s

0

CONTAMINANTES EMERGENTES

Diciembre 2015

Indices

1. 2. 3. 4.

Resumen ejecutivo .................................................................................................................. 1 Antecedentes ............................................................................................................................ 1 Objetivos.................................................................................................................................... 2 Metodología de análisis y diagnostico .................................................................................. 2 4.1 Selección de los contaminantes .................................................................................................................2 4.2 Análisis de los contaminantes .....................................................................................................................7

5. Análisis y evaluación de los resultados ................................................................................ 8 5.1

Presentación teórica................................................................................................................................8

5.2

Trabajo de Laboratorio ......................................................................................................................... 10

5.2.1 . Análisis HPLC/MS/MS ..................................................................................................................... 10 5.2.2 Procedimiento de extracción en fase sólida (SPE) para agua desionizada .............................. 13 5.2.3 Procedimiento de extracción en fase sólida (SPE) para agua subterránea ............................ 14 5.2.4 Instrumentos y Condiciones de Funcionamiento de LC/MS y LC/MS/MS .............................. 14

6. Implementación de Métodos Analíticos para la medición de Contaminantes Emergentes 16 6.1

Medición de Glifosato........................................................................................................................... 16

6.2

Medición de Atrazina ............................................................................................................................ 24

7. Resumen, conclusión y recomendaciones ....................................................................... 27 6.1 Recomendaciones para el trabajo habitual de laboratorio .................................................................. 27

7. Referencias ................................................................................................................................ 28

Lista de Figuras Figura 1: Diagrama de flujo de SPE (agua desionizada) ............................................................. 7 Figura 2: Diagrama de flujo general para el desarrollo de una HPLC-MS ................................... 8 Figura 3: Programa para diagrama de flujo – detection de carbamazepina 10,11-epóxido ....... 11 Figura 4: (a) el cromatograma LC/MS/MS de Carbamazepina 10,11-epóxido (0.0001 µg/ml), (b) curva de calibración del LC/MS/MS .................................................................................................... 12 Figura 5: Estructura molecular del sorbente SPE “strata-X” ...................................................... 13 Figura 6: Esquemática de un sistema de SPE .......................................................................... 13 Figura 7: Imagen del sistema de SPE en el laboratorio............................................................. 13 Figura 8: Diagrama de flujo de SPE (agua subterránea) ........................................................... 14

Lista de Tablas Tabla 1: Lista de contaminantes prioritarios para el año 2015: Propiedades fisicoquímicas y toxicidad ................................................................................................................................................... 4 Tabla 2: Lista de contaminantes prioritarios para el año 2015: Origen y comportamiento y cinética en el ambiente ..................................................................................................................................... 5 Tabla 3: Ibuprofeno y carbamazepina – estructura y propiedades ............................................ 10

Lista de Imágenes Imagen 1: Sesión teórica ............................................................................................................ 9

1. Resumen ejecutivo Este reporte describe los métodos y resultados pertenecientes al proyecto Contaminantes Emergentes en Matrices Ambientales (específicamente: Métodos Analíticos para Contaminantes Emergentes). El objetivo principal del proyecto ha sido transferir por parte de La Universidad de Tel Aviv herramientas analíticas para el establecimiento de métodos analíticos en el Laboratorio Nacional de Referencia de la Conagua para la detección y cuantificación de contaminantes emergentes en matrices ambientales, a través de científicos del Water Research Center de la Universidad de Tel Aviv. El proyecto incluyó el desarrollo y refinamiento de cinco Procedimientos Operativos Estandarizados que tienen como fin detectar y cuantificar contaminantes emergentes en matrices ambientales. Estos POEs se describen en detalle en un documento separado. Adicionalmente, el proyecto constó de un taller que se llevó a cabo en el Laboratorio Nacional de Referencia de la Gerencia de Calidad del Agua (Conagua, Mexico), durante la semana del 28 de septiembre al 2 de octubre de 2015, sobre el tema de Contaminantes Emergentes (específicamente: Métodos Analíticos para Contaminantes Emergentes), el cual se describe detalladamente a continuación. El taller fue impartido por el Dr. Igal Gozlan, Jefe de la Unidad de Química Analítica del Centro de Investigación del Agua (Water Research Center de la Universidad de Tel Aviv), e incluyó dos días de curso teórico y tres días de práctica en el laboratorio.El objetivo del taller es ofrecer el conocimiento y herramientas prácticas necesarias para el desarrollo de métodos analíticos para la detección de contaminantes emergentes en el medio ambiente. El taller contó con 28 participantes de la Conagua y otros institutos en México, todos quienes trabajan en el campo de la calidad del agua. El informe presenta una descripción detallada del taller, incluyendo fotos y diagramas, así como los resultados y conclusiones del análisis realizado durante las sesiones de laboratorio. 2. Antecedentes En años recientes, la presencia de una amplia gama de materiales bioactivos en los ambientes naturales y humanos ha estado bajo la lupa a nivel mundial, después de algunos cuestionamientos surgidos con respecto a la amenaza que representan para la salud del medio ambiente y del ser humano. Estos "contaminantes emergentes" son compuestos sintéticos o naturales e incluyen productos farmacéuticos, hormonas, compuestos disruptores endócrinos (EDC del inglés Endocrine Disrupting Compounds), toxinas derivadas de algas, compuestos organometálicos, plaguicidas y una amplia variedad de subproductos del proceso de desinfección del agua. Sus concentraciones típicas en el medio ambiente son bajas, lo cual hace que los efectos tóxicos agudos sean poco frecuentes. No obstante, su presencia continua implica un riesgo ambiental con efectos tóxicos crónicos debido a la exposición prolongada y a la potencial bioacumulación. 1

Para muchos de estos materiales no existen normas o lineamientos de salud pública o información toxicológica suficiente (o la que hay es insuficiente o para toxicidad limitada), y es común que no se les monitoree en el medio ambiente. Algunos de estos compuestos se han depositado en el medio ambiente desde hace tiempo y otros han sido el resultado de la síntesis de nuevos productos químicos y de las prácticas de desecho de productos químicos existentes. Por ello, la detección de estos contaminantes es el primer paso para entender su destino final y su impacto tanto en el medio ambiente como en la salud humana. Esta tarea es por demás difícil, dada la baja concentración de estos compuestos y a la complejidad de la matriz hídrica (por ejemplo, efluentes de aguas residuales). Sin duda, muchas organizaciones gubernamentales, instituciones académicas y líderes de la investigación a nivel mundial hacen un gran esfuerzo para llevar a cabo estudios e investigación para el desarrollo de métodos analíticos para la detección de estos contaminantes.

3. Objetivos El principal objetivo de este proyecto es dotar a CONAGUA del conocimiento y métodos analíticos para la detección de contaminantes emergentes seleccionados en diferentes matrices ambientales. Los métodos y el conocimiento desarrollados se usarán en México para llevar a cabo un estudio a nivel nacional. Transferencia por parte de la Universidad de Tel Aviv de herramientas analíticas para el establecimiento de métodos analíticos en el Laboratorio Nacional de Referencia de Conagua para la detección y la cuantificación de contaminantes emergentes en matrices ambientales.

4. Metodología de análisis y diagnostico 4.1 Selección de los contaminantes Un problema clave en el control de contaminantes emergentes en el medio ambiente es el gran número de contaminantes posibles, lo que hace que la monitorización frecuente de cada compuesto sea poco práctica y costosa; Por lo tanto, la selección de los contaminantes prioritarios es esencial. La selección se basa generalmente en el potencial de impacto ambiental de cada contaminante y en la simplicidad relativa del método de detección. Para el presente proyecto se han seleccionado 15 contaminantes de diferentes clases, en función de varios criterios clave (Tablas 1 A y B): (i) Ocurrencia en el medio ambiente, (ii) Toxicidad potencial y (iii) Los métodos de detección. Ocurrencia en el medio ambiente La aparición de contaminantes emergentes en el medio ambiente se puede dividir en hechos reales de detección (el número de encuestas en las que se detectó el compuesto) y la presencia potencial, los cuales se derivan del patrón de uso del compuesto y de sus propiedades quimiofísicas. Por ejemplo, se espera que los productos farmacéuticos altamente prescritos, con baja absorción corporal, baja biodegradabilidad y alta movilidad del suelo se produzcan en aguas subterráneas en una concentración relativamente alta. Un buen ejemplo es sulfametoxazol, que es uno de los antibióticos más populares, cargado negativamente a pH ambiental (pKa 5.7, Tabla 1a), por lo tanto con baja adsorción al suelo y biosólidos, y con detección frecuente en aguas 2

subterráneas. La tetraciclina por otro lado se carga neutramente en el medio ambiente, altamente adsorbida al suelo (Kd = 3102-312447 L / kg, Tabla 1a) y por lo tanto rara vez se detecta en el agua subterránea.

Toxicidad potencial El riesgo general de los seres humanos asociados con la exposición crónica a la mayoría de los contaminantes emergentes no es clara, así como los impactos ecológicos de los contaminantes. Sin embargo, su toxicidad potencial todavía puede clasificarse utilizando diferentes pruebas (por ejemplo, toxicidad para los organismos acuáticos, Tabla 1a ). Los métodos de detección El método y el instrumento más comúnmente empleado para la detección de contaminantes emergentes es cromatógrafo líquido de alta presión junto con detección de masas (HPLC-MS). Este aparato por lo general requiere la pre-concentración de la muestra ambiental usando extracción en fase sólida (SPE), para encontrar el límite de detección del método. La separación de los compuestos en la HPLC se lleva a cabo típicamente usando columnas de fase reversa, que retiene los compuestos hidrófobos, por lo tanto, el método analítico es más eficiente para compuestos hidrófobos. Un parámetro fundamental en la determinación de la hidrofobicidad de un compuesto es su coeficiente de partición octanol-agua (KOW). KOW mayor significa mayor hidrofobicidad, lo que implica más tiempo de retención en la columna de HPLC y una mejor separación.

3

Tabla 1: Lista de contaminantes prioritarios para el año 2015: Propiedades fisicoquímicas y toxicidad Contaminant e

Clase

Propiedades fisicoquímicas Fórmula molecular C10H11N3O3S

pKa

log Kow

Antibióticos

MW (g/mol) 253.3

1.8, 5.7c

−0.1- 2.5 h

444.4

C22H24N2O8

Amoxicilina

365.1

C16H19N3O5S

3.32, 7.78, 9.58d 2.4, 6.9, 9.6

−1.3 0.05h ND

Ampicilina

349.1

C16H19N3O4S

2.4, 6.9

ND

Trimetoprima

290.3

C14H18N4O3

6.9

0.9i

Claritromicina

747.5

C38H70NO13

8.2

3.16j

Eritromicina

53337

C37H68NO13

8.2

3.06o

Sulfametoxaz ol Tetraciclina

Toxicidad crónica para los organismos acuáticos Especies Exposición a “long-term”g (mg/l) Synechococcu 0.0059 s leopolensis Lemna gibba 0.23 (EC10) Hydra vulgaris

>0.01 ND

Lemna gibba

j

>1.0 (EC10) ND

Lemna gibba

>1.0 (EC10)

Atenolol

266.3

C14H22N2O3

9.6

0.16

Hydra vulgaris

>0.01

Metoprolol

4.532

C15H25NO3

9.7

1.95k

Desmodesmus subspicatus

7.3 (EC50)

Antihistamínico

255.4

C17H21NO

8.9

3.4

ND

Antidepresivos

277.4

C17H27NO2

9.4

2.91l

ND

256.1

C9H7Cl2N5

5.7

0.99

ND

Difenhidramin a Venlafaxina Lamotrigina Carbamazepi na Estrona (E1)

m

Antiepiléptico

236.3

C15H12N2O

13.9

2.25

Compuestos disruptores endocrinos (EDCs)

270.4

C18H22O2

10.77a

2.95n

a

n

Synechococcu s leopolensis

17.0 ND

17 beta272.4 C18H24O2 10.71 3.86 Oryzias latipes 10 ng/l estradiol (E2) a Lewis and Archer, 1979; bTernes et al., 2002; cFeitosa-Felizzola and Chiron, 2009; dTrenholm et al. 2006; eDrillia et al. 2005; f.Tolls 2001; g Crane et al., 2006; hAvisar et al. 2009; iThiele-Bruhn et al. 2004; jhttp://www.drugbank.ca.; kCaron et al. 1999; lChemspider database; m Jones et al.(2002; nMachatha et al., 2005; oMcFarland et al., 1997

4

Tabla 2: Lista de contaminantes prioritarios para el año 2015: Origen y comportamiento y cinética en el ambiente Contaminante Origen Comportamiento y cinética en el ambiente

Sulfametoxazol Tetraciclina Amoxicilina Ampicilina Trimetoprima Claritromicina

Excreciones humanas Humanas y animales Excreciones animales Excreciones animales Excreciones humanas Excreciones humanas

Agua ('half-life') ND

Método Analítico

Sedimentos (Kd, L/kg) 0.085a Clay, pH 7 3102-312447 Soil, pH 3.8–7.5c ND

Biosólidos (Kd, L/kg) 260b Activated sludge 22 600d Activated sludge ND

IV

ND

ND

III

T1/2>42dk

ND

76e

I

T1/2=40dk

ND

300–400f Activated sludge

I, V

T1/2=329hi T1/2=17331hj at pH=7 ND

Eritromicina Atenolol

I

III

Humanas y ND ND No data V m g h animales Excreciones 3 1.13-3.1 2 Activated sludge I humanas Metoprolol Excreciones 4.1-8.7 m 1.17-11.9 g ND I humanas Difenhidramina Excreciones >1000daysl ND ND I humanas p Venlafaxina Excreciones ND ND 200-1500 Treated I humanas biosolid Lamotrigina Excreciones 100-112o ND ND I humanas Carbamazepina Excreciones 100 daysn 0.82-4.76r 20.4–67.6q Digested I humanas Sterile soil sludge p 85-330 Treated Estrona (E1) Humanas y 2-3 daysm 0.89-255s ND II, IV biosolid animales m t 17 beta-estradiol Humanas y 0.2-9 days 16.0–29.6 (soil at pH ND II, IV (E2) animales 7.2-7.6 Kd - soil-water distribution coefficient; ND – not determined a Primor et al., 2011; bJoss et al., 2005; cSassman and Lee 2005; dChenxi et al., 2008; eHalling-Sorensen et al., 2002; fChenxi et al., 2008; g Ramil et al. 2010; hPomiès et al., 2015; iSah H. 2006; jErah P.O. et al 1997; kVione D. et al 2009; lWalters E et al 2010; mYing G.et al 5

2002; nKujawa-Roeleveld et al 2008; oYoung et al 2014; pLajeunesse et al., 2012; qCarballa et al. 2008; rMichael Revitt et al. 2015; s Roberts et al. 2014; tStumpe and Marschner 2007

6

4.2 Análisis de los contaminantes Para detectar los compuestos presentes en concentraciones ambientales, es necesario aplicar el paso de la extracción en fase sólida (SPE), que concentra la muestra y elimina las impurezas. La naturaleza y el tipo de cartuchos SPE dependen del compuesto analizado, y se describen con más detalles en los Procedimientos de Operación Estandarizados. Un procedimiento general para el desarrollo de un método SPE se muestra en la Figura 1. Los cartuchos SPE se activan típicamente con un disolvente orgánico fuerte (por ejemplo metanol), después enjuagados con agua para obtener las condiciones de trabajo. El método se desarrolló gradualmente (usando agua desionizada), con mayor volumen de muestra en cada paso (a partir de 10 ml hasta 500 ml, según las necesidades). Después de SPE, las muestras concentradas se llevaron al instrumento HPLCMS para la detección, utilizando un método desarrollado previamente como se describe a continuación. Activación con 10 ml MeOH, y después 10 ml agua desionizada

Carga de muestra: Experimento 1: Muestra de 10 ml (seis muestras; tres de ellas cargadas con estándar) Experimento 2: Muestra de 100 ml (seis muestras; tres de ellas cargadas con estándar)

Lavado con 10 ml de agua desionizada

 

Media de la muestra es agua desionizada Experimento 2, 100 ml se lleva a cabo carga de la muestra después de recuperación elevada (>80%) con carga de muestra de 10 ml

Dejar secar completamente

Elución con10 ml MeOH

Dejar secar completamente

Evaporación con vapor de nitrógeno a 40oC

Dejar secar completamente

Reconstitución con 1.0 ml of 5% MeOH en agua DI

Uso de vórtex

Inyección a LCMS Figura 1: Diagrama de flujo de SPE (agua desionizada) Se requiere un desarrollo de un método de HPLC-MS para cada compuesto analizado o mezcla de compuestos. Un procedimiento general para el desarrollo del método se ilustra en la Figura 2.

7

Programa PASO 1: Preparación teórica a. Búsqueda en la biblioteca (únicamente mencionada) b. Caracterización de propiedades de las moléculas analizadas (tabla 1)

Paso 2: Desarrollo del método LC/MS para el compuesto elegido: a. Elección de la columna HPLC b. Método cromatógrafico – gradiente de elución y el volumen de inyección de muestra c. Método de espectrometría de masas – sintonización y elección del rango de masas de trabajo

Paso 3: Determinación del rango lineal y de LOQ, LOD con distintas concentraciones patrón en técnica LC/MS

Paso 4: Determinación de rango lineal y LOQ, LOD con distintas concentraciones de patrón (cuando menos preparación de 7) en técnica de LC/MS/MS (MRM) (comparando sensibilidad a técnica LC/MS)



Peso molecular monoisotópico de pKa, logP, logD...



Elución de gradiente de gradiente drástico a moderado





Selección de cuando menos 7 concentraciones, de 0.0001 a 1



Verificación de linealidad LOQ, LOD



Selección de cuando menos 8 concentraciones, de 0.0001 a 0.1



Verificación de linealidad LOQ, LOD

Paso 7: Resultados, conclusiones y resumen Figura 2: Diagrama de flujo general para el desarrollo de una HPLC-MS 5. Análisis y evaluación de los resultados Esta sección describe las sesiones teóricas y prácticas del taller que tuvo lugar en la Conagua durante la semana del 28 de septiembre al 2 de octubre de 2015, sobre el tema de Contaminantes Emergentes, y los resultados obtenidos durante el. El taller fue impartido por el Dr. Igal Gozlan de la Universidad de Tel Aviv, e incluyó dos días de lecturas frontales seguidos de tres días de trabajo de laboratorio. 5.1 Presentación teórica 8

Durante los dos primeros días del taller el Dr. Gozlan proporcionó información teórica sobre diversos temas relacionados con el análisis y detección de contaminantes emergentes, incluyendo:  Contaminantes Emergentes, cinética química y Comportamiento en el ambiente (Agua, Sedimentos Y biosólidos)

 Introducción a la Cromatografía de Líquidos de Alta Presión (HPLC del inglés High Pressure Liquid Chromatography)  Instrumentos Analíticos Para La HPLC  Columnas (Tipos de Columnas, Cromatografía por adsorción Fase inversa, fase directa, etc.)  Preparación de Muestras (Disolución y Filtración - Descripción EJEMPLOS Y, Disolución y centrifugado, Extracción Líquido-Líquido -LLE, Extracción de fase Sólida -SPE etc.)  Espectrómetro de masas (Tipos de analizadores (MS): Sector magnético, cuadrupolo, tiempo de vuelo (TOF), Trampa de Iones (ITD), MS / MS, etc.)  Validación (Proceso de Validación, precisión y exactitud, especificidad, LOD (Límite de deteccion) y LC (Límite de cuantificación), linealidad y Rango, etc.) Todo el material educativo, incluyendo presentaciones y documentos pertinentes, se proporcionaron a la Conagua en informes anteriores. Imagen 1: Sesión teórica

9

5.2 Trabajo de Laboratorio El objetivo del trabajo de laboratorio era demostrar paso a paso el desarrollo de un método de análisis para la detección de contaminantes emergentes, incluyendo todas las consideraciones e hipótesis pertinentes. Para cumplir con este propósito, se seleccionaron dos contaminantes representativos: Ibuprofeno y carbamazepina 10,11-epóxido (tabla 3).

Tabla 3: Ibuprofeno y carbamazepina – estructura y propiedades Nombre molecular

CAS No.

Fórmula molecular

CH3 O

Ibuprofeno

15687-27-1

C13H18O2

CH3 OH H3C

O

Carbamazepine 10,11-epoxide

NH2 N

36507-30-9

Propiedades moleculares

Estructura molecular

C15H12N2O2 O

       

logP=3.72 logD(pH=2.5)=3.72 pKa=4.4 peso monoisotópico =206.13 logP=1.26 logD(pH=2.5)=1.26 pKa=14 peso monoisotópico =252.09

5.2.1 . Análisis HPLC/MS/MS En la primera etapa, se establecieron las condiciones cromatográficas de HPLC para los compuestos: C-18 columna, ACN y H2O ácido (ácido fórmico al 0,1%) y el volumen de inyección A continuación, se seleccionaron los parámetros de MS basándose en la estructura y las características de los compuestos: modo de ionización positivo y el rango de trabajo de 100 a 500 a.m.u. Desafortunadamente, la LC seleccionada / MS condiciones no eran compatibles para el análisis de ibuprofeno, ya que la molécula apenas puede ser ionizada positivamente, y por lo tanto no puede ser detectada por la MS. Mejores condiciones LC / MS para el análisis de ibuprofeno son el modo negativo MS y HPLC fase móvil de pH alto (se recomienda el uso de acetato de amonio 25 mM). Esto no pudo ser examinado durante el trabajo de laboratorio debido al límite de tiempo. Análisis de carbamazepina 10,11-epóxido se llevó a cabo como se describe en los diagramas de flujo generales (Figuras 1 y 2). El diagrama de flujo específico para Carbamazepina 10,11-epóxido se ilustra en la Figura 3, demostrando todas las medidas adoptadas para la afinación, detección, y el método cromatográfico de LC/MS y LC/MS/MS. Las curvas de calibración se presentan en las Figuras 4a y 4b. La técnica LC/MS/MS (MRM) LC resultó ser un método más sensible que el LC/MS por 100 tiempos cuanto menos, con LOQ mejor que 0.0001μg / ml (s/n = 141). El intervalo lineal LC/MS/MS se 10

obtuvo entre las concentraciones de 0.0001 a 1,0 µg/ml (0.1-1000 µg/L) con correlación de R2> 0.99. Paso 1: Parámetro de ajuste MS para patrón de resepina ([MH]+=609.3) Paso 2: Ajuste del parámetro MS para “carbamazepina 10,11-epóxido” patrón ([MH]+=253.1)

Paso 3: Desarrollo de método cromatográfico en columna C-18 - elución de gradiente 0.1 µg/ml patrón (disuelto en 50% AcN: 50% H2O).

Paso 4: Preparación del patrón en agua desionizada (0.1 µg/ml ) y corrida de cromatogramas con volumen creciente de inyección de hasta 100 µl

Paso 5: Determinación del rango lineal y de LOQ, LOD con distintas concentraciones patrón en técnica LC/MS (volumen de inyección = 100 µl)



Selección de cuando menos 6 concentraciones, de 0.0001 a 1.0



Verificación de linealidad y LOQ, LOD



Selección de cuando menos 8 concentraciones, de 0.0001 a 1.0

Paso 6: Ajuste del parámetro MS para “carbamazepina 10,11-epóxido” patrón ([MH]+=236.1) m/z=253.1->210.1 )

Paso 7: Determinación del rango lineal y de LOQ, LOD con distintas concentraciones patrón en técnica LC/MS/MS (volumen de inyección = 100 µl)



Verificación de linealidad y LOQ, LOD Figura 3: Programa para diagrama de flujo – detection de carbamazepina 10,11-epóxido

11

(a)

(b)

Figura 4: (a) el cromatograma LC/MS/MS de Carbamazepina 10,11-epóxido (0.0001 µg/ml), (b) curva de calibración del LC/MS/MS 12

5.2.2 Procedimiento de extracción en fase sólida (SPE) para agua desionizada El método de extracción en fase sólida método (SPE) fue desarrollado para la carbamazepina 10,11-epóxido, con el objetivo de "limpiar" y concentrar la muestra, mientras que se obtenía la alta recuperación. El sorbente SPE utilizado fue estrato - X, 200 mg/6 ml (véase figura 5). Este es un sorbente de fase inversa con un grupo polar adicional (2-piperidona). Tiene relativamente alta selectividad para los compuestos medio- y no-lipófilos. CH3 n O N CH3

Figura 5: Estructura molecular del sorbente SPE “strata-X” En el primer paso, el método SPE fue desarrollado usando agua desionizada, para evitar interferencias de la matriz de agua. El volumen de muestras incrementó gradualmente de 10 ml a 100 ml. Se agregaron los estándares a tres de las seis muestras, con 1 ml de 0.1 µg/ml (un total de 12 muestras). El experimento con la muestra de 100 ml se llevó a cabo solamente una vez fue obtenida una alta recuperación (> 80%) para el experimento con la muestra de 10 ml. Las recuperaciones de SPE obtenidos fueron: Muestras de 10 ml: Recuperación = 100.5%, RSD (%) = 5.3 (tres preparaciones) Muestras de 100 ml: Recuperación = 92.6%, RSD (%) = 8.3 (tres prep araciones)

Figura 6: Esquemática de un sistema de SPE

Figura 7: Imagen del sistema de SPE en el laboratorio 13

5.2.3 Procedimiento de extracción en fase sólida (SPE) para agua subterránea El procedimiento de SPE de agua subterránea ocurrió como en la sección anterior, con la diferencia de que la muestra fue de 100 ml (véase figura 8). A dos de las cuatro muestras de 100 ml de agua subterránea de les agregaron los estándares con 1 ml de 0.1 mg/ml de estándar. La recuperación del procedimiento de SPE fue: 100 ml de muestra: recuperación = 100.0% (primera repetición) 100 ml de muestra: recuperación = 103.6% (segunda repetición) Activado con 10 ml de MeOH, después con 10 ml de agua desionizada

Cargado de muestras: Experimento 1: 100 ml de muestra (cuatro muestras: dos cargadas, dos sin cargar)

El medio de muestra es agua subterránea

Lavado con 10 ml de agua desionizada

Dejar secar completamente

Elución con 10 ml de MeOH

Dejar secar completamente

Evaporación con flujo de nitrógeno a 40oC

Dejar secar completamente

Reconstitución con 1.0 ml de 5% MeOH en agua desionizada

Dejar secar completamente

Inyección al LCMS (volume de inyeccion: Figura 8: Diagrama de flujo de SPE (agua subterránea)

5.2.4 Instrumentos y Condiciones de Funcionamiento de LC/MS y LC/MS/MS Las condiciones utilizadas para el análisis LC/MS y LCMS/MS de la carbamazepina 10,11-epóxido se describen a continuación. Condiciones LC:  LC: Sistema Agilent 1200 con muestreador automático termostático, bomba binaria y desgasificador 14

   

Columna C18 analítica, Phenomenex, Luna, C-18, 150 x 3.0 mm, tamaño de partícula de 3.0 µm. Flujo: 0.5 ml/min Volumen de inyección: 100 l Eluentes LC: Solvente A: agua con ácido fórmico al 0.1% (pH=2.5), Solvente B: acetonitrilo

 Gradiente LC Tiempo (min) 0 5 6 10

%A

%B

70 20 70 70

30 80 30 30

Espectrómetro de masas (MS):  MS: Espectrómetro de masas de cuadrupolo triple, AB Sciex, modelo QTRAP 4500  Fuente: Electrospray (ESI) operando en modo iónico positivo  Rango MS: 100-500  Voltaje capilar: 5500 V  Presión de nebulización: 35 psig  Gas de secado: 30 L/min  Temperatura del gas: 500oC  Cortina Antigás: 20 L/min  Potencial de entrada: 5V  Gas de desagrupado: 40

MS/MS (MRM)  Fuente: Electrospray (ESI) operando en modo iónico positivo  Rango MS: m/z=253 ->236, m/z=253 ->210  Voltaje capilar: 5500 V  Presión de nebulización: 20 psig  Gas de secado: 25 L/min  Temperatura del gas: 100oC  Cortina Antigás: 20 L/min  Potencial de entrada: 5  Gas de desagrupado (DP) 40  Gas de colisión medio  Energía de colisión 17 Concentraciones de curva de calibración Preparación de curva de calibración para LC/MS ->

Preparación de curva de calibración para LC/MS/MS 25 mg/10ml = 2.5 mg/ml, dilución X1000 to 2.5 g/ml -> 15

1.0, 0.1, 0.05, 0.001, 0.0005, 0.0001, 0.00005, 0.00001

g/ml (Figure 4b)

6. Implementación de Métodos Analíticos para la medición de Contaminantes Emergentes 6.1 Medición de Glifosato Se realizó una búsqueda bibliográfica de las características y propiedades fisicoquímicas del glifosato, así como los métodos de referencia para su análisis. Glifosato N-(fosfonometil) glicina Fórmula molecular C3H8NO5P pKa’s= 0,78, 2,29, 5,96 y 10,98 Masa molecular: 390 uma Se encontró una serie de artículos y publicaciones sobre métodos de análisis de glifosato, del cual se tomó de referencia al método descrito en Methods of Analysis by the U.S. Geological Survey Organic Geochemistry Research Group—Determination of Glyphosate, Aminomethylphosphonic Acid, and Glufosinate in Water Using Online Solid-Phase Extraction and High-Performance Liquid Chromatography/Mass Spectrometry-2002; el cual utiliza un sistema de extracción en fase sólida (SPE) para la extracción y concentración de los compuestos, y la cromatografía líquida combinada con espectrometría de masas en serie (LC -MS/MS) para la detección y cuantificación. Se preparó una disolución patrón de 10 mg/L de glifosato y posteriormente una disolución intermedia de 100 µg/L en 10 mL de agua destilada libre de orgánicos a pH 9, la cual se derivatiza con una disolución de FMOC 2 mM en un baño de agua a 40°C durante 24 horas en la oscuridad. La reacción de derivatización se detiene y estabiliza con ácido fosfórico al 2%. En el primer paso de la implementación del método se establecieron los parámetros del espectrómetro de masas en donde se optimizó el compuesto a partir de la disolución de glifosato derivatizada para obtener las mejores condiciones de ionización y fragmentación en modo Ion Producto y MRM. Posteriormente se optimizó el compuesto para la obtención de las condiciones para el cromatógrafo de líquidos. Espectrómetro de masas (MS) y MS/MS (MRM)  Scan Type: MRM (MRM)  Scheduled MRM: No  Polarity: Negative  Scan Mode: N/A  Ion Source: Turbo Spray  Resolution Q1: Unit  Resolution Q3: Unit  Intensity Thres.: 0.00 cps 16

   

Settling Time: 5000.0000 msec MR Pause: MCA: Step Size:

Q1 Mass (Da) (Da) 390.000 17.00 Q1 Mass (Da) (Da) 390.000 30.00         

CUR: IS: TEM: GS1: GS2: CAD: DP EP CXP

Q3 Mass Dwell(msec) ID 168.000 -17.00 Q3 Mass Dwell(msec) ID 150.000 -30.00

5.0070 msec No 0.00 Da

Param

Start

Stop

250.00 CE Glyphosate Derv M1

-

Param

Stop

Start

250.00 CE Glyphosate Deriv M3

30.00 -4500.00 450.00 50.00 70.00 High -14.00 -8.00 -8.00

Condiciones LC:  Shimadzu LC system Equlibration time = 0.00 min  Shimadzu LC system Injection Volume = 10.00 ul Pumps  Pump A Model: LC-20AD  Pump B Model: LC-20AD  Pumping Mode: Binary Flow  Total Flow: 0.4000 mL/min  Pump B Conc: 5.0 %  B Curve: 0  Pressure Range (Pump A/B): 0 - 6000 psi Autosampler  Model: SIL-20AC/HT  Use Autosampler: Yes  Rinsing Volume: 200 uL  Needle Stroke: 52 mm.  Rinsing Speed: 35 uL/sec 17

-

    

Sampling Speed: Purge Time: Rinse Dip Time: Rinse Mode: Cooler Enabled:

15.0 uL/sec 25.0 min 35 sec Before and after aspiration Yes

 Cooler Temperature:  Control Vial Needle Stroke: Oven  Model:  Temperature Control:  Temperature:  Max. Temperature: System Controller  Model:  Power:  Gradiente Time Module 0.01 Pumps 2.30 Pumps 2.80 Pumps 3.00 Pumps 5.00 Pumps 5.00 System Controller

8 deg. C 52 mm CTO-20AC Enabled 30 deg. C 85 deg. C CBM-20A On

Events Parameter Pump B Conc. 2 Pump B Conc. 98 Pump B Conc. 98 Pump B Conc. 2 Pump B Conc. 2 Stop

Para la preparación de la curva de calibración, se preparó una disolución intermedia de 100 µg/L y se derivatiza con FMOC Paso 1: Preparación 10 mL Estándar de 100 µg/L

Paso 2: 500 µL de Borato de Sodio 5 %



Agitar con vórtex

Paso 3: 1500µL de FMOC 2 mM



Mezclar por inversión 3 veces

Paso 4: Derivatización: 40°C, 24 horas, oscuridad

18

 

Paso 5: 600 µL Ácido fosfórico 2%

Mezclar por inversión 3 veces Oscuridad

Paso 6: Extracción en Fase Sólida Figura 9: Diagrama de flujo – Derivatización de Glifosato

Se extrae 5 mL de muestra derivatizada, usando la técnica de extracción en fase sólida y el extracto resultante se diluye para obtener una disolución de 1 µg/L, de la cual se prepara la curva de calibración en un intervalo de 0.01 a 1 µg/L. Cabe mencionar que no se llevó a cabo la concentración de la muestra debido a que se trata de la disolución estándar a partir de la cual se prepara la curva de calibración, las muestras deben pasar por todo el proceso de evaporación y reconstitución.

Activado con 10 ml de MeOH, después con 10 ml de agua desionizada

Cargado de muestras: 5 mL de muestra

Lavado con 10 ml de agua desionizada

Dejar secar completamente

Elución con 10 ml de MeOH

Dejar secar completamente

Evaporación con flujo de nitrógeno a 40oC

Dejar secar completamente

Reconstitución con 1.0 ml de Fase Móvil A pH=9

Dejar secar completamente

Inyección al LCMS Figura 10: Diagrama de flujo de SPE para Glifosato Se analizó la curva de calibración para las dos transiciones del glifosato, obteniendo un coeficiente de correlación de 0.999 y un LC de 0.01 µg/L. 19

Figura 11: Resultados de Curva de Calibración Glifosato

20

Figura 11: Resultados de Curva de Calibración Glifosato (Continuación)

21

22

Figura 12: Curva de Calibración para Glifosato (2 transiciones) 23

6.2 Medición de Atrazina Se realizó una búsqueda bibliográfica de las características y propiedades fisicoquímicas de la atrazina, así como los métodos de referencia para su análisis. Atrazina 2-cloro-4--6--s-triazina Fórmula: C8H14ClN5 Masa molar: 215,68 g/mol pKa = 1.68

Se tomó como método de referencia al EPA METHOD 536-2007. Determination of triazine pesticides and their degradates in drinking water by liquid chromatography electrospray ionization tandem mass spectrometry (LC/ESI-MS/MS). Se preparó una disolución patron de 10 mg/L de atrazina en methanol 100% y posteriormente dos disoluciones intermedias de 1 mg/L y 1 µg/L. En el primer paso de la implementación del método se establecieron los parámetros del espectrómetro de masas en donde se optimizó el compuesto para obtener las mejores condiciones de ionización y fragmentación en modo Ion Producto y MRM. Espectrómetro de masas (MS) y MS/MS (MRM)  Fuente ESI  Polaridad positiva  Parámetros de Fuente/Gas  CUR: 25.00 psi  CAD: Medium  IS: 3500.00 V  TEM: 600.00 °C  GS1: 65.00 psi  GS2: 65.00 psi  DP 30.00  EP 8.50  CE 24.00  CXP 10.00 Compuesto Atrazine

TR (min) 3.4

Q1 Masa 216

Q3 Masa 174.0

En el segundo paso, se llevó a cabo la optimización del compuesto para establecer las condiciones del cromatógrafo de líquidos.

Condiciones LC: 24

     

Columna: Phenomenex Kinetex, C18, 50 x 2.1 mm, 2.7 μm, Cat No 00B-4462-AN Fase móvil A: Ácido Fórmico 0.1% Mobile Phase B: 100% Methanol Volumen de Inyección: 25 μL Temperatura del horno de columna: 35°C Gradiente Tiempo Modulo Eventos Parametro 0.01 Pumps 1.10 Pumps 2.00 Pumps 2.50 Pumps 5.00 Pumps 5.00 System Controller

Pump B Conc. Pump B Conc. Pump B Conc. Pump B Conc. Pump B Conc. Stop

5.0 85 85 5.0 5

Finalmente se prepararon tres curvas de calibración en un intervalo de 0.01 a 0.1 µg/L a partir de la disolución intermedia de 1 µg/L y se analizaron con el método establecido. Se obtuvo un LC de 0.006 µg/L calculado mediante el método de mínimos cuadrados y un coeficiente de correlación de 0.99989.

Figura 13: Curva de Calibración Atrazina

25

Figura 14: Cromatogramas Curva de Calibración Atrazina

26

7. Resumen, conclusión y recomendaciones Los talleres consistieron de dos partes: Parte teórica (dos días) y trabajo de laboratorio (tres días). La parte teórica dio conocimiento profundo de la cromatografía, espectroscopia y preparación de muestras. Se presentaron los temas de acuerdo con aspectos prácticos para que pudiera llevarse a cabo el trabajo de laboratorio. El trabajo de laboratorio se realizó para poner en práctica el conocimiento obtenido durante la sesión teórica. El método analítico se desarrolló para alcanzar la máxima sensibilidad para la detección de las moléculas seleccionadas de carbamazepina 10,11-epóxido, glifosato y atrazina, y se dieron los pasos para: 1. Optimizar el perfil de gradiente para acortar el pico cromatográfico. 2. Maximizar el volumen de inyección de la muestra para alcanzar el pico máximo de cromatografía. 3. Optimizar los parámetros MS. 4. Optimizar los parámetros MS/MS. 5. Desarrollo del método SPE para limpieza de la muestra y correlación de 100 veces. Rango de linealidad, LOQ y LOD; se determinaron la reproducibilidad y la recuperación durante el trabajo de laboratorio. Como parte de la validación de los métodos implementados, se cuenta con una curva de calibración y análisis de muestras fortificadas para carbamazepina 10,11-epóxido, y con tres curvas de calibración para los métodos de glifosato y atrazina; con lo cual se puede obtener límites de detección y cuantificación, intervalos de trabajo y lineal, sensibilidad y coeficientes de correlación; sin embargo, para finalizar la validación de los métodos se deben preparar muestras adicionadas para obtener la repetibilidad y reproducibilidad del método, así como la incertidumbre asociada la medición. El personal de laboratorio es excelente, profesional, efectivo y bien organizado. Los resultados obtenidos durante el trabajo de laboratorio fueron buenos y pueden aplicarse a otros productos farmacéuticos. 6.1 Recomendaciones para el trabajo habitual de laboratorio Practicar la preparación de la curva de calibración para comparar todas las preparaciones con base en su correlación y los parámetros "a" y "b" de la ecuación de linealidad y=ax+b. Practicar la preparación para el procedimiento SPE. Debe haber cuando menos dos expertos de laboratorio para correr el instrumento LC/MS. Instrumentación Cambiar el "root seal" del muestreador automático del HPLC. Usar habitualmente la "precolumna". Debe ser del mismo tipo de la columna analítica. Se recomienda la instalación de un horno para columnas en el sistema de la HPLC para estabilizar el tiempo de retención de los picos cromatográficos. 27

Se recomienda agregar "UV DAD" al sistema de la HPLC para obtener información adicional de picos y facilitar el desarrollo de métodos.

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