COMPATIBILIDAD DONANTE RECEPTOR EN LOS PROGRAMAS DE TRASPLANTE

COMPATIBILIDAD DONANTE RECEPTOR EN LOS PROGRAMAS DE TRASPLANTE LABORATORIO DE INMUNOGENETICA E HISTOCOMPATIBILIDAD DEL INSTITUTO NACIONAL DE DONACION ...
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COMPATIBILIDAD DONANTE RECEPTOR EN LOS PROGRAMAS DE TRASPLANTE LABORATORIO DE INMUNOGENETICA E HISTOCOMPATIBILIDAD DEL INSTITUTO NACIONAL DE DONACION Y TRASPLANTE DE CELULAS, TEJIDOS Y ORGANOS(INDT). FACULTAD DE MEDICINA, MINISTERIO DE SALUD PUBLICA, HOSPITAL DE CLINICAS, URUGUAY EXPOSITOR: DR. ROBERTO TOLEDO PROF. AGREGADO LAB. INDT

INDT “ Organización nacional destinada a brindar atención

integral en materia de trasplantes e implantes a toda la población uruguaya, de conformidad a los principios éticos y de equidad, promoviendo la donación ....” BASES : ---LEYES ---PROGRAMAS ----INFRAESTRUCTURA ----EQUIPOS DE TX: PERSONAL CALIFICADO ----PRESUPUESTO PERMANENTE

Actividades del Laboratorio de Inmunogenética e Histocompatibilidad del INDT A) TRASPLANTE DE ÓRGANOS SÓLIDOS Y MÉDULA ÓSEA: - Tipificacion ABO y HLA - Estudios de sensibilización pre y postrasplante. - Control postrasplante . - Listas de espera , serotecas y adjudicación. no

-Registro Nacional de donantes de Médula Osea emparentados.

B)

DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES A TRAVES DEL S. HLA

C)

ESTUDIOS DE POBLACIÓN.

D)

ESTUDIOS DE FILIACIÓN.

PROGRAMAS DE TRASPLANTE I) Donante Cadavérico: Órganos sólidos :Corazón Pulmón Riñón Hígado Reno-páncreas Reno-hepático II)Donante Vivo: Órgano sólido: Riñón Células:

Médula Ósea

LISTAS DE ESPERA Órgano Sólido Corazón Riñón Pulmón Hígado Reno-Páncreas Hepato-Renal Cardiorenal Intestino Combinaciones Médula Ósea

Personas 22 408 3 21 25 2

QUE SE ESTUDIA EN EL LABORATORIO DEL INDT PARA REALIZAR UN TRASPLANTE? Estudios pre-trasplante 1)DONANTE Y RECEPTOR: a)Sistemas de Histocompatibilidad Mayores: -- Sistema ABO -- Sistema HLA b)Prueba Cruzada Linfocitaria HLA Donante Especifica 2)RECEPTOR: Sensibilización contra sistema HLA: --P.R.A (Anticuerpos Reactivos contra panel) --Anticuerpos HLA clase I y II

ESTUDIOS POST TRASPLANTE

--Pruebas cruzadas post Tx --Análisis de especificidad de Anticuerpos --Análisis de Quimerismo --Genotipificación de Citoquinas

ÓRGANO SÓLIDO CRITERIOS GENERALES DE TRASPLANTABILIDAD Debe existir : 1) Compatibilidad ABO entre donante y receptor 2) Prueba Cruzada Linfocitaria HLA Donante Específica Negativa (favorable) 3) Un nivel aceptable de Compatibilidad HLA 4) Criterios Antropométricos acordes entre donante y Receptor

QUE CARACTERISTICAS PRINCIPALES DEBEN COMPATIBILIZARSE EN CADA TIPO DE TRASPLANTE?

Corazón

Pulmón

Hígado

Riñòn

Renopáncreas

RenoTx MO hepatico

ABO

SI

SI

SI

SI

SI

SI

SI/NO

PC

SI

SI

SI/NO

SI

SI

SI

SI

HLA

-----

-----

------

SI

PESO SI

SI

SI

TALLA

SI

SI

SI

PERIM. XIFOIDEO

SI

SI

SI

SI***

Que es necesario estudiar? 1)Sistema ABO 2)Sistema HLA a- Moléculas HLA (Antígenos) b- Anticuerpos HLA --

Prueba cruzada donante receptor -- P.R.A

-- Especificidades privadas

1)SISTEMA ABO Fue descubierto por Landsteiner en 1901 LOCALIZACION: Está presente en casi todas las células corporales (especialmente en endotelios)

IMPORTANCIA: Si se trasplanta un órgano sólido (riñón,corazón,pulmón,intestino,páncreas), con incompatibilidad de grupo ABO, se produce un rechazo hiperagudo (por anticuerpos naturales regulares)

TRASPLANTE ISOGRUPO ABO Es mejor porque : --es mayor la sobrevida del injerto a largo plazo --no provoca desbalances en la lista de espera

LA DETERMINACION DE GRUPO SANGUINEO ABO Se hace tomando en cuenta las propiedades del glóbulo rojo y del suero del individuo

Se estudian estas 2 cualidades por ser las mas accesibles y de fácil interpretación a través de una sencilla extracción de sangre

ANTIGENOS Y ANTICUERPOS NATURALES DEL GRUPO ABO

GLOBULO ROJO

REACCION BASICA: AGLUTINACION

AGLUTINACIONES ERITROCITARIAS

REACTIVO COMERCIAL ANTI A +GR

REACTIVO COMERCIAL ANTIB +GR

SUERO MAS GR A

SUERO MAS GRB

SUERO MAS GR O

A

+

--------

---------

+

-----

B

---------

+

+

---------

-----

AB

+

+

----

-----

-----

0

---------

--------

+

+

-----

GENÉTICA DE GRUPO ABO

GRUPO SANGUINEO ABO PAUTAS TRANSFUSIONALES Y DE TX DE ORGANO SOLIDO

DO O NAN A TE

B AB

RE

CEP TOR

O

A

B

AB

SI

SI SI

SI

SI SI

SI

SI SI

SISTEMA HLA Y TRASPLANTE La importancia de la compatibilidad HLA depende entre otros factores del órgano o tejido trasplantado. Es máxima en el trasplante de médula ósea En el trasplante renal diversos estudios multicéntricos señalan el efecto "beneficioso" del matcheo HLA. (fundamentalmente HLA DR, HLA B, HLA A).

SISTEMA HLA (Human Leucocyte Antigens) Moléculas de superficie celular, estudiadas inicialmente por su papel en la sobrevida de algunos injertos de tejidos o trasplantes de órganos Glicoproteínas de membrana de la superfamilia de las inmunoglobulinas Sus genes se localizan en el brazo corto del cromosoma 6 Conocido por la presencia de aloanticuerpos en suero de multíparas o politransfundidos (Dausset)

a)MOLÉCULAS DEL SISTEMA HLA: ANTIGENOS

HL A DR HL A A

HL A C

HL A DQ

HL A B

HL A DP

NUCLEO

CROMOSOMA 6

A

MEMBRANA CELULAR

C

B

D

HLA A

COMPLEMENTO HL A C

HL A B

HLA DR HLA DQ HLA DP

HERENCIA DEL SISTEMA HLA •

Simple



Cada hijo hereda un haplotipo de sus progenitores



Hay 2 productos de cada locus uno proveniente del padre y uno de la madre



Codominante

Funciones del sistema HLA Interviene en la Respuesta inmune: -- Reconocimiento de antígenos --Presentación de péptidos antigénicos a linfocitos T promoviendo respuestas inmunológicas celulares y humorales Su importancia en el Tx de órganos deriva de su función en la respuesta inmune

HLA TRASPLANTE

La importancia de la compatibilidad HLA depende entre otros factores del órgano o tejido trasplantado: Es máxima en el trasplante de médula ósea. En trasplante renal- estudios multicéntricos señalan el efecto del matcheo HLA ( HLA DR, HLA B, HLA A, HLA C).

CMH PRESENTACIÓN ANTIGÉNICA 1974 Se describe fenómeno de restricción por CMH --- fenómeno de presentación y reconocimiento de antigenos por linfocitos T ---- Característica de las moléculas CMH es su capacidad de unir péptidos

MOLECULAS HLA CLASE I Y II

PRESENTACION ANTIGENICA

MOLECULAS HLA CLASE I HLA- A , HLA –B, HLA -C

Presentes en todas las células nucleadas Presentan péptidos intracelulares a los linfocitos T CD8+, gatillando la respuesta citotóxica

MOLECULAS HLA CLASE II HLA- DR, HLA- DQ, HLA- DP

Presentes en células especializadas de la respuesta inmune (CPA) Presentan péptidos extracelulares a los linfocitos CD4+, Gatillan respuestas de ayuda a otras celulas

REGION GÉNICA DEL CMH Está presente en el cromosoma 6 humano,en la región 6p21.1-21.3 conuna longitud de aprox 4 kb Es un complejo poligénico de gran diversidad que comprende por lo menos : - 240 genes y pseudogenes - 21 genes polimórficos - más de 2900 alelos HLA. Está dividido en diferentes locus que se heredan en bloques: haplotipos

CMH - región génica

POLIMORFISMO HLA CLASE I

• El polimorfismo génico está en exón 2 y 3 • Radica en dominios alfa 1 y 2. Determinan la estructura en canal en la que ancla el péptido a ser presentado al linfocito T CD8 • Homología global AA superior al 75%

POLIMORFISMO HLA CLASE II

• Polimorfismo en exón 2 • Ambas cadenas polimórficas: dominios beta 1 y alfa 1 • Homología de cadenas alfa y beta menor al 65%

POLIMORFISMO HLA DETECCIÓN CRECIENTE •

POLIMORFISMO REGIÓN MHC NUMERO DE ALELOS JULIO 2011 IMGT/HLA Sequence Database- 7059 alelos

Clase I =5468

Clase II=1591

1729 HLA - A

7 HLA - DRA

2329 HLA - B 1291 HLA - C 10 HLA - E 22

HLA – F

47 HLA - G

1150 HLA - DRB 160 HLA - DQB1 33 HLA - DPA1 150

HLA - DPB1

7 HLA - DMA 13 HLA - DMB 12

HLA - DOA

13 HLA - DOB

GENES DRB DRB1 1051 DRB2 1(SG) DRB3 57 DRB4 15 DRB5 19 DRB6 3(SG) DRB7 2(SG) DRB8 1(SG) DRB9 1(SG)

NOMENCLATURA SEROLOGICA DEL MHC Denominación basada en la identificación serológica de las especificidades La letra identifica al locus. El número indica la especificidad de AntígenoHLA El paréntesis y un número adentro identifica al antígeno madre El número fuera del paréntesis identifica al split Ejemplo:

A25(10), B38(16), DR15(2),

A23(9), B57(17), DR17(3)

PRINCIPALES SPECIFICIDADES SEROLOGICAS LOCUS A A1 A2 A3 A23(9) A24(9) A25(10) A26(10) A34(10) A66(10)

A43

A11

A68(28) A69(28) A29(19) A30(19) A31(19) A32(19) A33(19) A74(19) A36

PRINCIPALES SPECIFICIDADES SEROLOGICAS LOCUS B B51(5) B52(5) B7 B8 B44(12) B45(12) B13 B64(14) B65(14)

B62(15) B63(15) B75(15) B76(15) B77(15) B38(16) B39(16) B57(17) B58(17)

B49(21) B50(21) B54(22) B55(22) B56(22) B27 B35 B37 B53 B60(40)

B61(40) B71(70) B72(70) BW4 BW6

ESPECIFICIDADES SEROLOGICAS MAS COMUNES DEL LOCUS C CW1 CW2 CW3 CW4 CW5 CW6 CW7

PRINCIPALES SPECIFICIDADES SEROLOGICAS LOCUS DR DR1

DR13(6)

DR15(2)

DR14(6)

DR16(2)

DR7

DR17(3)

DR8

DR18(3)

DR9

DR4

DR10

DR11(5) DR12(5)

EJEMPLO DE TIPIFICACIONES SEROLOGICAS DONANTE- RECEPTORES EN TX DE ORGANO SÓLIDO LOCUS

A

A

B

B

DON.1 24(9) 25(10) 44(12) 62(15)

DR

DR

GS

4

13(6)

AB

R1

2

25(10) 44(12) 62(15)

4

13(6)

AB

R2

11

25(10)

62(15)

4

13(6)

AB

R3

24(9)

36

44(12) 55(22)

7

13(6)

AB

R4

3

11(5)

8

AB

42

31(19) 60(40)

46

NOMENCLATURA GENICA DEL MHC :OMS Denominación basada en la identificación génica de las especificidades Letra :

corresponde al Locus

Número: corresponde al Gen *: Indica si fue secuenciado Número de 4 digitos xx yy Especificidad serologica

numero de variante alelica

NOMENCLATURA ACTUAL DE ALELOS HLA

NOMENCLATURA DEL MHC :OMS HLA-B*27:01

Primera variante del alelo HLA-B27

HLA-B27

20 subtipos (*) B*27:01 AL B*27:20

(*) Difieren entre ellos en 1 a 7 AA.

Nomenclatura del MHC: OMS HLA-DRB1*04:03 Alelo codificado por gen B1 del DR (DRB1) 04

Grupo alelico

03 Variante nucleotidica específica de ese alelo en particular

EJEMPLO DE TIPIFICACIONES MOLECULARES DE DONANTES – RECEPTORES EN TMO

A

A

B

R1

24:09

25:08 44:11

D1

24:09

D2

B

DR DR DQ

DQ

DP DP

35:06 04:01 13:07 01:03

02:02

01:01

03:01

25:08 44:11

35:06 04:01 13:07 01:03

02:02

01:01

03:01

24:02

25:08 44:10

35:06 04:05 13:07 01:05

02:02

01:02

03:01

D3

24:08

25:03 44:01

35:04 04:02 13:02 01:02

02:01

01:03

03:04

D4

03:01

31:10 40:03

46:01 11:03 08:01 01:04

02:03

01:11

02:02

Tipificación HLA Productos : HLA- Microlinfocitotoxicidad Genes HLA-

PCR SSO PCR SSP PCR SBT- Secuenciación

TECNICA DE MICROLINFOCITOTOXICIDAD SEPARACION LINFOCITOS TOTALES POR GRADIENTE DE DENSIDAD FICOLL HYPAQUE

GRADIENTE DE FICOLL HYPAQUE

TECNICA A UTILIZAR PARA LA MLCT

TIPIFICACION SEROLOGICA

MICROLINFOCITOTOXICIDAD COMPLEMENTO DEPENDIENTE

TIPIFICACION MOLECULAR HLA CLASE I. A, B, C.

Resolución intermedia

SSO

Alta resolución

SSP

TIPIFICACION MOLECULAR HLA CLASE II. DRB1 DRB3, DRB4, DRB5, DQB1 . • Resolución intermedia

SSO

• Alta resolución

SSP SBT

TIPIFICACIÓN ALÉLICA HLA (ADN)

PCR - SSO

PCR - SSP

PCR - SBT

SSP - HLA

SBT

b)ESTUDIO DE ANTICUERPOS HLA PRE Y POST-TRASPLANTE 1.Prueba Cruzada- Detecta Ac. HLA donante específicos - MICROLINFOCITOTOXICIDAD - CITOMETRIA DE FLUJO 2.Screening de Ac. HLA pre y post-trasplante. Detecta anticuerpos reactivos contra panel / P.R.A- se expresa en % I)_ MICROLINFOCITOTOXICIDAD II)_E.L.I.S.A III)_CITOMETRIA DE FLUJO 3.Análisis de especificidad de Anticuerpos-

B)ANTICUERPOS HLA EN TRASPLANTE

Veremos sustancialmente 3 puntos básicos: a)Naturaleza e importancia. b)Mecanismo de aparición. c)Métodos de detección.

a)EN CUANTO A SU NATURALEZA LOS ANTICUERPOS HLA. Son inmunoglobulinas de tipo Ig G, IgM, Ig A. Se unen al antígeno y promueven acciones nocivas sobre organismo (citolisis). Pueden estar dirigidos contra especificidades pertenecientes al locus HLA clase I, Locus HLA clase II o contra ambos. Pueden ser monoespecÍficos o poliespecÍficos. Pueden ser direccionados contra grupos Cregs del sistema HLA clase I. Estos son conjuntos de antÍgenos que tienen en común ciertos epítopes contra los cuales se generan anticuerpos lo cual permite clasificarlos en un grupo común.

TIPOS DE INMUNOGLOBULINAS

MOLECULAS DE ANTICUERPOS

EN CUANTO A SU IMPORTANCIA LOS ANTICUERPOS HLA. • Son responsables en buena medida de la fisiopatología de rechazos renales hiperagudos, agudos y cronicos. • Es por ello de buena práctica tener un programa de deteccion de anticuerpos que sea eficiente, prospectivo y económicamente viable.

MECANISMO DE APARICION HAY 4 FORMAS BASICAS: 1 Transfusiones sanguineas o de (sobretodo leucocitos y o plaquetas).

componentes

2 Trasplante de órganos. 3 Embarazos (sobre todo en multíparas). 4 Inmunizacióon actualmente).

voluntaria

(histórica

-

rara

P.R.A. (Anticuerpos reactivos contra panel) Revela la existencia de anticuerpos dirigidos contra el sistema HLA presentes en el suero del receptor. Oscila entre 0 y 100%. La probabilidad de trasplantarse es inversamente proporcional al valor del P.R.A.

P.R.A Y PROB. DE TX

IMPORTANCIA DEL P.R.A Si se trasplantara con anticuerpos específicos antidonante el resultado es la presencia inmediata de un rechazo hiperagudo Un P.R.A de 80% presente en un receptor nos esta informando que un 80% de los donantes muy probablemente no le servirán a este receptor

PRA (+) EN EL PRE TRASPLANTE • Menor probabilidad de trasplante. • La presencia de anticuerpos permite predecir la positividad en la prueba cruzada donante específica. • Mayor probabilidad de respuesta alogénica postrasplante humoral y celular. •

% P.R.A tiene correlación con rechazo agudo y crónico

• Permite identificar pacientes con factores de riesgo para RECHAZO AGUDO Y O CRONICO.

PRA (+) EN EL POST TRASPLANTE Se mencionan en la Literatura varios hechos: --Menor sobrevida del implante al año -- Mayor frecuencia de rechazo cronico --Aumento del P.R.A. mayor a 20% en los 3 a 4 meses previos al diagnóstico de rechazo crónico. --Asociación entre la producción de Ac HLA donante - especificos y rechazo. El monitoreo de Ac anti IgG HLA puede servir para identificar los pacientes de riesgo de rechazo agudo y o crónico.

MÉTODOS DE DETECCIÓN DE ANTICUERPOS HLA Es de buena practica el screening periódico de Ac HLA tanto en el pre- trasplante como en el post-trasplante. El monitoreo de desarrollándose a través metodologías básicas: I) Microlinfocitotoxicidad. II) E.L.I.S.A. III) Citometría de Flujo.

detección ha del tiempo

ido en 3

I) PRUEBA CRUZADA DONANTE ESPECIFICA POR MICROLINFOCITOTOXICIDAD

TEST DE ELISA FUNDAMENTO: Se enfrenta el suero a un panel comercial de antigenos HLA clase I y II purificados (en vez de panel celular). Una vez formado el complejo ag-ac, se agrega un segundo anticuerpo (anti-Ig G humana conjugada con fosfatasa alcalina), y luego de incubacion y lavados, se adiciona un sustrato coloreado sobre el que actua la fosfatasa alcalina produciendose un incremento de color proporcional a la concentracion de anticuerpo presente. En sintesis: Reacción positiva color azulado creciente. Reacción negativa. Incolora

TEST DE ELISA

CITOMETRIA DE FLUJO La luz laser detecta Ac unidos a colorantes fluorescentes

---Células o perlas revestidos de antigenos HLA se unen directamente al Ac HLA sérico y este a un segundo anticuerpo anti-inmunoglobulina, marcado con fluoresceina. ----Estas Celulas o perlas con el Ac fuorescente pegado, son impactadas por el laser y emiten una fluorescencia de mayor intensidad que las celulas sin el Ac. ---Cuanto mayor sea la intensidad de fluorescencia ello indica mayor cantidad del Ac unido a la celula o perla.

PRUEBA CRUZADA POR CITOMETRIA DE FLUJO •

La interpretación de un cross match por citometría de flujo se hace comparando la intensidad de la fluorescencia de la población celular: Las células del donante tratadas con suero del paciente se las compara con:



La intensidad de fluorescencia de las celulas del donante incubadas con suero control negativo.



La intensidad de fluorescencia de las celulas del donante incubadas con suero control positivo.

Se muestran áreas negativas en el centro y positivas a derecha. A mayor fluorescencia, mayor corrimiento de las perlas hacia la derecha del protocolo, con mayor cantidad de AC unido: Prueba Cruzada positiva : AC HLA PRESENTE

IMPORTANCIA DE LA ESPECIFICIDAD DE AC Es trascendente averiguar la especificidad de los Ac sericos sobretodo en los pacientes con niveles altos de P.R.A Da una información valiosa para cotejarla con la tipificación HLA del donante Sirve para conocer los antígenos contra los cuales no debería trasplantarse el paciente

HAY METODOLOGIA AUTOMATIZADA Ventaja - Permite realizar múltiples tipificaciones de antígenos y anticuerpos en donantes y receptores -De gran exactitud y de alta velocidad Desventaja -Es dependiente de aparatos y de firmas comerciales concretas vendedoras del mismo, del software y de los reactivos correspondientes. La carencia de metodología automatizada origina brechas que se van acentuando entre los países que pueden y los que no pueden invertir en automatización

INVERSION EN SALUD --La salud no tiene precio --Invertir en salud no es un gasto, más bien debe ser una una obligación de los países y de las instituciones que representan áreas concretas de la misma. --No puede determinarse cuanto es el ahorro de devolverle la salud a una persona concreta. --La inversión en salud nunca genera pérdida,es altamente rentable promoverla ya que es lo único que tenemos de patrimonio real individual y colectivo ---Para invertir en salud hay que invertir en tecnología única forma de poder achicar la distancia entre naciones ricas y pobres

FUTURO

DESARROLLO DE NUEVAS TECNICAS MAYOR PODER DE DISCRIMINACION , MAYOR SENSIBILIDAD, MAYOR PRACTICIDAD, MENOR COSTO

www.indt.edu.uy

GRACIAS

INSTITUTO NACIONAL DE DONACION Y TRASPLANTE

INDT

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