Western Blot
Wykrywanie określonych białek w badanej próbce poprzez ich rozdzielenie na płytce z żelem poliakrylamidowym, przeniesienie na membranę (nitrocelulozową bądź z polifluorku winylidenu) i wybarwianie lub koniugację z przeciwciałami.
26 Nowoczesne techniki badawcze w analizie farmaceutycznej i medycznej. Collegium Medicum UMK, Bydgoszcz, 10-12.09.2014
Wykorzystanie techniki HPLC
27 Nowoczesne techniki badawcze w analizie farmaceutycznej i medycznej. Collegium Medicum UMK, Bydgoszcz, 10-12.09.2014
PROBLEMY
28 Nowoczesne techniki badawcze w analizie farmaceutycznej i medycznej. Collegium Medicum UMK, Bydgoszcz, 10-12.09.2014
Etapy badań ń • optymalizacja warunków jonizacji analitów • dobór optymalnego układu detekcyjnego • optymalizacja warunków przygotowania próbek EBC do analizy (przechowywanie, wzbogacanie analitów) • opracowanie procedur analitycznych oznaczania: - izoprostanów - aminokwasów w próbkach kondensatów wydychanego powietrza 29 Nowoczesne techniki badawcze w analizie farmaceutycznej i medycznej. Collegium Medicum UMK, Bydgoszcz, 10-12.09.2014
Oznaczanie izoprostanów w próbkach EBC z wykorzystaniem techniki LC-MS/MS O
O
OH
OH
HO
HO
CH3
CH3 HO
HO
OH
8-iso-PGF2α
OH
8-iso-15(R)-PGF2α
O
O
OH
OH
HO
HO
CH3 HO
Struktury oznaczanych prostanoidów o masie cząsteczkowej M=354,5
OH
11β-PGF2α
CH3 HO
OH
15(R)-PGF2α
Nowoczesne techniki badawcze w analizie farmaceutycznej i medycznej. Collegium Medicum UMK, Bydgoszcz, 10-12.09.2014
30
Optymalizacja warunków jonizacji Typ jonizacji
Izoprostany
3-nitrotyrozyna
Aminokwasy
APCI (+)
-
±
±
APCI (-)
±
-
-
ESI (+)
-
+
+
ESI (-)
+
-
±
Widmo mas 8-iso-15(R)-PGF2α
± słaba czułość + intensywny sygnał - brak sygnału
[M-H]-
Tryb pracy analizatora Q1: przemiatanie widma (SCAN)
31 Nowoczesne techniki badawcze w analizie farmaceutycznej i medycznej. Collegium Medicum UMK, Bydgoszcz, 10-12.09.2014
Dobór optymalnego ukł ładu detekcji Uzyskana rozdzielczość ść R(FWHM)*
Uzyskana dokł ładność ść (Δ Δppm)
Uzyskana czuł łość ść (S/N)
54,4
94 ppm
180
680
64 ppm
560000
10511
8,3 ppm
2000
*Rozdzielczość w połowie wysokości piku,R = Nowoczesne techniki badawcze w analizie farmaceutycznej i medycznej. Collegium Medicum UMK, Bydgoszcz, 10-12.09.2014
m ∆m
32
Dobór optymalnych parametrów pracy spektrometru mas [M-H-C9H17O2]-
O OH
HO
CH 3 HO
OH
[M-H]-
Widmo mas 15(R)-PGF2α łe w trybie monitorowania α powstał wybranej reakcji (SRM) w analizatorze Q3
33
Nowoczesne techniki badawcze w analizie farmaceutycznej i medycznej. Collegium Medicum UMK, Bydgoszcz, 10-12.09.2014
Wszystkie związki z grupy izoprostanów posiadają: - jony (pseudo)cząsteczkowe o wartości m/z: 353,5 - jony fragmentacyjne o wartości m/z: 193,5
Konieczność ść rozdzielenia chromatograficznego
34 Nowoczesne techniki badawcze w analizie farmaceutycznej i medycznej. Collegium Medicum UMK, Bydgoszcz, 10-12.09.2014
Wyniki – izoprostany w próbkach EBC Prób ka
Analit
Opis dawcy
Stęż ężenie ęż [pg/mL]
1
8-iso-15(R)-PGF2α 8-iso-PGF2α 11β-PGF2α 15(R)-PGF2α
M
26 35 27 21
2
8-iso-15(R)-PGF2α 8-iso-PGF2α 11β-PGF2α 15(R)-PGF2α
K
13 17 15 14
3
8-iso-15(R)-PGF2α
K
8,5
4
8-iso-15(R)-PGF2α
K
16
5
8-iso-15(R)-PGF2α
M
179
6
11β-PGF2α
K
13
7-50
8-iso-15(R)-PGF2α 8-iso-PGF2α 11β-PGF2α 15(R)-PGF2α
21- M 23 -K
Poniżej LOD
Izoprostany wykryto w próbkach EBC pochodzących od „zdrowych” studentów – palaczy tytoniu
35
Nowoczesne techniki badawcze w analizie farmaceutycznej i medycznej. Collegium Medicum UMK, Bydgoszcz, 10-12.09.2014
Optymalizacja etapu przygotowania próbek do analizy chromatograficznej
•
badanie procesu sorpcji analitów na powierzchni polipropylenu (naczynie do przechowywania próbek EBC)
•
badanie stabilności izoprostanów w próbkach roztworów wzorcowych i kondensatach wydychanego powietrza (w różnych warunkach przechowywania)
•
optymalizacja parametrów etapu wzbogacania i izolacji analitów obecnych w badanych próbkach
•
optymalizacja parametrów przygotowania próbki z wykorzystaniem liofilizacji jako techniki wzbogacania analitów
36 Nowoczesne techniki badawcze w analizie farmaceutycznej i medycznej. Collegium Medicum UMK, Bydgoszcz, 10-12.09.2014
Badanie procesu sorpcji analitów na powierzchni polipropylenu • określenie ewentualnych strat analitów wynikających z sorpcji analitów na ściankach naczyń polipropylenowych, do których były pobierane próbki kondensatów wydychanego powietrza
Schemat pobierania próbek oraz odzysk związków z grupy izoprostanów w trakcie badań procesu sorpcji analitów na powierzchni ścianki naczynia polipropylenowego
nie stwierdzono występowania zjawiska sorpcji analitów na ściankach naczyń, w których były przechowywane próbki do badań
37 Nowoczesne techniki badawcze w analizie farmaceutycznej i medycznej. Collegium Medicum UMK, Bydgoszcz, 10-12.09.2014
Badanie stabilnoś ści izoprostanów w próbkach roztworów wzorcowych i kondensatach wydychanego powietrza w róż żnych warunkach przechowywania •
kolejne operacje rozmraż żania próbek (zamiana z temperatury -80° °C na pokojową ą)
• roztwór wzorcowy zawierający izoprostany umieszczano w lodówce (-80°C) • po upływie 30 minut roztwór rozmrażano i próbkę poddawano analizie (trzy równoległe analizy) • roztwór ponownie umieszczano w lodówce. • badania powtarzano sześciokrotnie
Kolejne operacje rozmroż żenia nie powodują ą statystycznie istotnych strat analitów.
Odzysk analitów z grupy izoprostanów w trakcie badań stabilności podczas kolejnych operacji rozmrażania roztworu wzorcowego (od temperatury -80°C do temperatury pokojowej)
38 Nowoczesne techniki badawcze w analizie farmaceutycznej i medycznej. Collegium Medicum UMK, Bydgoszcz, 10-12.09.2014.
Wpł ływ temperatury i dostę ępu światł ła • nie stwierdzono istotnych zmian stężenia izoprostanów w próbkach roztworu wzorcowego (w ciągu 7 dni)
Warunki przechowywania roztworów wzorcowych związków z grupy izoprostanów w trakcie badań stabilności
warunki przechowywania próbek kondensatów wydychanego powietrza od momentu pobrania próbki nie mają istotnego wpływu na wyniki oznaczeń
39 Nowoczesne techniki badawcze w analizie farmaceutycznej i medycznej. Collegium Medicum UMK, Bydgoszcz, 10-12.09.2014
Wpł ływ temperatury i dostę ępu światł ła Badaniom poddawano próbki roztworów wzorcowych przechowywanych przez okres 8 tygodni w temperaturze -80°C, -20°C, +4°C i +20°C.
•
Czas [dni]
Odzysk (%) ±CV(%) n=4
Temperatura -80ºC
8-iso-15(R)PGF2α
8-iso-PGF2α
11β-PGF2α
15(R)-PGF2α
0
100 ± 5.8
100 ± 7.8
100 ± 8.9
100 ± 2.5
7
98 ± 6.3
100 ± 3.2
96 ± 1.7
100 ± 3.8
14
98 ± 2.9
96 ± 5.2
96 ± 3.0
99 ± 7.1
21
93 ± 5.3
99 ± 6.9
94 ± 5.4
102 ± 1.0
28
88 ± 3.2
89 ± 6.6
88 ± 2.7
90 ± 4.1
35
92 ± 6.2
98 ± 6.8
93 ± 8.9
96 ± 2.2
42
95 ± 6.0
95 ± 4.6
97 ± 2.9
91 ± 5.3
49
97 ± 2.7
97 ± 2.6
92 ± 8.1
97 ± 2.3
56
94 ± 4.0
93 ± 2.6
89 ± 1.5
92 ± 4.6
Nie stwierdzono istotnych zmian w poziomach zawartości analitów z grupy izoprostanów. Nowoczesne techniki badawcze w analizie farmaceutycznej i medycznej. Collegium Medicum UMK, Bydgoszcz, 10-12.09.2014
40
Optymalizacja warunków prowadzenia liofilizacji – techniki wzbogacania analitów Liofilizacja – technika wzbogacania analitów zarówno trwałych termicznie, jak i związków labilnych. Poprzez obniżenie temperatury oraz ciśnienia (poniżej 10 Pa) możliwa jest sublimacja rozpuszczalnika. Roztwór wzorcowy izoprostanów
Zamrażanie: - 80°C
Liofilizacja: temperatura: - 50°C, ciśnienie:0,027 mBar czas trwania: 24 godziny
Rozpuszczenie liofilizatu (w 250 μl fazy ruchomej)
Wpływ objętości próbki roztworu wzorcowego izoprostanów na odzysk analitów po zastosowaniu liofilizacji jako techniki wzbogacania próbki
Możliwe jest uzyskanie nawet 20-krotnego wzbogacenia analitu w próbce przygotowanej do analizy chromatograficznej.
Analiza LC-MS/MS
41
Nowoczesne techniki badawcze w analizie farmaceutycznej i medycznej. Collegium Medicum UMK, Bydgoszcz, 10-12.09.2014
Procedura oznaczania izoprostanów w próbkach EBC
42 Nowoczesne techniki badawcze w analizie farmaceutycznej i medycznej. Collegium Medicum UMK, Bydgoszcz, 10-12.09.2014
Próbki EBC – komora hiperbaryczna • Próbki pobierano od żołnierzy przechodzących terapię w komorach hiperbarycznych w Instytucie Medycyny Hiperbarycznej w Gdyni (Gdański Uniwersytet Medyczny). • Próbki EBC zbierano przed i po zakończeniu sesji leczniczej w komorze hiperbarycznej trwającej 30 minut.
43 Nowoczesne techniki badawcze w analizie farmaceutycznej i medycznej. Collegium Medicum UMK, Bydgoszcz, 10-12.09.2014
Oznaczanie izoprostanów w próbkach EBC cd.
Na podstawie wyników uzyskanych w trakcie analizy 50 próbek stwierdzono, że stężenie izoprostanu 8-iso-PGF2α w próbkach EBC zebranych od pacjentów po sesji w komorze hiperbarycznej wzrosło średnio 1,81 razy. Nowoczesne techniki badawcze w analizie farmaceutycznej i medycznej. Collegium Medicum UMK, Bydgoszcz, 10-12.09.2014
44
Oznaczanie 21 aminokwasów w próbkach EBC z wykorzystaniem techniki HPLC-MS/MS Większość oznaczanych aminokwasów charakteryzuje się różnymi wartościami liczbowymi m/z przejść jonów (pseudo)cząsteczkowego do fragmentacyjnego, które monitoruje się w trybie MRM pracy spektrometru mas.
brak koniecznoś ści derywatyzacji analitów
45 Nowoczesne techniki badawcze w analizie farmaceutycznej i medycznej. Collegium Medicum UMK, Bydgoszcz, 10-12.09.2014
Oznaczanie 21 aminokwasów w próbkach EBC z wykorzystaniem techniki HPLC-MS/MS Nazwa
[M+H]+
[M+H – CO2H2]+
Alanina (ALA)
90
44
Arginina
175
Asparagina (ASP)
133
Cysteina (CYS)
122
76
Fenyloalanina (FEN)
166
120
Glicyna (GLI)
76
30
[M+H NH3]+
[M+H – CO2H2 – NH3]+
Inne
70; 116; 130 116 105
59 149
59
Oznaczane aminokwasy – otrzymane jony (pseudo)cząsteczkowe i fragmentacyjne
46 Nowoczesne techniki badawcze w analizie farmaceutycznej i medycznej. Collegium Medicum UMK, Bydgoszcz, 10-12.09.2014
Oznaczanie aminokwasów w próbkach EBC Nr
FEN
TYR
ASP
[ng/mL] a
b
c
a
b
c
a
b
c
1
0,771
0,972
1,3
1,030
1,230
1,2
1,650
1,650
1,0
2
0,000
0,650
-