García-Vázquez, F. A.; Matás, C. Bovino

Cultivo embrionario in vitro en la especie porcina (I) Francisco A. García-Vázquez y Carmen Matás Departamento de Fisiología, Facultad de Veterinaria, Universidad de Murcia E-mail: [email protected], [email protected]. www.um.es/grupo-fisiovet.

kIntroducción Actualmente la biotecnología reproductiva en las diferentes especies domésticas se encuentra en pleno apogeo, y dichas tecnologías requieren, en la mayoría de los casos, de la producción in vitro de embriones (PIV), en áreas como la transgénesis, recuperación de razas en peligro de extinción, células madre, en el tratamiento de la infertilidad humana…es decir que el progreso de las nuevas biotecnologías en parte está limitado o depende del desarrollo de la PIV embrionaria. Vajta et al. (2010) postularon que “… algunos de los logros conseguidos en esta década incluyen el uso militar de bombas de hidrógeno y atómicas, vuelos espaciales, submarinos nucleares, descifrar el código genético,…mientras que en la ciencia biológica la producción de blastocitos en una placa de Petri es todavía un sueño inalcanzable para la mayoría de los embriólogos…”.

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La PIV es un proceso que comprende la obtención y maduración in vitro (MIV) de los ovocitos, la capacitación in vitro de los espermatozoides, el cocultivo de ambos gametos o fecundación in vitro (FIV), y el cultivo in vitro de los embriones resultantes (CE) hasta alcanzar el estadio de blastocisto. Aunque se han hecho grandes progresos en el desarrollo de las técnicas de MIV, FIV y CE, aún son necesarias nuevas mejoras para maximizar la producción de embriones. En este trabajo pretendemos proporcionar una visión general, con especial hincapié en la especie porcina, del estado actual del cultivo embrionario in vitro incluyendo las condiciones (nivel de oxígeno, número de embriones…) y métodos de cultivo, composición de los medios, así como la dinámica de cultivo y sus alternativas. Para ello, en primer lugar, describiremos la cronología del desarrollo embrionario temprano hasta estadio de blastocisto y las condiciones fisiológicas que se encuentran los embriones a nivel del oviducto y del útero, así como las

diferencias fisiológicas entre el estadio de cigoto y blastocisto.

k Cronología y desarrollo embrionario temprano La fecundación tiene lugar en el oviducto, en la unión ampular-ístmica. La primera división se produce de 17 a 19 horas tras la ovulación (Hunter, 1974). Los embriones se mantienen en el estadio de 2 células únicamente de 6 a 8 horas; sin embargo el estadio de 4 células se prolonga durante 20-24 horas (Flint, 1981), por tanto la mayoría de los embriones entran en el útero en este estadio. El útero va a ser el compartimento en el que se desarrollarán los embriones porcinos desde el estadio de 4 células hasta el nacimiento. Cuando el embrión alcanza entre 8 y 16 células, alrededor del día 4, las blastomeras (células del embrión) comienzan a formar uniones estrechas adoptando una forma lobular denominada mórula.

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Tabla I. Diferencias en la fisiología de los embriones de mamíferos desde el etsadio de cigoto al de blastocito (Lane y Gradner, 2007).

Cuando la mórula está formada, las blastómeras empiezan a separarse en 2 poblaciones distintas: las células internas y las externas. Las células de la posición interna desarrollan uniones que por un lado permiten la comunicación intercelular y, por otro, van a mantener agrupado a este conjunto celular. Las células externas van a desarrollar uniones estrechas, que se producen para modificar las características de permeabilidad. Después de que se hayan formado las uniones estrechas, los fluidos empiezan a acumularse en el interior del embrión. Este acúmulo de fluido se debe a la acción de la bomba de sodio, la cual introduce iones al interior de la mórula; al aumentar la concentración de éstos, el agua difunde hacia el interior y comienza a formarse la cavidad o blastocele en la masa de células. Esta etapa, en la que el embrión aún se encuentra rodeado por la zona pelúcida (ZP), recibe el nombre de blastocisto y en él se diferencian según su posición dos poblaciones de células: una interna (masa celular interna) que dará origen al embrión propiamente dicho, y otra, la situada periféricamente, que origina el trofoectodermo o trofoblasto, que interviene en la ingestión selectiva de nutrientes y formará posteriormente la placenta (Hafez, 2000). Las células del trofoblasto tienen permeabilidad selectiva, lo cual favorece el transporte de agua y sodio que contribuye a la formación del blastocele (revisado por García-Roselló 2005); momento a partir del cual el embrión alcanza el estadio de blastocisto. El estadio de blastocisto se alcanza en el día 5-6 (Figura 1).

que causan la lisis de la ZP, pero podrían estar involucrados fenómenos mecánicos, enzimas embrionarias o factores uterinos. Tras la eclosión (blastocisto eclosionado), los blastocistos porcinos permanecen en la luz del útero hasta el día 13. Entre la eclosión y la implantación, el desarrollo embrionario es peor soportado por los sistemas in vitro que en estadios más tempranos. Por ejemplo, la elongación y expansión de los blastocistos eclosionados, al ser dependiente de factores uterinos, no tiene lugar in vitro. Por tanto, el desarrollo embrionario in vitro se da por concluido tras la eclosión del blastocisto.

kFisiología dinámica en el embrión pre-implantacional El embrión pre-implantacional es un periodo altamente dinámico durante el cual el embrión en estadio pronuclear se desarrolla desde una relativa quiescencia ovocitaria bajo el control genético materno hasta un grupo de células metabólica

y bioquímicamente activas bajo su propio control genético en el estadio de blastocisto (Lane y Gardner, 2007). Como resultado de estos cambios, existen diferentes demandas y requerimientos, para el desarrollo y diferenciación embrionarios, el cual requiere de una precisa regulación de la homeostasis, metabolismo y expresión génica. (Tabla 1).

k Diferencias fisiológicas en el oviducto y útero Diversos estudios en embriones de mamíferos han determinado que los cambios morfológicos que ocurren durante el desarrollo desde cigoto hasta estadio de blastocisto ocurren concomitantemente junto con cambios en el metabolismo del embrión. Los nutrientes disponibles en el tracto reproductivo de la hembra se encuentran en estrecha relación con el estadio de desarrollo embrionario (Tabla 2). Por ejemplo, en el estadio de precompac-

Figura 1. Blastocisto porcino de 6 días cultivado in Vitro, eclosionando.

El blastocisto sigue creciendo hasta el momento de la eclosión, donde la zona pelúcida (ZP) desempeña una importante función en la regulación osmótica (Bronson y McLaren, 1970), la contención de los blastómeros en el embrión (Modlinski, 1970) y la mejora de la supervivencia del ovocito y el embrión en el oviducto y en el útero (Dumont y Brummett, 1985). La rotura de la ZP en los embriones porcinos se produce en el día 6-7. No se conocen con exactitud los factores

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Tabla II. Diferencias fisiológicas entre el oviducto y el útero durante el desarrollo embrionario de los mamíferos (Lane y Gradner, 2007).

tación, es decir cuando el embrión reside en el oviducto, el fluido se caracteriza por una alta concentración de piruvato y de lactato, y una relativa baja concentración de glucosa. Por el contrario, el fluido uterino está caracterizado por unos relativamente bajos niveles de piruvato y lactato, y una alta concentración de glucosa.

Pero el mantenimiento de bajos niveles de oxígeno en un incubador grande es costoso ya que hay que usar grandes niveles de N2 que desplacen el oxígeno. Por ello, se han diseñado alternativas como el uso de mini-incubadores (Karja et al. 2004), que también han sido exitosamente usados en FIV y en clonación.

el desarrollo a blastocisto, así como el número de células de los blastocistos en varias especies (murina, humana, bovina y ovina) (revisado por Martínez, 2002). Según Stokes et al. (2005), los embriones porcinos deben cultivarse en grupos 10-20 embriones/20 μl de medio. Otros autores en cambio han obtenido bue-

Figura 2. Componentes de un sistema de cultivo embrionario.

kCultivo embrionario in vitro Como hemos mencionado anteriormente el CE in vitro comprende la fase desde que tiene lugar la fecundación hasta el estadio de blastocisto. Para realizar este cultivo existen diferentes alternativas tanto en el sistema de cultivo utilizado (mezcla de gases, aceite mineral, número de embriones…), o en la composición del medio, así como la dinámica de cultivo (sistema estático o dinámico, tranquilidad o estrés, simple o secuencial…) (Figura 2). A continuación vamos a desglosar cada uno de estos apartados.

Co-cultivo tejidos/suplementos

Sistema cultivo

Gases

Medio cultivo

Aceite

- Agua - Iones - Carbohidratos - Aminoácidos - Vitaminas - Quelantes - Antioxidantes - Antibioticos - Proteínas/macromoléculas - Hormonas/factores crecimiento - Buffer

Sistema de cultivo embrionario

Sistema Cultivo (WOW; tubos...)

Números embriones y volumen medio

Tranquilidad-estrés

Tal y como hemos descrito en el apartado anterior las condiciones de cultivo in vitro difieren de las situaciones in vivo en muchos aspectos, y uno de estos pasos críticos es la tensión de oxígeno (Karja et al. 2004). Está claro que la concentración de oxígeno en el oviducto y en el útero es más baja que en la atmósfera. El nivel de oxígeno utilizado en cultivo normalmente ha sido del 20%, pero es conocido que estos niveles de oxígeno son perjudiciales en el cultivo embrionario in vitro debido probablemente a la formación de radicales libres de oxígeno que puede dar lugar a la necrosis o apoptosis celular. Macháty et al. (2001) han observado un incremento en el desarrollo a blastocisto y en el número de células al cultivar mórulas MIV/FIV bajo tensión reducida (5%) de O2.

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Renovación medio

Dinámica cultivo

Otro aspecto a tener en cuenta en el CE in vitro es el número de embriones y el volumen de medio de cultivo. Los embriones en el útero se encuentran entre los pliegues del mismo rodeado por un pequeño volumen de medio. En el útero se han observado cantidades únicamente de 1.5-2.0 nl rodeando al embrión (y en el oviducto probablemente cantidades de picolitros). Teniendo en cuenta este hecho, se han publicado diversos trabajos donde el cultivo de embriones se realizó en volúmenes reducidos de medio y/o en grupos incrementando significativamente

Simple secuencial

nos resultados utilizando 40-50 embriones/500 μl de medio (Matás et al. 2003). No obstante, lo que si parece estar claro es que bajo las condiciones actuales, si lo embriones se cultivan individualmente sufren un arresto y no avanzan a estadio blastocisto. Según han descrito diversos autores el efecto beneficioso del cultivo en grupo y/o en pequeño volumen de medio es la producción de factores autocrinos y/o paracrinos por parte del embrión en cultivo (Paria y Dey, 1990; O’Neill, 1998), esti-

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mulando su propio desarrollo y el de los embriones vecinos. Según esto, el cultivo en volúmenes grandes daría lugar a la dilución de los factores beneficiosos producidos por el embrión, de tal modo que la concentración presente en el medio de cultivo no sería suficiente para ejercer dicho efecto (Gardner, 1994). El desarrollo embrionario también se encuentra influenciado por la distancia a la cual se encuentren los embriones entre si al ser cultivados. Recientemente, Stokes et al. (2005) publicaron un estudio donde cultivaban los embriones porcinos con una distancia determinada entre ellos. En este estudio los embriones no se movían ya que la placa de petri estaba cubierta con extractos de proteína polifenólicas. Concluyeron que la distancia óptima de cultivo entre embriones se encontraba entre 60 y 180 μm. En los embriones cultivados en distancias más cortas posiblemente dichos efectos beneficiosos se neutralicen debido a concentraciones altas y localizadas de metabolitos tóxicos como el amonio. Y con distancias superiores a 180 μm los factores beneficiosos quedan diluidos.

• La higiene en el laboratorio es también importante en la producción embrionaria (Schiewe, 1998). La producción de embriones in vitro debe tener lugar en un ambiente limpio. Comer y beber está totalmente prohibido, las manos deben lavarse periódicamente con agua y jabón, y enjuagarse con alcohol (por ejemplo, etanol), pero teniendo en cuenta que los vapores del alcohol pueden perjudicar el desarrollo embrionario.

Métodos de cultivo embrionario Históricamente el cultivo embrionario se ha realizado en placas de cultivo (de 4 pocillos, placas de 20 mm de diámetro…), en diferentes condiciones de volumen de medio y densidad embrionaria, como ya hemos mencionado anteriormente. Pero

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lizando volúmenes de 400 μl de medio. Beneficios similares también han sido demostrados en otras especies como la especie porcina, humana y murina (Taka et al. 2005; Vajta et al. 2008). • Tubos Recientemente, Roh et al. (2008), cultivaron embriones de ratón en microtubos normalmente usados en PCR. Como ya hemos descrito anteriormente, el aceite que se usa en cultivos embrionarios puede ser perjudicial, con este sistema se pretende reducir o eliminar por completo el contacto entre el aceite y el medio de cultivo. Además, otra de las ventajas de usar estos microtubos es que los embriones van a estar unos más cerca de otros que en una placa o microgota; y aunque según otros estudios, tienen que tener cierta separación

Además de lo descrito anteriormente debemos tener en cuenta otros factores que pueden influir en el desarrollo embrionario in vitro. A continuación detallamos algunos de ellos: • La mayoría de las placas de cultivo que se utilizan son esterilizadas mediante óxido de etileno, compuesto que puede tener un efecto adverso en el desarrollo embrionario (Schiewe et al. 1985; Holyoak et al. 1996). Sin embargo, añadiendo quelantes al medio de cultivo, como el EDTA, se pueden reducir estos efectos adversos. • Benzotiazoles tóxicos procedentes del émbolo de jeringuillas (utilizadas para el filtrado y esterilización del medio) también podría influir negativamente en el desarrollo embrionario (Vanroose et al. 2001). • También debemos tener en cuenta que los embriones desarrollados in vivo no están en ningún momento expuestos a la luz ultravioleta o luz visible, pero si en condiciones in vitro, por lo que en la medida de los posible deberíamos reducir dicha exposición, para evitar efectos adversos sobre los embriones. • El aceite mineral se usa para evitar que el medio se evapore, ya que si esto ocurre cambia la osmolaridad del medio con el consiguiente perjuicio en el desarrollo embrionario. También evita cambios de temperatura y pH cuando se están manipulando. Sin embargo, diversos factores lipofílicos pueden pasar al medio y ser tóxicos para el embrión.

desde el punto de vista fisiológico estos sistemas no son ideales, ya que en condiciones in vivo, los embriones se encuentran rodeados de un volumen muy pequeño de medio. Por esta razón, se están desarrollando nuevos métodos de cultivo intentando mimetizar, en la medida de lo posible, las condiciones in vivo para optimizar el desarrollo embrionario. A continuación vamos a describir algunos de ellos. • Micropocillos En el año 2000 Vajta et al. desarrollaron un novedoso y sencillo sistema de desarrollo embrionario in vitro basado en el cultivo de los embriones en micropocillos, reduciendo de esta manera el volumen de medio que rodea a los embriones, debido a la importancia que tiene como ya hemos mencionado anteriormente. Este trabajo fue realizado en la especie bovina obteniendo resultados de más de un 60% de desarrollo hasta estadio de blastocisto en comparación con los sistemas tradicionales de cultivo embrionario en placas de 4 pocillos uti-

entre embriones, puede ser que en los tubos la eliminación de los productos tóxicos sea más rápida y haya un mejor aprovechamiento de los nutrientes y de los factores auto- y para-crinos (Roh et al. 2008). Otro factor a tener en cuenta en este estudio es la diferencia de toxicidad entre los dos tipos de plástico utilizados en la placa (poliestireno) y en el tubo (polipropileno), pudiendo influir en el CE. Los resultados obtenidos demostraron un mayor desarrollo en blastocistos comparados con el cultivo en microgotas (Roh et al. 2008). En la especie porcina todavía no se ha realizado ningún estudio utilizando este sistema de microtubos. • Capilares de vidrio Otro sistema de cultivo que se está implementando es el uso microcapilares. Ya en 1965 Mulnard describió el cultivo de embriones de ratón en un microcapilar con un diámetro interno de 1-2 mm, que fue cultivado horizontalmente en placas de petri cubiertas de aceite. Este

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sistema se quedó en el olvido hasta el año 2003, donde Thouas et al. cultivaron embriones de ratón en microcapilares de vidrio (también denominados oviductos de vidrio), cultivados verticalmente en

imitara, en la medida de lo posible, las condiciones ambientales a las que está sometido el embrión in vivo. De esta manera vamos a promover una actividad metabólica normal y un desarrollo máximo del

de ósmosis reversa. En estos equipos, el grado de pureza del agua puede ser controlado mediante la determinación de su resistencia al paso de la corriente eléctrica (cuanto mayor sea ésta, mayor será su

Figura 3. Esquema de los movimientos del embrión in vivo en el aparato reproductor femenino y sistema de microcanales in vitro del cultivo embrionario (Kim et al. 2009).

IN VIVO

Aceite mineral

Embrión

Entrada

Reserva aceite

Área constricción

Lámina cristal

Medio

Dirección movimiento embrión

1 μl de medio, obteniendo blastocistos con un mayor número de células en comparación con el cultivo en microgotas. Hasta el momento este sistema no ha sido desarrollado en la especie porcina, aunque podría proporcionar una buena herramienta y alternativa a los métodos tradicionales. • Microfluidos y microcanales Otra alternativa para el desarrollo embrionario es el uso de microfluidos en microcanales donde se sitúan los embriones. El éxito inicial del uso de microcanales en el cultivo embrionario en ratones (Raty et al. 2001) ha dado lugar al cultivo de embriones de otras especies incluida el cerdo. Walters et al. (2003) cultivaron embriones de 4 células hasta el estadio de blastocisto en microcanales dando lugar finalmente a la producción de lechones vivos. Kim et al. (2009), desarrollaron un novedoso sistema de microfluidos basado en la estimulación mecánica derivada de la peristalsis. Para investigar los efectos de la estimulación mecánica en el desarrollo embrionario en canales de microfluidos, los embriones de bovino fueron cultivados en canales rectos en comparación con canales con aéreas de estrechez. Además se acopló un maquina agitadora para crear un flujo por gravedad. Este trabajo representa un intento de mimetizar la constricción peristáltica que ocurre in vivo en el útero (Figura 3). Composición medios CE El diseño del medio de cultivo óptimo debería ser, en principio, aquél que

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embrión in vitro. En términos generales, un medio de cultivo embrionario debe de estar compuesto por agua, sales inorgánicas, compuestos energéticos, proteínas, aminoácidos, quelantes, hormonas del crecimiento o vitaminas, antibióticos, etc. Una vez preparados, los medios de cultivo se esterilizan por filtración, haciéndolos pasar a través de una membrana con un diámetro de poro de 0’22 μm. Debemos de tener en cuenta que algunos de los componentes se pueden degradar espontáneamente por lo que se adicionan inmediatamente antes de su utilización. En cualquier medio de cultivo hay que tener presente la osmolaridad que necesitan las células a cultivar y el mantenimiento del pH. En cuanto a la osmolaridad, se ha determinado que los valores observados en las secreciones uterinas oscilan entre los 280 ± 20 mOsm/Kg. Sin embargo, existen evidencias que indican que valores de alrededor de 245 mOsm/Kg favorecen el desarrollo embrionario (Duque y col 2003). En lo referente al pH, la mayoría de los embriones de mamíferos cultivados in vitro se desarrollan en pH neutro o ligeramente alcalino, encontrándose los mejores resultados entre 7,2 y 7,6. • Agua: El componente que participa en mayor proporción en la formulación de cualquier medio de cultivo es el agua, por ello su grado de pureza está fuertemente relacionado con el desarrollo embrionario (Marquant-Leguienne y Humblot 1998). El agua que se utiliza para la elaboración de los medios de cultivo debe ser ultrapura y libre de pirógenos. Los sistemas de purificación del agua utilizan el principio

Embriones

pureza). La mayor resistencia ofrecida es 18,3 megaohms-cm a 25°C. • Sales inorgánicas: Normalmente la composición de sales inorgánicas de un medio de cultivo pretende imitar los componentes analizados in vivo. Se ha determinado que el fluido oviductal bovino y ovino se caracteriza por tener por bajos niveles de Na+ y altos niveles de K+ si se comparan con los niveles plasmáticos, por ello, estos dos elementos son cuidadosamente balanceados al formular los medios de cultivo. Entre otros elementos inorgánicos importantes en la composición de los medios encontramos: magnesio, calcio, bicarbonato, sulfatos y fosfatos. Son muchas las funciones de estas sales, a modo de ejemplo podemos citar el papel del cloruro sódico que participa en la regulación osmótica o el calcio y el potasio que son esenciales para un desarrollo embrionario adecuado (Palasz, 1996). No obstante, en cualquier medio de cultivo embrionario hay dos elementos constantes: una fuente energética y una fuente proteica. • Fuente energética: La glucosa es el principal substrato energético que consumen las células; sin embargo para embriones de porcino parece ser perjudicial en los primeros estadios de desarrollo preimplantacional (Bavister, 1995). Durante esta etapa del desarrollo se presenta una falta de utilización de glucosa debido a la falta de actividad de la enzima fosfofructoquinasa cuya función es acelerar la glucólisis catalizando la formación de fructosa 1-6 bifosfato a partir de fructosa 6 fosfato, lo que se encuentra

Cultivo embrionario in vitro en la especie porcina (I)

controlada alostéricamente por el cociente ATP-ADP, siendo particularmente alto en este período (Gardner, 1998). Además, la presencia de glucosa puede inhibir la fosforilación oxidativa cuando en este estadio los embriones dependen de esta vía para generar energía (Thompson, 2000). El piruvato y el lactato son las principales fuentes de energía en el embrión temprano durante el desarrollo in vitro (Pinyopummintr y Bavister, 1996). Sin embargo, tras la compactación (estadio 8-16 células) el embrión utiliza la glucosa como fuente energética y es metabolizada principalmente a lactato (Sinclair et al. 2003). La explicación a este hecho se basa en que en el embrión en este estadio y en respuesta a una alta demanda de energía necesaria para la compactación y la formación y expansión del blastocele (Gardner, 1998), el cociente ATP-ADP podría disminuir, y con ello, la inhibición ejercida sobre la enzima mencionada, con lo cual aumentaría el consumo de glucosa. Este metabolito también participa en la síntesis de precursores de ácidos nucleicos y de lípidos (Gardner y Lane, 1998) y su disponibilidad sería importante durante la eclosión fuera de la zona pelúcida (Menezo y Khatchadourian, 1990). Por esta razón, aunque se ha logrado cultivar embriones hasta el estado de blastocisto en medios sin glucosa, éstos son de menor calidad y viabilidad cuando se comparan con los cultivados en medios con glucosa. Por tanto la propuesta de Kikuchi (2004) en cuanto a la utilización de un cultivo secuencial, piruvato y lactato como sustratos energéticos durante las primeras 72 h de cultivo y glucosa a partir de ese momento, sería una opción de mejora. Con respecto a los lípidos, poco se sabe acerca de la importancia que tendrían en la producción de energía durante el desarrollo embrionario temprano (Thompson, 2000), aunque podría tener cierto papel en relación al grado de fluidez de la membrana plasmática (Imai et al. 1997; Hochi et al. 1999). • Fuente proteica: Aminoácidos Se ha determinado que tanto el fluido oviductal como el uterino contienen altos niveles de aminoácidos libres. Por otro lado, los ovocitos y embriones poseen transportes específicos de aminoácidos para mantener un pool endógeno. Hasta el estadio de 8 células, aquellos aminoácidos presentes en niveles altos en el fluido oviductal (aminoácidos no esenciales y glutamina) incrementan la división celular y viabilidad. Tras la compactación, los aminoácidos no esenciales y la glutamina favorecen la formación del blastocele y los aminoácidos esenciales son requeridos para el desarrollo y viabilidad de la masa celular interna. Estudios sobre cultivo de embriones han demostrado que la

inclusión de aminoácidos en el medio de cultivo aumenta el desarrollo embrionario y aumenta la viabilidad del blastocisto. Además, estos elementos son utilizados como fuente de energía, como buffer intracelular (Edwars et al. 1998) y para la síntesis de proteínas. Su incorporación a las células se ve facilitada por transportadores de membrana específicos los cuales están regulados en función del grado de desarrollo o en respuesta a señales externas (Van Winkle, 2001). Otras funciones propuestas son reguladores de presión osmótica, de pH, precursores biosintéticos, antioxidantes, quelantes… (Gardner, 2008).

Macromoléculas Varios son los sustratos que se han utilizado como fuente de proteínas en los medios de cultivo embrionario entre los que destacan el suero fetal bovino (SFB) y la albúmina sérica bovina (BSA) (Wang et al. 1997). El suero constituye la fracción líquida resultante del proceso de coagulación sanguínea y su composición presenta pequeñas variaciones dependiendo del animal. Una molécula que siempre encontramos en el suero es la albúmina. Esta proteína tiene carácter ácido, es soluble en agua y tiene un peso molecular aproximado de 69.000 kDa. La albúmina además de ser uno de los componentes más importantes del suero sanguíneo también es la proteína más abundante en el fluido oviductal (Leese, 1988). Algunos de los efectos benéficos que justifican la utilización del suero y la albúmina son (revisado por Mucci et al. 2006): i Proteger a los embriones en cultivo de sustancias tóxicas (ej. metales pesados). i Aportar factores de crecimiento y ciertas hormonas. i Reducir la tensión superficial del medio (lo que evita que los embriones se adhieran al instrumental como placas de cultivo, pipetas, tubos, etc.). Tanto el suero como la BSA tienen un papel similar como suplemento proteico. Sin embargo, la posible presencia de elementos no identificados formando parte de su composición determinan que algunos aspectos de su función aún no sean completamente conocidos (Mucci et al. 2006). En los últimos años, el suero ha sido objeto de numerosos estudios para determinar si su adición es definitivamente necesaria para mejorar los resultados de producción in vitro, en función de la cantidad y calidad de los embriones obtenidos. Los resultados de estos trabajos son muy variables e incluso contradictorios y el motivo podría encontrarse en la diferente composición del suero, ya que éste depende del estado

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fisiológico en que se encuentre el animal del cual proceda (Palasz, 1996). Por otro lado, también habría que determinar en que momento del cultivo embrionario se debería suplementar el medio. Se ha determinado que la adición de suero inhibe los primeros estadios de desarrollo aunque estimula el desarrollo de mórulas y blastocistos (Pinyopummintr y Bavister, 1994; Thompson et al. 1998), acelera el desarrollo embrionario (Gómez y Diez, 2000; Holm et al. 2002) incrementa el número de células embrionarias (Fouladi-Nashta et al. 2005) y favorece la eclosión (Wang et al. 1997; Gómez y Diez, 2000). Con el fin de evitar la variabilidad debida a la diferente composición de estas dos sustancias, suero y BSA, se ha estudiado el uso de polímeros sintéticos como sustitutos de ellas en la producción de embriones in vitro. Entre los polímeros más estudiados se encuentra el alcohol polivinílico y la polivinilpirrolidona (Ectors et al. 1992; Gardner y Lane, 1998). Estos compuestos han demostrado proveer una buena actividad surfactante y previenen la adhesión entre gametos o con las superficies de contacto. No obstante, algunos autores han encontrado una menor tasa de producción de embriones así como diferencias metabólicas importantes entre embriones cultivados con o sin estos componentes (Thompson, 2000; Orsi y Leese, 2004). • Otros componentes: Otros componentes que se utilizan para suplementar el medio de cultivo son factores de crecimiento y hormonas como la insulina que ayudan al transporte de glucosa al blastocisto (Gardner y Kaye, 1991), o agentes quelantes como el EDTA que mejora el desarrollo en los primeros estadios del embrión (revisado por Lane y Gardner, 2007). En porcino se han utilizado gran cantidad de medios de cultivo para el desarrollo embrionario in vitro desde el estadio de cigoto hasta el de blastocisto. Entre ellos destacan el medio Whitten (Beckmann y Day, 1993), NCSU 23 (Petters y Wells, 1993), Bavister (Polard et al. 1995), BECM-3 (Dobrinsky et al. 1996) o PZM 5 (Yoshioka et al. 2008). De todos ellos, tal vez el más utilizado por los buenos resultados obtenidos, ha sido el NCSU 23. Yoshioka et al., (2002) realizó un estudio sobre medios basado en la composición del fluido oviductal porcino en el que no suplementaba con glucosa y lo comparó con el NCSU23. Aunque los resultados obtenidos fueron similares en cuanto a calidad embrionaria, lo novedoso de este medio fue que estaba químicamente definido, lo cual permite la reproducibilidad de las experiencias al eliminar los preparados proteicos de los protocolos.

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