Diss. ETH N° 15365

Design of biomaterials using genetic engineering and polymer chemistry

A dissertation submitted to the Swiss Federal Institute ofTechnology, Zurich

for the degree of Doctor in Technical Science

Presented by

Simone Carlo Rizzi Dip!. Werkstoffing. ETH Born July 14, 1972 Citizen of Balerna

accepted on the recommendation of

Prof. Dr. Jeffrey A. Hubbell, examiner Prof. Dr. Alyssa Panitch, co-examiner Dr. Heike Hall, co-examiner

Zurich, 2003

Summary In the last 10 years synthetic materials in regenerative medicine have experienced a revolutionary shift towards a more intimate interaction with cells. Advances in cellular biochemistry as well as in molecular cell biology have dramatically influenced the design for development of new biomaterials. Understanding of biological signaling on a molecular level in combination with the possibility to artificially reproduce specific bioactive features of the natural cell environment, enabled engineering of materials able not only to influence cell behavior, but also to respond to cell-associated stimuli. Consequently, the criteria for the design of biomaterials have shifted form structural and mechanical to more bio-functional aspects, privileging/favoring therefore more biologically active cell-material interactions. This thesis focuses on the design of artificial protein polymers consisting of monomer units that carry combinations of specific biological features. In particular, cDNA monomer units, encoding amino acid sequences of native proteins, were genetically engineered and multimerized to encode protein polymers. Target peptides of native proteins include amino acid sequences that are involved in cell-adhesion to the extracellular matrix (ECM) or sensitive to proteolytic degradation. The later were designed to be susceptible to cell-associated matrix metalloproteinases (MMP) and plasmin; proteases implicated in wound healing and tissue regeneration. These artificial protein polymers were so designed that can be covalently cross-linked with poly(ethylene glycol) [PEG] and form bioactive and cell-responsive hybrid hydrogel networks. First, the design of protein polymers, representing the biological component of the hybrid hydrogels, was shown. Standard molecular biology and biochemical techniques were utilized to construct and process the cDNA encoding the target protein polymers as well as for their expression. Furthermore, a protocol, including purification and processing of expressed protein polymers was established to enable material formation upon mixing aqueous precursor solutions. Protein characterization by mass spectroscopy and amino acid analysis revealed the correct identity of target protein polymers. Hydrogel networks were formed under physiological conditions via Michael-type conjugate addition of thiols of amino acid cysteine with vinyl sulfone groups of endfunctionalized PEG. Cross-linking kinetics can be adjusted by the pH and concentration of precursor solutions. The elastic modulus and swelling ratio of hydrogels could be varied as a function of the stoichiometry of reacting groups and the precursor concentrations.

In vitro studies revealed that key features of the natural ECM, including cellular adhesion

and sensitivity to degradation, could be engineered in protein polymers and conferred to synthetic matrices. According to biochemical investigations of soluble protein polymers and hybrid hydrogels, three-dimensional cell migration was strongly dependent on proteolytic sensitivity of the matrices. Furthermore, mechanical properties of matrix significantly influenced the cell migration rate within these synthetic matrices. In an in vivo situation, these novel cell-responsive protein-PEG hydrogels were used as carriers of bone morphogenetic protein-2 (BMP-2) to guide healing of critical size bone defects in the rat cranium. Proteolytic sensitivity of the matrices in combination with the incorporation of BMP-2 was critical for remodeling and replacement of synthetic matrices with newly formed bone. Therefore, these studies emphasized the importance of the specific bi-directional transfer of biological stimuli between provisional matrices and regenerating tissue. Lack of stimulation through tissue specific growth factors (herein BMP-2), or the inability to respond to cell-mediated stimuli (sensitivity to degradation) led to the failure of matrix remodeling associated with bone formation. In conclusion, biological functions of these hybrid hydrogels could be engineered by genetically designing protein polymers. Recombinant DNA technology represents a versatile technique to develop large artificial proteins with well-defined composition and length. Therefore, the design of prototypic protein polymers described here, can be extended to a broad range of functional domains found in native proteins, including not only different biological recognition sites but also various structural domains.

Zusammenfassung In den letzten zehn Jahren vollzog sich in der Entwicklung synthetischer Materialien für die regenerative Medizin ein grundlegender Wandel. Bioinerte Werkstoffe wurden zu bioaktiven und schliesslich zu bioreaktiven Materialien weiterentwickelt, welche eine zunehmend engere und kontrollierbarere Interaktion mit dem umliegenden Gewebe eingehen. Ausschlaggebend für diese Fortschritte waren das Verständnis molekularbiologischer Vorgänge der natürlichen Geweberegeneration sowie die Identifizierung und synthetische Herstellung von Signal-Proteinsequenzen der extrazellulären Matrix welche maßgeblich an der Zell-Matrix Kommunikation beteiligt sind. Das Einbeziehen dieser Erkenntnisse in die Materialentwicklung ermöglichte es erstmals, Biomaterialien herzustellen, die nicht nur das Zellverhalten positiv beeinflussen, sondern letztlich befähigt sind, auf zelluläre Signale zu reagieren. In der vorliegenden Doktorarbeit wurden mit Hilfe gentechnologischer Methoden Protein-Polymere entwickelt, deren Monomereneinheiten aus natürlichen Peptidsequenzen bestehen, welche einerseits für die Zelladhäsion und anderseits für die Degradation durch zelluläre Enzyme verantwortlich sind. Letztere wurden so ausgewählt, dass sie als Degradationsubstrate für Matrix-Metalloproteinasen (MMPs) und Plasmin dienen; zwei Protease, die eine Schlüsselrolle in der Wundheilung und natürlichen Geweberegeneration spielen. Außerdem können diese Proteinpolymere kovalent mit linearen Poly(ethylenglycol) (PEG) Makromeren zu Hybrid-Hydrogelen vernetzt werden, die die biologischen Eigenschaften der Proteinpolymere übernehmen. Zuerst wurden Proteinpolymere hergestellt. Sowohl für die Konstruktion der cDNA Einheiten, die für die Proteinen kodieren, als auch für deren bakterielle Expression wurden Standardmethoden der Molekular- und Biochemie verwendet. Des Weiteren wurde ein Protokoll zur Reinigung und Weiterverarbeitung der produzierten Proteinpolymeren erstellt. Die Proteincharakterisierung durch Massenspektroskopie und Aminosäureanalyse bestätigte die korrekte Identität der Proteinpolymere. Mittels einer konjugierten Additionsreaktion können diese Hydrogelnetzwerke durch Zusammenmischen von zwei wässrigen Lösungen unter physiologischen Bedingungen hergestellt werden. Dabei werden die Thiole der Aminosäure Cystin an Vinylsulfongruppen von endfunktionalisiertem PEG addiert. Die Kinetik der Vernetzung kann entweder über den pH oder über die Konzentration der Ausgangslösungen

eingestellt werden. Die Elastizität und die Quellung der Hydrogele kann ebenfalls sehr kontrolliert durch das Verhältnis der Stöchiometrie der reaktiven Gruppen und der Konzentration der Ausgangslösungen variiert werden.

In vitro Studien zeigten, dass Schlüsselfunktionen von natürlichen extrazellulären Matrizen (ECM), wie beispielsweise Zelladhäsion und enzymatische Abbaubarkeit, durch Proteinpolymere imitiert werden und auf synthetische Matrizen übertragen werden können. Dabei hängt die Zell- Wanderung von Fibroblasten (Bindegewebszellen) innerhalb der Hydrogele sehr stark von ihrer enzymatischen Abbaubarkeit ab. Es konnte auch

gezeigt

werden,

dass

die

mechanischen

Eigenschaften

der

Gele

die

Zellinvasionsrate massgeblich beeinflussen. Abschliessend wurden die neu entwickelten Materialien in einer in viva Situation als Träger für einen knochenstimulierenden Wachstumfaktor (BMP-2) verwendet, um die Heilung von Knochendefekten an Rattenschädeln zu steuern. Die Kombination von enzymatischer Abbaubarkeit der Gele und der Freisetzung von BMP-2 erwies sich bei der Heilung als entscheidend. Innerhalb von lediglich 5 Wochen werden BMP-haltige enzymatisch abbaubare Implantate beinahe vollständig durch natürlichen Knochen ersetzt. Der Umbau der Matrix geht mit der Knochenbildung einher und wird verunmöglicht, wenn die Stimulation durch BMP-2 ausbleibt oder wenn die Matrix nicht auf die von Zellen ausgeschiedenen Proteasen reagieren kann. Die Ergebnisse dieser Studie verdeutlichen die Wichtigkeit von spezifischen biologischen Wechselwirkungen zwischen der künstlichen provisorischen Hydrogel-Matrix und den zellulären Bestandteilen des sich regenerierenden Gewebes für eine vollständige Heilung. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass neuartige biologische Funktionen in Hybridhydrogelen durch gentechnisches Design von Proteinpolymeren erreicht werden. Die rekombinante DNA- Technologie zeigt sich dabei als vielseitige Technik zur Entwicklung grosser synthetischer Proteine mit genau definierter Zusammensetzung und Länge. Das Design prototypischer Proteinpolymere, wie es hier beschrieben wurde, kann folglich auf eine Fülle funktionaler Domänen natürlich vorkommender Proteine ausgeweitet werden, welche nicht nur verschiedene biologische Erkennungssequenzen, sondern auch verschiedene strukturelle Domänen beinhalten.