Diss ETH No 9040

CELL AND TISSUE LOCALIZATION OF GLIA DERIVED NEXIN, A SERINE PROTEASE INHIBITOR

A dissertation submitted to the

SWISS FEDERAL INSTITUTE OF TECHNOLOGY ZÜRICH for the

degree

of

Doctor of Natural Sciences

presented by EVA REINHARD

dipl. Nat. ETH born September 16, 1961 Citizen of Ruegsau (BE)

accepted

on

Prof. Dr. H.

the recommendation of

Eppenberger,

examiner

Prof. Dr. D. Monard, co-examiner

1989

SUMMARY

Glia-derived nexin

(GDN)

is

43 kd secreted

a

promoting activity. GDN rapidly inhibits the

Plasminogen

activators

Inhibition of environmental

serine

by forming

protease inhibitor with neurite

proteases such as thrombin, trypsin, and

stable

There is evidence that the

complexes.

proteorytic activity

is necessary for the

stabilization of neuntes in vitro. However, it is

not

inhibitory activity

promoting activity

activity might

complexes

alone is suffieient for the neurite

investigated

more

about the

a

probe and

of GDN. The latter

high-molecular-weight

of stable

role in the neurite

potential

by using GDN-specific

GDN cDNA

yet clear whether the protease

proteases. In addition, the binding of GDN

role of GDN in

the localization of GDN and its gene

achieved

as a

and

components could play

In order to learn

was

GDN

between

extracelluiar matrix

the formation

depend upon

also

and

elongation

in situ

transcript

monoclonal and

to

promoting activity. I have

neurogenesis,

in rat. Localization of GDN

potyclonal

antibodies

hybridization studies, respectively.

as

well

Immunoblots

showed that GDN is more abundant in the brain than in non-neuronal tissue such

liver, lung,

olfactory

animal.

bulb

the

in this

the

on

olfactory

positive

showed that not

layer

of the

olfactory

only GDN,

olfactory

nerves on

high

features. The nervous

neurons

and the

in the

olfactory

primary cultures

the lifetime of the

of the

by neuronal

or

might

epithelium,

for

neurons

cells which stained with anti-GDN In situ

secrete GDN

olfactory system may are

the

only

hybridization

studies

olfactory

nerve

ensheathing

which, in turn,

can

the

be

could

directly

be related to its

and

funetion

ata

111

axogenesis

as a

neurite

continue

promoting

neurons.

Alternatively,

neurite-promoting

extracelluiar

permanent neurogenesis of the olfactory of GDN may protect

unique

struetures in the mammaiian

system in which degeneration, neurogenesis

protease-inhibitory activity

olfactory

non-neuronal cells.

and nerve

system GDN

of the

olfactory

clearly positive

bulb. We therefore propose that the cells

olfactory epithelium

factor that sustains the

was

12.

expression of GDN

but also its mRNA, is most abundant in the

their way to the brain

In this

postnatal day

layer

nerve

olfactory epithelium

against GDN;

abundance of GDN in the

throughout life.

the

throughout

for the Schwann cell marker S 100.

bound and/or intemalized The

GDN is found

tissue sections. In eontrast, in

also

of GDN after

resulted in the identification of GDN in the

could not be stained with antibodies were

results of Northern blot

in the rat brain in which the

region

underlying submueosa,

bulb. A subset of

previous

down-regulation

only region

Immunohistochemistry

epithelium,

GDN

was

down-regulated;

not

was

heart. These studies also confirmed

which had demonstrated the

analysis The

or

as

matrix

components from proteolytic damage.

The data in

vivo.

currently

available do not allow to

finally determine

the funetion of GDN

However, the abundance of GDN, found in the olfactory system Supports the

idea that the dual funetion of GDN may be

newly generated reeeptor

neurons

required

to reach their

IV

to

help growing

axons

target in the olfactory bulb.

of the

ZUSAMMENFASSUNG

Glia-derived nexin

(GDN)

ist ein 43 kd Protease-Inhibitor, der

sekretJert wird und das Auswachsen inhibiert Serin-Proteasen durch die

Inhibition

von

vollständig bekannt;

Anzahl und

Länge GDN

Bindung

von

benötigt

wird. Die zur

gibt jedoch

zu

extrazelluläre

erklären.

die

um

das Auswachsen und

um

ist zur Zeit noch nicht

Wirkung

Gegenwärtig

Matrix-Komponenten ebenfalls

vorliegenden Arbeit war es, GDN

zu

dass GDN im Hirn in wie Leber,

und sein

Lunge

oder Herz. Diese Studien

GDN-Synthese in der

nicht

war

die

vermindert

12

Neurone in Primärkulturen des neuronale Zellen

Epithels

wurden mit dem GDN-Antiserum

zeigte,

einzige Region

im adulten Rattenhirn, in der

GDN

immunhistochemisch

war.

wurde

Im

Gegensatz

nie mK

angefärbt.

Hybridisation

Auf Grund dieser Resultate

jenen Zellen synthetisierte

und

ausgeschieden wird,

umgeben. Ausgeschiedenes GDN

Zellen

kann

gebunden und/oder aufgenommen

Die

hohen

Mengen

an

GDN

im

waren

so von

in

dazu konnten die olfaktorischen

positiv

Nicht¬

waren,

mit einer GDN cDNA-

dass sowohl GDN, als auch die kodierende mRNA in grossen

Zellkörper gefunden werden.

Hülle

Riechepithel

GDN-Antikörpem gefärbt werden.

In situ

im

in der Nervenschicht des

in der Nervenschicht des Bulbus oifactorius vorhanden sind,

von

nach der Geburt

die für den Schwannzell-Marker S 100

hingegen,

zeigten,

frühere Northernblot-

Tage

Bulbus oifactorius lokalisiert. Einzelne olfaktorische Neurone im

GDN-posrtiv.

monoklonale

immunoblots

bestätigten

darunterliegenden Submucosa und

Gewebeschnitten deutlich

und

ist als in nicht-neuronalem

GDN-Transkript

an

in der Ratte

Wirkungsmechanismus während

grösseren Mengen vorhanden

abnimmt. Der Bulbus oifactorius

Probe

für seine Aktivität

Gen-Transkript

GDN-spezifische, polyklonale

erhalten.

Resultate, die zeigten, dass die Menge

Riechepithel,

GDN auf die

mit Proteasen könnte

Antikörper sowie eine GDN cDNA-Probe wurden dazu verwendet,

die

von

wird untersucht, ob die

Bildung stabiler, hochmolekularer Komplexe

Neurogenese

Gewebe,

von

Hinweise darauf, dass die

nötig ist,

lokalisieren und dabei weitere Hinweise für seinen

der

Wirkungsmechanismus

gewährleisten. Allerdings

zu

Neuriten

Der

beschriebenen, biologischen Aktivität beitragen.

Das Ziel der zu

an

es

Proteasen ausreicht,

von

von

Komplexe.

Aktivität im Medium

Neuriten

von

klar, ob die Inhibition

ebenfalls

SDS-resistenter

proteolytischer

Stabilisierung

die

Nervenzellen fördert. GDN

aus

(z.B. Thrombin, Trypsin, sowie beide Plasminogen Aktivatoren)

Bildung stabiler,

GDN ist noch nicht

Neuriten

von

Glia-Zellen

von

wo

schlagen

Mengen

keine neuronalen wir vor, dass GDN

die olfaktorische Neurone als

neuronalen und nicht-neuronalen

werden. olfaktorischen

System

könnten

mit

den

Besonderheiten dieses

Systems

in

Zusammenhang

Projektion ist die einzige Struktur im Nervensystem Degeneration GDN direkt

beteiligt

und

an

Regeneration

der

und für die

von

Differenzierung

bisherigen

in der eine

ständige

System

könnte

von

verantwortlich sein. GDN könnte aber

Nutzen sein, indem von

Neuriten

Abbau schützt, besonders, da in einem

kontinuierlich absterben, eine hohe

Mit den

Säugetiere,

olfaktorische

und dem Auswachsen der olfaktorischen Axone

extrazellulären Matrix, die für das Auswachsen

proteolytischen

der

primäre

Neuronen stattfindet. In diesem

einzigartige Neurogenese

auch allein als Protease-Inhibitor

stehen. Die

proteolytische

Resultaten kann

keine

es

Komponenten der

wichtig sind,

System,

vor

einem

in welchem Zellen

Aktivität erwartet werden kann.

endgültige Aussage

darüber

gemacht

werden, welche in vivo Funktion dieses Protein übernimmt. Seine Anreicherung im olfaktorischen Funktionen

System

lässt

benötigt werden,

Neurone ihr Ziel im

jedoch vermuten,

dass

beide

oben

beschriebenen

damit die Axone der neu differenzierten, olfaktorischen

Zentral-Nervensystem

erreichen können.

vi