KONDENSATY WYDYCHANEGO POWIETRZA – ŹRÓDŁ ŁO BIOMARKERÓW CHORÓB UKŁ ŁADU ODDECHOWEGO W. Hewelt-Belka, M. Kroplewska, A. Kot-Wasik

J. Namieś śnik Katedra Chemii Analitycznej, Wydział Chemiczny, Politechnika Gdańska, ul. Gabriela Narutowicza 11/12 80-233 Gdańsk

1 Nowoczesne techniki badawcze w analizie farmaceutycznej i medycznej. Collegium Medicum UMK, Bydgoszcz, 10-12.09.2014

Diagnostyka medyczna Poszukiwanie biomarkerów objawów chorobowych w trakcie analizy próbek materiału biologicznego: – tkanki (biopsja), – krew, – mocz, – wydychane powietrze – próbki kondensatów oddechowych.

2 Nowoczesne techniki badawcze w analizie farmaceutycznej i medycznej. Collegium Medicum UMK, Bydgoszcz, 10-12.09.2014

Problemy z prowadzeniem badań ń próbek pobieranych w sposób inwazyjny (tkanki, krew)

1. Konieczna zgoda komisji bioetycznej. 2. Ograniczony dostęp do próbek. 3. Opóźnienie czasowe w uzyskiwaniu informacji.

3 Nowoczesne techniki badawcze w analizie farmaceutycznej i medycznej. Collegium Medicum UMK, Bydgoszcz, 10-12.09.2014

Analityka i monitoring wydychanego powietrza



techniki bezpośredniego pomiaru poziomów zawartości poszczególnych składników w czasie rzeczywistym (real time) z wykorzystaniem automatycznych analizatorów i monitorów



wykorzystanie elektronicznego nosa (e-nose)

4 Nowoczesne techniki badawcze w analizie farmaceutycznej i medycznej. Collegium Medicum UMK, Bydgoszcz, 10-12.09.2014

Pobieranie próbek analitów z wydychanego powietrza Pojemniki na próbkę:

Worki o różnej pojemności wykonane z tworzywa Tedlar Analiza próbek z worków (zawór, strzykawka) NIEBEZPIECZEŃSTWO ZMIANY SKŁADU!

5 Nowoczesne techniki badawcze w analizie farmaceutycznej i medycznej. Collegium Medicum UMK, Bydgoszcz, 10-12.09.2014

Pobieranie próbek analitów z wydychanego powietrza Wykorzystanie próbników pasywnych w połączeniu z : Ekstrakcją analitów za pomocą rozpuszczalnika, Desorpcją termiczną analitów.

6 Nowoczesne techniki badawcze w analizie farmaceutycznej i medycznej. Collegium Medicum UMK, Bydgoszcz, 10-12.09.2014

Pobieranie próbek analitów z wydychanego powietrza Zatrzymywanie analitów ze strumienia wydychanego powietrza w pułapce w procesie: – absorpcji, – adsorpcji, – reakcji chemicznej, – wymraż żania (puł łapka kriogeniczna).

7 Nowoczesne techniki badawcze w analizie farmaceutycznej i medycznej. Collegium Medicum UMK, Bydgoszcz, 10-12.09.2014

Powstawanie kondensatów oddechowych Przepł ływ strumienia powietrza

Powierzchnia dróg oddechowych Przepł ływ strumienia powietrza

Powierzchnia kondensatora • krople płynu wyściełającego drogi oddechowe odrywają się od śluzówki i są rozcieńczone poprzez parę wodną kondensującą się na powierzchni kondensatora

8 Nowoczesne techniki badawcze w analizie farmaceutycznej i medycznej. Collegium Medicum UMK, Bydgoszcz, 10-12.09.2014

Pobieranie próbek kondensatów oddechowych objętość zbieranych próbek: 1,5-2 mL czas zbierania próbki: 15 minut [1]

Zalety: - prostota realizacji, - nieinwazyjny charakter techniki pobierania próbek. [1] Lema J.B. et al., Arch Bronconeumol., 2005, 41:584-586

9

Nowoczesne techniki badawcze w analizie farmaceutycznej i medycznej. Collegium Medicum UMK, Bydgoszcz, 10-12.09.2014

Urzą ądzenia do pobierania próbek EBC dostę ępne na rynku

schemat

EcoScreen

RTube

10 Nowoczesne techniki badawcze w analizie farmaceutycznej i medycznej. Collegium Medicum UMK, Bydgoszcz, 10-12.09.2014

Wykorzystanie wyników analizy próbek EBC w diagnostyce chorób ukł ładu oddechowego: • • • • • •

katar sienny, astma, przewlekła obturacyjna choroba płuc (COPD), mukowiscydoza, nowotwory płuc, obturacyjny zespół bezdechu śródsennego (OSA).

11 Nowoczesne techniki badawcze w analizie farmaceutycznej i medycznej. Collegium Medicum UMK, Bydgoszcz, 10-12.09.2014

BIOMARKERY Czynniki molekularne, genetyczne lub biochemiczne służące do precyzyjnej diagnostyki chorób oraz oceny prawdopodobieństwa wystąpienia danej choroby.

12 Nowoczesne techniki badawcze w analizie farmaceutycznej i medycznej. Collegium Medicum UMK, Bydgoszcz, 10-12.09.2014

pH Osoby zdrowe: pH EBC: 7.4-8.8 [1]. Spadek pH EBC zaobserwowano w przypadku występowania: - astmy [2], - COPD [3], - mukowiscydozy [4]. pH - marker stanów zapalnych dróg oddechowych [1] Paget-Brown A. et al. Chest. 2006; 129:426-30 [2] Kostikas K. et al. 2008; 38:557-65 [3] Kostikas K. et al. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2002;165:1364–70 [4] Tate S. et al. Thorax 2002; 57: 926–929

13

Nowoczesne techniki badawcze w analizie farmaceutycznej i medycznej. Collegium Medicum UMK, Bydgoszcz, 10-12.09.2014

Tlenek azotu (NO) i jego metabolity •

NO jest synetyzowany przez syntazę tlenku azotu (Nitric Oxide Synthase - NOS)



poziom NO wzrasta w obecności utleniaczy i prozapalnych cytokin



NO jest biomarkerem astmy, COPD, nowotworu płuc [1,2] RSNO L-arginina

NO

Snitrozotiole

H RS

S

-•

O2

NO

NNOO-/ONOOH

N 2O O2

Fe 2+

nadtlenoazotyn O2 NO3 • NO2NO3-

N 2O 4

N 2O 3

•NO

2

[1] American Thoracic Society Workshop Am J Respir Crit Care Med.,2006; 173: 811–813 [2] Alves Vento D., et al., Arch Bronconeumol. 2012;48:120-5

Nowoczesne techniki badawcze w analizie farmaceutycznej i medycznej. Collegium Medicum UMK, Bydgoszcz, 10-12.09.2014

14

NOx – azotany i azotyny • podwyższony poziom azotynów i azotanów zaobserwowano u pacjentów z objawami astmy [1] • podwyższony poziom NO2- zaobserwowano u pacjentów ze stwierdzoną chorobą ą COPD [2]

• podwyższony poziom zaobserwowano u pacjentów z objawami astmy oskrzelowej oraz COPD [2]

[1] Ratnawati. et al., Pediatr. Pulmonol. 2006;41:929–36 [2] Corradi M. et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2001;163:854–8

15

Nowoczesne techniki badawcze w analizie farmaceutycznej i medycznej. Collegium Medicum UMK, Bydgoszcz, 10-12.09.2014

3-nitrotyrozyna • powstaje w wyniku reakcji nadtlenoazotynu z tyrozyną • podwyższony poziom zaobserwowano u pacjentów z objawami astmy [1]

O

O 2N HO

OH NH2

[1] Hanazawa T. et al., Am J Respir Crit Care Med. 2000 Oct;162 (4 Pt 1):1273-6

Nowoczesne techniki badawcze w analizie farmaceutycznej i medycznej. Collegium Medicum UMK, Bydgoszcz, 10-12.09.2014

16

Eikozanoidy związki aktywne biologicznie, które powstają w procesie enzymatycznego przekształcenia kwasu arachidonowego i innych kwasów C20, posiadających wiązania podwójne OH



ArA

O

HO

OH

HO

O

O

HO

O

O O

HO

CH3

CH3

PGF2

OH

OH

OH

PG(G)H2

O(O)H

PGI2

OH

CH3

OH

OH

O

O

O

O OH

O

HO

HO

O CH3

O

HO

O

O

OH

CH3

HO

CH3

PGE2

PGD2

HO

CH3

OH

TXA2

TXB2

17

Nowoczesne techniki badawcze w analizie farmaceutycznej i medycznej. Collegium Medicum UMK, Bydgoszcz, 10-12.09.2014

Eikozanoidy Akronim

Peł łna nazwa

Prostaglandyna D2 (PGD2)

kwas 9α,15S-dihydroksy-11-okso-prosta-5Z,13E-dien-1-owy

Prostaglandyna E2 (PGE2)

kwas 9-okso-11α α,15S-dihydroksy-prosta-5Z,13E-dien-1-owy

Prostaglandyna F2 (PGF2)

kwas (Z)-7-[(1R,2R,3R,5S)-3,5-dihydroksy-2-[(E,3S)- 3-hydroksyokt-1enyl]cyklopentyl]hept-5-enowy

Prostaglandyna H2 (PGH2)

kwas 9α,11α-epidioksy-15S-hydroksy-prosta-5Z,13E-dien-1-owy

Prostaglandyna I2 (PGI2)

kwas 6,9α-epoksy-11α,15S-dihydroksy-prosta-5Z,13E-dien-1-owy

Tromboksan A2 (TXA2)

kwas (Z)-7-[(1S,2S,3R,5S)-3-[(E,3S)-3-hydroksyokt-1-enyl]-4, 6-dioksabicyklo[3.1.1]heptan-2-yl]hept-5-enowy

Tromboksan B2 (TXB2)

kwas 9α,11,15S-trihydroksytromba-5Z,13E-dien-1-owy

18 Nowoczesne techniki badawcze w analizie farmaceutycznej i medycznej. Collegium Medicum UMK, Bydgoszcz, 10-12.09.2014

Prostaglandyna E2 •

produkt enzymatycznego przekształcenia kwasu arachidonowego



podwyższony poziom zaobserwowano u palaczy papierosów cierpiących na astmę ę [1]



podwyższony poziom zaobserwowano również u pacjentów z COPD [2]



oznaczanie zawartości PGE2 stosowane w diagnostyce stanów zapalnych dróg oddechowych i w ocenie skuteczności nowych terapii COPD (np. inhibitory cyklooksygenazy) [3]

[1] Kostikas K. et al., Eur. Respir. J. 2003;22:743–7 [2] Montuschi P. et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2000;162:1175–7 [3] Montuschi P. et al., Thorax. 2005;60:827–33

19

Nowoczesne techniki badawcze w analizie farmaceutycznej i medycznej. Collegium Medicum UMK, Bydgoszcz, 10-12.09.2014

Leukotrieny •

metabolity kwasu arachidonowego



biorą udział w procesie powstawania reakcji alergicznej i podtrzymywaniu przewlekłego zapalenia w drogach oddechowych



leukotrieny zawierające w swojej cząsteczce cystynę, nazywane są leukotrienami cysteinylowymi Akronim

Peł łna nazwa

Leukotrien B4 (LTB4)

kwas 5S,12R-dihydroksy-6Z,8E,10E,14Zeikozatetraenowy

Leukotrien C4 (LTC4)

kwas 5S-hydroksy-6R-(S-glutationyl)7E,9E,11Z,14Z-eikozatetraenowy

Leukotrien D4 (LTD4)

kwas 5S-hydroksy-6R-(S-cysteinylglicynyl)7E,9E,11Z,14Z-eikozatetraenowy

Leukotrien E4 (LTE4)

kwas 5S-hydroksy-6R-(S-cysteinyl)-7E,9E,11Z,14Zeikozatetraenowy

Struktura chemiczna



podwyższony poziom leukotrienu B4 u pacjentów z objawami astmy oraz COPD [1, 2]



podwyższony poziom leukotrienów cysteinylowych u pacjentów cierpiących na katar sienny lub astmę [3, 4]

[1] Montuschi P. et al., J. Allergy Clin. Immunol. 2002;109:615–20 [2] Montuschi P. et al., Thorax. 2003;58:585–8 [3] Failla M. et al. Clin. Exp. Allergy. 2006;36:325–30 [4] Čáp P. et al., Thorax. 2004;59:465–70

Nowoczesne techniki badawcze w analizie farmaceutycznej i medycznej. Collegium Medicum UMK, Bydgoszcz, 10-12.09.2014

20

Izoprostany Powstają w trakcie procesu wolnorodnikowego, nieenzymatycznego utleniania wielonienasyconych kwasów tłuszczowych: • kwasu arachidonowego - ArA, • kwasu eikozapentaenowego - EPA oraz • kwasu dokozaheksaenowego - DHA) O

AA

OH CH3

O

OOH O

OOH

OH

O

OH

O

O

O

O

O

CH3

O

O

OH

OH CH3

O

O CH3

OH OOH

5-izoprostany

OOH

12-izoprostany O

HO

8-izoprostany

HO R

R

R

R

R

O

R

HO

1

HO

F2-isoP

E2-isoP

15-izoprostany

R

1

R

O

O

1

D2-isoP

R

R

O

R

1

J2-isoP

CH3

O R

H3C

1

IsoTxA2

R O 1

O

D2-isoK

R O

R

R

1

A2-isoP

1

O

E2-isoK

OH R

IsoTxB2 HO

O

R

1

21

Nowoczesne techniki badawcze w analizie farmaceutycznej i medycznej. Collegium Medicum UMK, Bydgoszcz, 10-12.09.2014

Izoprostany

OH

Najczęściej w badaniach nad oddziaływaniem

O

F2-izoprostanów wykorzystuje się 8-iso-PGF2α

HO

Podwyższony poziom w próbkach EBC od pacjentów z objawami:

HO

8-iso-PGF2α α HO

CH3

[1] Montuschi P. et al. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 1999;160:216–20 [2] Biernacki W. A. et al., Thorax. 2003;58:294–8 [3] Lucidi V. et al., Free Radical Bio. Med.2008, 45, 913–919 [4] Montuschi, P. et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med. 1998, 58, 1524–1527 [5] Psathakis K. et al., Chest 2004,125, 1005–1011. [6] Carpenter C.T. et al., Chest 1998, 114, 1653–1659. [7] Carpagnano G.E. et al., Chest 2002, 122, 1162–1167

-

astmy [1],

-

COPD [2],

-

mukowiscydozy [3],

-

choroby śródmiąż ąższowej pł łuc [4], ąż

-

obturacyjnego zespoł łu bezdechu sennego [5],

-

zespoł łu ostrej niewydolnoś ści oddechowej [6],

-

sarkoidozy [7].

biomarkery stresu oksydacyjnego dróg oddechowych

Nowoczesne techniki badawcze w analizie farmaceutycznej i medycznej. Collegium Medicum UMK, Bydgoszcz, 10-12.09.2014

22

F2 - izoprostany Akronim

Peł łna nazwa

8-iso-PGF2α

Kwas 9α,11α,15S-trihydroksy-(8β)-prosta-5Z,13Edien-1-owy

8-iso-15(R)-PGF2α

Kwas 9α,11α,15R-trihydroksy-(8β)-prosta-5Z,13Edien-1-owy

11β-PGF2α

Kwas 9α,11β,15S-trihydroxy-prosta-5Z,13E-dien-1owy

15(R)-PGF2α

Kwas 9α,11α,15R-trihydroksy-prosta-5Z,13E-dien-1owy 23

Nowoczesne techniki badawcze w analizie farmaceutycznej i medycznej. Collegium Medicum UMK, Bydgoszcz, 10-12.09.2014

EBC - astma pH Stabilna astma



Zaostrzona astma



Astma u palaczy papierosów Odpowiedź na terapię

NO i metabolity

prostanoidy

lukotrieny

8-isoP

↑ Nox ↑ Nitrotyrozyna ↑ S-nitrozotiole

↔ PGE2 ↑ TBX2

↑ Cys-LTs



↑ Cys-LTs





↓NOx

↑PGE2

↑LTB4

ICS ↓

ICS ↓ NOx ↓

ICS ↔ PGE2 Montelukast ↔ PGE2

Unikanie alergenów ↓Cys-LTs Steroidy donosowe ↓Cys-LTs Montelukast ↓LTE4 ICS ↓Cys-LTs

Grob N.M. Et al., J Breath Res. 2008 September; 2(3): 037004

ICS ↓ lub ↔

kortykosteroidy wziewne (Inhaled Corticosteroids - ICS) Montelukast - lek przeciwastmatyczny i przeciwalergiczny, należący do grupy leków przeciwleukotrienowych Nowoczesne techniki badawcze w analizie farmaceutycznej i medycznej. Collegium Medicum UMK, Bydgoszcz, 10-12.09.2014

24

Techniki analityczne stosowane w badaniach próbek EBC Skł ładnik EBC

Technika analityczna

Leukotrieny

ELISA, GC-MS

Białka

Metoda Bradforda Spektrofotometria fluorescencyjna ELISA Western Blot

Puryny (ATP, ADP, AMP, adenozyna)

HPLC

Mocznik

LC-MS

Malondialdehyd

Spektrofotometria fluorescencyjna

8-Izoprostany

ELISA LC-MS

3-nitrotyrozyna

ELISA HPLC LC-MS

NOx

Spektrofotometria fluorescencyjna

25 Nowoczesne techniki badawcze w analizie farmaceutycznej i medycznej. Collegium Medicum UMK, Bydgoszcz, 10-12.09.2014

Metody oznaczania biał łek •

Metoda Bradforda

Określenie zawartości białka w badanej próbce poprzez pomiar zmiany absorbancji (przy długości fali 595 nm), wywołanej przez związanie się białka z barwnikiem Coomasie Brillant Blue. •

ELISA (ang. enzyme-linked immunosorbent assay)

Wykrywanie określonych białek w badanej próbce z użyciem przeciwciał poliklonalnych lub monoklonalnych skoniugowanych z odpowiednim enzymem. •

Western Blot

Wykrywanie określonych białek w badanej próbce poprzez ich rozdzielenie na płytce z żelem poliakrylamidowym, przeniesienie na membranę (nitrocelulozową bądź z polifluorku winylidenu) i wybarwianie lub koniugację z przeciwciałami.

26 Nowoczesne techniki badawcze w analizie farmaceutycznej i medycznej. Collegium Medicum UMK, Bydgoszcz, 10-12.09.2014

Wykorzystanie techniki HPLC

27 Nowoczesne techniki badawcze w analizie farmaceutycznej i medycznej. Collegium Medicum UMK, Bydgoszcz, 10-12.09.2014

PROBLEMY

28 Nowoczesne techniki badawcze w analizie farmaceutycznej i medycznej. Collegium Medicum UMK, Bydgoszcz, 10-12.09.2014

Etapy badań ń • optymalizacja warunków jonizacji analitów • dobór optymalnego układu detekcyjnego • optymalizacja warunków przygotowania próbek EBC do analizy (przechowywanie, wzbogacanie analitów) • opracowanie procedur analitycznych oznaczania: - izoprostanów - aminokwasów w próbkach kondensatów wydychanego powietrza 29 Nowoczesne techniki badawcze w analizie farmaceutycznej i medycznej. Collegium Medicum UMK, Bydgoszcz, 10-12.09.2014

Oznaczanie izoprostanów w próbkach EBC z wykorzystaniem techniki LC-MS/MS O

O

OH

OH

HO

HO

CH3

CH3 HO

HO

OH

8-iso-PGF2α

OH

8-iso-15(R)-PGF2α

O

O

OH

OH

HO

HO

CH3 HO

Struktury oznaczanych prostanoidów o masie cząsteczkowej M=354,5

OH

11β-PGF2α

CH3 HO

OH

15(R)-PGF2α

Nowoczesne techniki badawcze w analizie farmaceutycznej i medycznej. Collegium Medicum UMK, Bydgoszcz, 10-12.09.2014

30

Optymalizacja warunków jonizacji Typ jonizacji

Izoprostany

3-nitrotyrozyna

Aminokwasy

APCI (+)

-

±

±

APCI (-)

±

-

-

ESI (+)

-

+

+

ESI (-)

+

-

±

Widmo mas 8-iso-15(R)-PGF2α

± słaba czułość + intensywny sygnał - brak sygnału

[M-H]-

Tryb pracy analizatora Q1: przemiatanie widma (SCAN)

31 Nowoczesne techniki badawcze w analizie farmaceutycznej i medycznej. Collegium Medicum UMK, Bydgoszcz, 10-12.09.2014

Dobór optymalnego ukł ładu detekcji Uzyskana rozdzielczość ść R(FWHM)*

Uzyskana dokł ładność ść (Δ Δppm)

Uzyskana czuł łość ść (S/N)

54,4

94 ppm

180

680

64 ppm

560000

10511

8,3 ppm

2000

*Rozdzielczość w połowie wysokości piku,R = Nowoczesne techniki badawcze w analizie farmaceutycznej i medycznej. Collegium Medicum UMK, Bydgoszcz, 10-12.09.2014

m ∆m

32

Dobór optymalnych parametrów pracy spektrometru mas [M-H-C9H17O2]-

O OH

HO

CH 3 HO

OH

[M-H]-

Widmo mas 15(R)-PGF2α łe w trybie monitorowania α powstał wybranej reakcji (SRM) w analizatorze Q3

33

Nowoczesne techniki badawcze w analizie farmaceutycznej i medycznej. Collegium Medicum UMK, Bydgoszcz, 10-12.09.2014

Wszystkie związki z grupy izoprostanów posiadają: - jony (pseudo)cząsteczkowe o wartości m/z: 353,5 - jony fragmentacyjne o wartości m/z: 193,5

Konieczność ść rozdzielenia chromatograficznego

34 Nowoczesne techniki badawcze w analizie farmaceutycznej i medycznej. Collegium Medicum UMK, Bydgoszcz, 10-12.09.2014

Wyniki – izoprostany w próbkach EBC Prób ka

Analit

Opis dawcy

Stęż ężenie ęż [pg/mL]

1

8-iso-15(R)-PGF2α 8-iso-PGF2α 11β-PGF2α 15(R)-PGF2α

M

26 35 27 21

2

8-iso-15(R)-PGF2α 8-iso-PGF2α 11β-PGF2α 15(R)-PGF2α

K

13 17 15 14

3

8-iso-15(R)-PGF2α

K

8,5

4

8-iso-15(R)-PGF2α

K

16

5

8-iso-15(R)-PGF2α

M

179

6

11β-PGF2α

K

13

7-50

8-iso-15(R)-PGF2α 8-iso-PGF2α 11β-PGF2α 15(R)-PGF2α

21- M 23 -K

Poniżej LOD

Izoprostany wykryto w próbkach EBC pochodzących od „zdrowych” studentów – palaczy tytoniu

35

Nowoczesne techniki badawcze w analizie farmaceutycznej i medycznej. Collegium Medicum UMK, Bydgoszcz, 10-12.09.2014

Optymalizacja etapu przygotowania próbek do analizy chromatograficznej



badanie procesu sorpcji analitów na powierzchni polipropylenu (naczynie do przechowywania próbek EBC)



badanie stabilności izoprostanów w próbkach roztworów wzorcowych i kondensatach wydychanego powietrza (w różnych warunkach przechowywania)



optymalizacja parametrów etapu wzbogacania i izolacji analitów obecnych w badanych próbkach



optymalizacja parametrów przygotowania próbki z wykorzystaniem liofilizacji jako techniki wzbogacania analitów

36 Nowoczesne techniki badawcze w analizie farmaceutycznej i medycznej. Collegium Medicum UMK, Bydgoszcz, 10-12.09.2014

Badanie procesu sorpcji analitów na powierzchni polipropylenu • określenie ewentualnych strat analitów wynikających z sorpcji analitów na ściankach naczyń polipropylenowych, do których były pobierane próbki kondensatów wydychanego powietrza

Schemat pobierania próbek oraz odzysk związków z grupy izoprostanów w trakcie badań procesu sorpcji analitów na powierzchni ścianki naczynia polipropylenowego

nie stwierdzono występowania zjawiska sorpcji analitów na ściankach naczyń, w których były przechowywane próbki do badań

37 Nowoczesne techniki badawcze w analizie farmaceutycznej i medycznej. Collegium Medicum UMK, Bydgoszcz, 10-12.09.2014

Badanie stabilnoś ści izoprostanów w próbkach roztworów wzorcowych i kondensatach wydychanego powietrza w róż żnych warunkach przechowywania •

kolejne operacje rozmraż żania próbek (zamiana z temperatury -80° °C na pokojową ą)

• roztwór wzorcowy zawierający izoprostany umieszczano w lodówce (-80°C) • po upływie 30 minut roztwór rozmrażano i próbkę poddawano analizie (trzy równoległe analizy) • roztwór ponownie umieszczano w lodówce. • badania powtarzano sześciokrotnie

Kolejne operacje rozmroż żenia nie powodują ą statystycznie istotnych strat analitów.

Odzysk analitów z grupy izoprostanów w trakcie badań stabilności podczas kolejnych operacji rozmrażania roztworu wzorcowego (od temperatury -80°C do temperatury pokojowej)

38 Nowoczesne techniki badawcze w analizie farmaceutycznej i medycznej. Collegium Medicum UMK, Bydgoszcz, 10-12.09.2014.

Wpł ływ temperatury i dostę ępu światł ła • nie stwierdzono istotnych zmian stężenia izoprostanów w próbkach roztworu wzorcowego (w ciągu 7 dni)

Warunki przechowywania roztworów wzorcowych związków z grupy izoprostanów w trakcie badań stabilności

warunki przechowywania próbek kondensatów wydychanego powietrza od momentu pobrania próbki nie mają istotnego wpływu na wyniki oznaczeń

39 Nowoczesne techniki badawcze w analizie farmaceutycznej i medycznej. Collegium Medicum UMK, Bydgoszcz, 10-12.09.2014

Wpł ływ temperatury i dostę ępu światł ła Badaniom poddawano próbki roztworów wzorcowych przechowywanych przez okres 8 tygodni w temperaturze -80°C, -20°C, +4°C i +20°C.



Czas [dni]

Odzysk (%) ±CV(%) n=4

Temperatura -80ºC

8-iso-15(R)PGF2α

8-iso-PGF2α

11β-PGF2α

15(R)-PGF2α

0

100 ± 5.8

100 ± 7.8

100 ± 8.9

100 ± 2.5

7

98 ± 6.3

100 ± 3.2

96 ± 1.7

100 ± 3.8

14

98 ± 2.9

96 ± 5.2

96 ± 3.0

99 ± 7.1

21

93 ± 5.3

99 ± 6.9

94 ± 5.4

102 ± 1.0

28

88 ± 3.2

89 ± 6.6

88 ± 2.7

90 ± 4.1

35

92 ± 6.2

98 ± 6.8

93 ± 8.9

96 ± 2.2

42

95 ± 6.0

95 ± 4.6

97 ± 2.9

91 ± 5.3

49

97 ± 2.7

97 ± 2.6

92 ± 8.1

97 ± 2.3

56

94 ± 4.0

93 ± 2.6

89 ± 1.5

92 ± 4.6

Nie stwierdzono istotnych zmian w poziomach zawartości analitów z grupy izoprostanów. Nowoczesne techniki badawcze w analizie farmaceutycznej i medycznej. Collegium Medicum UMK, Bydgoszcz, 10-12.09.2014

40

Optymalizacja warunków prowadzenia liofilizacji – techniki wzbogacania analitów Liofilizacja – technika wzbogacania analitów zarówno trwałych termicznie, jak i związków labilnych. Poprzez obniżenie temperatury oraz ciśnienia (poniżej 10 Pa) możliwa jest sublimacja rozpuszczalnika. Roztwór wzorcowy izoprostanów

Zamrażanie: - 80°C

Liofilizacja: temperatura: - 50°C, ciśnienie:0,027 mBar czas trwania: 24 godziny

Rozpuszczenie liofilizatu (w 250 μl fazy ruchomej)

Wpływ objętości próbki roztworu wzorcowego izoprostanów na odzysk analitów po zastosowaniu liofilizacji jako techniki wzbogacania próbki

Możliwe jest uzyskanie nawet 20-krotnego wzbogacenia analitu w próbce przygotowanej do analizy chromatograficznej.

Analiza LC-MS/MS

41

Nowoczesne techniki badawcze w analizie farmaceutycznej i medycznej. Collegium Medicum UMK, Bydgoszcz, 10-12.09.2014

Procedura oznaczania izoprostanów w próbkach EBC

42 Nowoczesne techniki badawcze w analizie farmaceutycznej i medycznej. Collegium Medicum UMK, Bydgoszcz, 10-12.09.2014

Próbki EBC – komora hiperbaryczna • Próbki pobierano od żołnierzy przechodzących terapię w komorach hiperbarycznych w Instytucie Medycyny Hiperbarycznej w Gdyni (Gdański Uniwersytet Medyczny). • Próbki EBC zbierano przed i po zakończeniu sesji leczniczej w komorze hiperbarycznej trwającej 30 minut.

43 Nowoczesne techniki badawcze w analizie farmaceutycznej i medycznej. Collegium Medicum UMK, Bydgoszcz, 10-12.09.2014

Oznaczanie izoprostanów w próbkach EBC cd.

Na podstawie wyników uzyskanych w trakcie analizy 50 próbek stwierdzono, że stężenie izoprostanu 8-iso-PGF2α w próbkach EBC zebranych od pacjentów po sesji w komorze hiperbarycznej wzrosło średnio 1,81 razy. Nowoczesne techniki badawcze w analizie farmaceutycznej i medycznej. Collegium Medicum UMK, Bydgoszcz, 10-12.09.2014

44

Oznaczanie 21 aminokwasów w próbkach EBC z wykorzystaniem techniki HPLC-MS/MS Większość oznaczanych aminokwasów charakteryzuje się różnymi wartościami liczbowymi m/z przejść jonów (pseudo)cząsteczkowego do fragmentacyjnego, które monitoruje się w trybie MRM pracy spektrometru mas.

brak koniecznoś ści derywatyzacji analitów

45 Nowoczesne techniki badawcze w analizie farmaceutycznej i medycznej. Collegium Medicum UMK, Bydgoszcz, 10-12.09.2014

Oznaczanie 21 aminokwasów w próbkach EBC z wykorzystaniem techniki HPLC-MS/MS Nazwa

[M+H]+

[M+H – CO2H2]+

Alanina (ALA)

90

44

Arginina

175

Asparagina (ASP)

133

Cysteina (CYS)

122

76

Fenyloalanina (FEN)

166

120

Glicyna (GLI)

76

30

[M+H NH3]+

[M+H – CO2H2 – NH3]+

Inne

70; 116; 130 116 105

59 149

59

Oznaczane aminokwasy – otrzymane jony (pseudo)cząsteczkowe i fragmentacyjne

46 Nowoczesne techniki badawcze w analizie farmaceutycznej i medycznej. Collegium Medicum UMK, Bydgoszcz, 10-12.09.2014

Oznaczanie aminokwasów w próbkach EBC Nr

FEN

TYR

ASP

[ng/mL] a

b

c

a

b

c

a

b

c

1

0,771

0,972

1,3

1,030

1,230

1,2

1,650

1,650

1,0

2

0,000

0,650

-