Jahrbuch 2006/2007 | Stemmann, Olaf | Chromosomensegregation in Vertebraten

Chromosomensegregation in Vertebraten Chromosome segregation in vertebrates Stemmann, Olaf Max-Planck-Institut für Biochemie, Martinsried Korrespondierender Autor E-Mail: [email protected]

Zusammenfassung Um Tumorbildung und Trisomien zu verhindern, ist eine exakte Halbierung des zuvor verdoppelten Chromosomensatzes w ährend der Mitose und den beiden meiotischen Reifeteilungen unerlässlich. Die Chromosomen

w erden

durch

Separase

getrennt,

eine

riesige

Protease,

die

einen

chromosomalen

Proteinkomplex (Kohäsin) spaltet. W issenschaftler am Max-Planck-Institut für Biochemie haben kürzlich einen neuen

Regulationsmechanismus

sow ie

eine

unerw artete,

nicht-proteolytische

Funktion

dieses

Schlüsselenzyms entdeckt.

Summary The exact halfing of the previously replicated chromosomes during mitosis and both meiotic divisions is crucial to avoid tumor formation and trisomies. Chromosomes are separated by action of separase, a giant protease, w hich cleaves chromosomal cohesin. Researchers from the Max-Planck-Institute of Biochemistry recently discovered a new regulation and an unexpected, non-proteolytic function of this key enzyme.

Mitose und Meiose im Überblick Der eukaryontische Zellzyklus w ird mit der Entstehung zw eier identischer Tochterzellen im Verlauf der aus Mitose und Zytokinese bestehenden M-Phase abgeschlossen. Die exakte Halbierung der genetischen Information in der Mitose beginnt in der Prophase mit der Kondensation der Chromosomen in ihre Transportform, der Auflösung der Zellkernhülle und der Interaktion der chromosomalen Kinetochore mit den Mikrotubuli des sich bildenden Spindelapparates. Erst w enn in der Metaphase alle Chromosomen zur Äquatorialebene der Spindel gew andert sind und eine ordnungsgemäße bipolare Aufhängung erzielt haben, erfolgt

in

der

Anaphase

ihre

schnelle

Trennung

in

Schw esterchromatiden,

w elche

dann

zu

den

entgegengesetzten Polen der Spindel transportiert w erden. Dekondensation der Chromosomen, Reformation der Kernhülle und Disassemblierung der Spindel in der Telophase schließen die Kernteilung ab. Auf sie folgt die Teilung des Zytoplasmas (Zytokinese). Schon seit ihrer ersten detaillierten Beschreibung durch Walther Flemming um 1890 haben die dramatischen, lichtmikroskopisch sichtbaren Vorgänge der Mitose Zellbiologen stets fasziniert. Trotz eines enormen Erkenntniszuw achses in den letzten zehn Jahren sind aber immer noch viele Aspekte der Chromosomensegregation auf molekularer Ebene noch unzureichend verstanden. © 2007 Max-Planck-Gesellschaft

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Die Regel, dass jeder Kernteilung eine Replikation der Chromosomen in der S-Phase vorhergeht, findet in der Meiose

eine

Ausnahme:

Schw esterchromatiden

Hier

ohne

w erden eine

zunächst

die

zw ischengeschaltete

homologen Replikation

Chromosomen voneinander

und

dann

getrennt.

die Die

Aufrechterhaltung eines stabilen Komplements an Chromosomen erfordert hohe Segregationsgenauigkeit. Fehlverteilungen von Chromosomen in der Mitose sind ein Charakteristikum der meisten Krebsarten und tragen maßgeblich zur Tumorprogression bei. Treten sie in der Meiose auf, resultieren daraus Sterilität oder Trisomien w ie das Dow n-Syndrom, w elches die häufigste Ursache für erbliche geistige Behinderung beim Menschen darstellt. Ein genaues Verständnis von Mitose und Meiose sind daher auch von großem klinischen Interesse.

Kohäsion und deren Auflösung Die

„Erfindung“

der

Schw esterchromatid-Kohäsion

erlaubt

es

Eukaryonten,

die

Trennung

der

Schw esterchromatiden zeitlich von deren Entstehung w ährend der S-Phase zu entkoppeln. Die Paarung w ird co-replikativ etabliert, indem ein Multiproteinkomplex, das Kohäsin, beide DNA-Doppelstränge ringförmig umschließt (Abb. 1). Kohäsin besteht aus mindestens vier Proteinen, von denen Smc1 und –3 antiparallele, superspiralisierte Helices bilden, die über eine flexible Region miteinander interagieren. Durch Wechselw irkung ihrer ATPase-Kopfdomänen mit den als Scc1 und –3 bezeichneten Untereinheiten kommt es zum Ringschluss.

Mode ll de r Schwe ste rchrom a tidtre nnung be i Ve rte bra te n. Ein Kontrollpunk t übe rwa cht die ordnungsge m ä ße Anhe ftung de r C hrom osom e n a n die Mitose spinde l, be vor e r m it de r Ak tivie rung de s AP C /C die Ana pha se und da m it de n Mitose a ustritt zulä sst. Die une rwa rte te R e gula tion von Se pa ra se durch C dk 1 wurde a m Ma x -P la nck -Institut für Bioche m ie e ntde ck t. © Ma x -P la nck -Institut für Bioche m ie /Ste m m a nn

In Vertebraten w ird der Zusammenhalt der Schw esterchromatiden in zw ei Stufen w ieder gelöst (Abb. 1). Früh in der Mitose führt der Prophase-Signalw eg zur Öffnung der Kohäsinringe an den Chromosomenarmen. Diese Signalkette

hängt

von

der Aktivität

der Proteinkinasen

Polo

(Plk1) und

Aurora

B sow ie

von

der

Phosphorylierung der Kohäsin-Untereinheit Scc3 ab. Nur an den Zentromeren, also der DNA, die im Bereich der Kinetochore liegt, beschützt ein Komplex aus Protein-Phosphatase 2A (PP2A) und Shugoshin (japanisch für „Beschützergeist“) das Kohäsin vor dieser ersten Dissoziationsw elle, vermutlich, indem Scc3 durch PP2AShugoshin dephosphoryliert gehalten w ird. Am Ende der Metaphase w ird auch diese kleine Population an Kohäsin entfernt, indem ihre Scc1-Untereinheit durch Separase geschnitten w ird. Die Auflösung dieses letzten Zusammenhalts der Schw esterchromatiden markiert den Beginn der Anaphase. Die stufenw eise Aufhebung der Chromosomenpaarung in der Mitose erinnert an die Situation in der Meiose (Abb. 2B). Dort führt die Dissoziation von Kohäsin von Arm- und Zentromerbereichen der Chromosomen zur Trennung der homologen Chromosomen in der Meiose I bzw . der Schw esterchromatiden in der Meiose II. W ieder schützt PP2AShugoshin zentromerisches Kohäsin, allerdings diesmal vor einer Separase-abhängigen Spaltung von Rec8

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Jahrbuch 2006/2007 | Stemmann, Olaf | Chromosomensegregation in Vertebraten w ährend der ersten Anaphase. Diese meiotische Entsprechung von Scc1 fungiert vermutlich nur nach vorhergehender Phosphorylierung als Separasesubstrat und kann daher durch Dephosphorylierung geschützt w erden. W ie PP2A-Shugoshin nach Meiose I inaktiviert w ird, um Separase die Spaltung restlichen Kohäsins in der zw eiten Anaphase zu ermöglichen, ist noch unklar.

Separase und ihre Regulation In allen bislang untersuchten Eukaryonten löst Separase in ihrer Funktion als Protease für Kohäsin die letztendliche Trennung der Chromosomen aus. W ährend ihr erstaunlich sequenzdivergenter N-Terminus vermutlich eine superhelikale Struktur (aus sog. ARM oder HEAT-W iederholungen) aufw eist, ist der C-Terminus Sitz der konservierten Cystein-Endopeptidase-Domäne [1]. Separase liegt normalerw eise in einem inaktiven Komplex mit Securin vor, einem Anaphase-Inhibitor, der am Ende der Metaphase über den UbiquitinProteasom-Weg abgebaut w ird. Der spezifitätsvermittelnde Ubiquitin-Ligase (E3) Komplex in diesem Prozess ist der APC/C (anaphase-promoting complex or cyclosome). Eine humane Krebszelllinie und sogar Securin knockout Mäuse zeigen bei Abw esenheit von Securin keinen frühzeitigem Verlust der Schw esterchromatid-Kohäsion [2, 3]. In Übereinstimmung mit dieser Beobachtung konnte am Max-Planck-Institut für Biochemie die Existenz eines w eiteren Regulationsmechanismus von Separase nachgew iesen w erden. In Extrakten aus Oozyten des Krallenfrosches (Xenopus laevis) lassen sich viele zellbiologische Vorgänge w ie Kerntransport, Replikation, programmierter Zelltod (Apoptose) und Zytoskelettbildung rekonstituieren. Beim Studium der Anaphase in diesem Modellsystem zeigte sich, dass ein konstitutiv aktiver Komplex aus Cdk1 (cyclin-dependent kinase 1) und regulatorischem Cyclin B1 die Schw esterchromatid-Trennung inhibiert, ohne jedoch den Abbau von Securin negativ zu beeinflussen [4]. Die Aktivierung der w ichtigen Serin/Threonin-Proteinkinase Cdk1 ist notw endig und hinreichend, um Zellen in die Mitose zu treiben. Umgekehrt ist ihre Inaktivierung durch APC/C-abhängigen Abbau von Cyclin B1 für das Verlassen der Mitose essenziell. Der inhibitorische Effekt von Cdk1-Cyclin B1 auf die Anaphase konnte auf die Inhibition von Separase zurückgeführt w erden, genauer, auf die inhibitorische Phosphorylierung eines einzigen Serin-Restes etw a in der Mitte der 233 kDa Protease (Aminosäure-Position 1126 im humanen Protein). Die Mutation des Serins in nicht-phosphorylierbares Alanin reichte aus, um Kohäsinspaltung und Schw esterchromatid-Trennung bei hoher, normalerw eise restriktiver Kinaseaktivität w iederherzustellen. Seitdem haben zahlreiche Gruppen berichtet, dass physiologische Konzentrationen (also keine Überexpression) von konstitutiv aktiver Cdk1 die Anaphase auch in lebenden mitotischen und meiotischen Zellen inhibieren. Des Weiteren w urde gezeigt, dass embryonale Stammzellen der Maus, w elche Separase w eder durch Securin noch durch Cdk1 inhibieren können, im Gegensatz zu den Einzelmutanten an verfrühter Trennung ihrer Schw esterchromatiden leiden, w enn sie in der Mitose arretiert w erden [5]. Schließlich w urde kürzlich berichtet, dass die Überexpression Cdk1-resistenter, nicht aber w ildtypischer Separase zu einem vorzeitigen Verlust an Kohäsion führt [6]. Obw ohl in der Metaphase normalerw eise der Großteil von Separase mit Securin assoziiert vorliegt, belegen diese Studien also, dass die Cdk1-abhängige Inhibition von Separase ein w ichtiger Reserve-Mechanismus ist, der dann eintritt, w enn Securin fehlt oder limitierend w ird (Abb. 1).

Der Separase-Cdk1-Komplex W issenschaftler am Max-Planck-Institut für Biochemie haben kürzlich auch herausgefunden, dass die Phosphorylierung von Separase für deren Securin-unabhängige Inhibition zw ar notw enig, aber nicht hinreichend ist [7]. Überraschenderw eise stellte sich heraus, dass der Co-Inhibitor, der an phosphorylierte © 2007 Max-Planck-Gesellschaft

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Separase rekrutiert w ird, Cdk1 selbst ist. Obw ohl Cdk1 und Securin unterschiedliche Bereiche am SeparaseProtein erkennen, schließen sie sich in ihrer Bindung gegenseitig aus. Beide repräsentieren daher parallele und nicht kooperative Inhibitonsmechanismen der Anaphase. Die Bildung des Separase-Cdk1-Komplexes ist mindestens ein Zw eistufen-Mechanismus. In einem ersten Schritt w ird Separase zunächst durch Cdk1 und möglicherw eise w eitere mitotische Kinasen an mehreren Stellen

phosphoryliert. W ährend

Phosphorylierung

von

Serin

1126

zu

einer die

Cdk1-Bindung

erst

ermöglichenden Konformationsänderung in der Separase führt, schaffen multiple Phosphorylierungen im Bereich von 1340-1400 eine Bindestelle für die Kinase. In einem zw eiten Schritt assoziiert die Cdk1 dann stabil über

ihre

Cyclin

B1-Untereinheit,

w elche

Phosphopeptid-Bindeeigenschaften

besitzt,

mit

diesem

Separaseabschnitt. Dieses Modell w ird durch eine schw ache Sequenzhomologie zw ischen den Aminosäuren 1340-1400 von Separase und dem Aminoterminus von Hefe (Saccharomyces cerevisiae) Cdc6 gestützt, da letzterer ebenfalls in phosphorylierter Form als Bindestelle für Cyclin B1 fungiert.

Separase-abhängige Cdk1-Inhibition in der Meiose Interessanterw eise teilen Vertebraten-Separase und Hefe-Cdc6 auch die Eigenschaft, ihrerseits die Aktivität von Cdk1 zu inhibieren. So kann zum Beispiel Separase die Cdk1-abhängige Phosphorylierung des Modellsubstrates Histon H1 verhindern sow ie einen durch konstitutiv aktive Kinase bew irkten Mitosearrest überw inden (Abb. 2A).

Se pa ra se ist in Ve rte bra te n (Me nsch, Ma us) e in C dk 1-Inhibitor m it Be de utung für die Me iose . (A ) Ex pe rim e nt, da s die Inhibition von C dk 1 durch Se pa ra se na chwe ist: Ein Xe nopusO ozyte ne x tra k t wurde durch k onstitutiv a k tive C dk 1 in de r Ana pha se a rre tie rt. Da nn wurde übe rprüft, ob Zuga be von wildtypische r ode r m utie rte r Se pa ra se de n Arre st a ufhob und de n Ex tra k t in die Inte rpha se zwa ng (e in Indiz für C dk 1Ina k tivie rung durch Assozia tion m it Se pa ra se ). (B) Mode ll de r Funk tione n von Se pa ra se wä hre nd de r (we ibliche n) Me iose . Die une rwa rte te R olle von Se pa ra se a ls C dk 1-Inhibitor a m Ende von Me iose I wurde a m Institut in Zusa m m e na rbe it m it de r Gruppe um Ke ith Jone s, Unive rsity of Ne wca stle , Engla nd, e ntde ck t. © Ma x -P la nck -Institut für Bioche m ie /Ste m m a nn

Auf der Suche nach einer biologischen Funktion für diese unerw artete und Proteolyse-unabhängige Eigenschaft von Separase als Inhibitor von Cdk1 w urden Forscher des Max-Planck-Instituts für Biochemie in der Meiose fündig [8]. Es zeigte sich, dass Separase für den Ausstoß des ersten Polkörpers notw endig ist, w elcher ein Kennzeichen für den erfolgreichen Abschluss der ersten Reifeteilung w eiblicher Keimzellen darstellt [9]. Mikroinjektion eines anti-Separase Peptid-Antikörpers, der zw ar die Cdk1-Bindung, nicht aber die Assoziation mit Securin oder die Kohäsinspaltung verhinderte, blockierte den Polkörperausstoß und die zeitgleiche Cdk1-Inaktivierung in Mausoozyten [8]. Der Polkörperausstoß fand jedoch trotz Anw esenheit des inhibitorischen Antikörpers statt, w enn Cdk1 gleichzeitig entw eder chemisch oder durch Expression eines Xenopus-Separasefragmentes inhibiert w urde. Die Cdk1-Inaktivierung nach Meiose I muss zw ar stattfinden, © 2007 Max-Planck-Gesellschaft

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um die Disassemblierung der Meiose I Spindel zu ermöglichen, sie darf aber nicht vollständig erfolgen, da sonst ungew ollte Replikation die Folge w äre. Der Separase fällt bei dieser zellulären Gratw anderung eine Schlüsselstellung zu. Dies ist nicht nur in Vertebraten (Mensch, Maus), sondern auch bei der Bäckerhefe (einem Pilz) der Fall, w enngleich Separase hier auch über einen anderen Mechanismus Cdk1 entgegenzuw irken scheint. Die jüngsten Ergebnisse verdeutlichen, dass die Regulationsmechanismen in der Anaphase im Allgemeinen und der „riesigen“ Separase im Besonderen noch viele Überraschungen für die Forschung bereit halten.

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BildTextblockerw eiterungVeranstaltungstickererw eiterungVideoerw eiterungVideolistenerw eiterungYouTubeErw eiterung [1] Viadiu, H.; Stemmann, O.; Kirschner, M. W.; Walz, T.: Domain structure of separase and its binding to securin as determined by EM. Nature Structural Molecular Biology 12, 552-553 (2005) [2] Mei, J.; Huang, X.; Zhang, P.: Securin is not required for cellular viability, but is required for normal growth of mouse embryonic fibroblasts. Current Biology 11, 1197-1201 (2001) [3] Pfleghaar, K.; Heubes, S.; Cox, J.; Stemmann, O.; Speicher, M. R.: Securin is not required for chromosomal stability in human cells. Public Library of Science (PloS) - Biology 3, e416 (2005) [4] Stemmann, O.; Zou, H.; Gerber, S. A.; Gygi, S. P.; Kirschner, M. W.: Dual inhibition of sister chromatid separation at metaphase. Cell 107, 715-726 (2001) [5] Huang, X.; Hatcher, R.; Y ork, J. P.; Zhang, P.: Securin and separase phosphorylation act redundantly to maintain sister chromatid cohesion in mammalian cells. Molecular Biology of the Cell 16, 4725-4732 (2005) [6] Holland, A. J.; Taylor, S. S.: Cyclin-B1-mediated inhibition of excess separase is required for timely chromosome disjunction. Journal of Cell Science 119, 3325-3336 (2006) [7] Gorr, I. H.; Boos, D.; Stemmann, O.: Mutual inhibition of separase and Cdk1 by two-step complex formation. Molecular Cell 19, 135-141 (2005)

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Jahrbuch 2006/2007 | Stemmann, Olaf | Chromosomensegregation in Vertebraten [8] Gorr, I. H.; Reis, A.; Boos, D.; Wuhr, M.; Madgwick, S.; Jones, K. T.; Stemmann, O.: Essential CDK1-inhibitory role for separase during meiosis I in vertebrate oocytes. Nature Cell Biology 8, 1035-1037 (2006) [9] Kudo, N. R.; Wassmann, K.; Anger, M.; Schuh, M.; Wirth, K. G.; Xu, H.; Helmhart, W.; Kudo, H.; McKay, M.; Maro, B. et al.: Resolution of chiasmata in oocytes requires separase-mediated proteolysis. Cell 126, 135-146 (2006)

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