Synthese asymmetrischer N-heterozyklischer Carbenkomplexe und deren Biokonjugate
Dissertation zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften der Fakultät für Chemie und Biochemie der Ruhr-Universität-Bochum
vorgelegt von
Diplom- Chemikerin Jessica Lemke
Bochum, Mai 2009
Diese Arbeit wurde in der Zeit von März 2006 bis Mai 2009 am Lehrstuhl für Anorganische Chemie I der Ruhr-Universität Bochum angefertigt.
Tag der mündlichen Prüfung: Referent: Koreferent:
3. Juli 2009 Prof. Dr. Nils Metzler-Nolte Prof. Dr. Roland A. Fischer
Ich danke allen, die mich durch ihr Interesse und ihre Hilfsbereitschaft unterstützt haben, insbesondere:
Prof. Dr. Nils Metzler-Nolte für die Vergabe eines spannenden Themas und den großen Freiraum bei der Erstellung dieser Arbeit
Maya Penkova und Dr. Max Lieb für die ständige Diskussionsbereitschaft
Antonio Pinto für die umfassenden Zellexperimente mit meinen „Goldstücken“
Annika Groß für erste Zelltests
Den Spektroskopie-Abteilungen der Ruhr-Universität-Bochum für das Messen zahlreicher NMRund Massenspektren
Dr. Klaus Merz, Vera Vasylyeva und Manuela Winter für das Lösen der Röntgenstrukturen
Sowie dem gesamten Lehrstuhl der AC I
Till mina föräldrar
Inhalt
INHALTSVERZEICHNIS
1. EINLEITUNG
1
1.1 Historisches
1
1.2. Eigenschaften von N-heterozyklischen Carbenen
3
1.3 Synthese von Imidazoliumsalzen als Ligandenvorstufen für die Komplexierung
5
1.4 Synthese von Imidazolin-2-thionen
7
1.5 Synthese N-heterozyklischer Carbenkomplexe
8
1.6 Transmetallierung mit NHC-Silber(I)-Komplexen
11
1.7 Ausgewählte NHC-Komplexe mit unterschiedlichen Anwendungen
13
1.8 Metalle in der Medizin
15
2. AUFGABENSTELLUNG
18
3. SYNTHESE DER IMIDAZOLIUMSALZE
19
3.1 Synthese der N-Alkylierten Imidazole
21
3.2 Synthese der Arylimidazole
23
3.3 Synthese von N,N’-substituierten Imidazoliumsalzen
25
3.3.1 Synthese von N’-substituierten Imidazoliumsalzen mit Methylenbenzoesäure –und Methylenbenzoesäureestern
25
3.3.2 Synthese von N,N’-substituierten Imidazoliumsalzen mit Arylhalogenidresten
27
3.3.3 Synthese von N,N’-substituierten Imidazoliumsalzen mit Benzylhalogenidresten
27
3.3.4 Synthese von N’-substituierten Imidazoliumsalzen durch Propargylbromid
28
3.3.5 Synthese von N’-unfunktionalisierten und N’-Ethylesterfunktionalisierten Imidazoliumsalzen
28
3.4 Synthese von N-Methyl-Imidazoliumpeptiden
30
3.4.1 Peptidsynthese in Lösung
30
3.4.2 Methyl- und Tert-butylimidazolium-Peptidsalze
31
3.4.3 Methyl-Imidazolium-Pseudoenkephalin durch SPPS
33
3.4.4 Thiaozolium-Peptide als Ligandenprekursoren
37
Inhalt 3.5 Zusammenfassung
4. SYNTHESE DER NHC-KOMPLEXE 4.1 Synthese durch Deprotonierung mittels starker Basen 4.1.1 Zusammenfassung 4.2 Synthese von NHC-Komplexen durch Transmetallierung mit µ-Halogenkomplexen
40
41 41 43 44
4.2.1 Funktionalisierte NHC-Rhodium(I, III)- und Ruthenium(II)-Komplexe
44
4.2.2 Komplexierung von Methylimidazolium-Peptidkonjugaten
48
4.2.3 Komplexierung von Ethylthiazolium-Peptidkonjugaten
49
4.2.4 Zusammenfassung
51
4.3 NHC-Biokonjugate durch Kopplung von Peptiden an funktionalisierte NHC-Komplexe
52
4.3.1 Kopplung von NHC-Rutheniumkomplexen mittels SPPS
52
4.3.2 Kopplung von Rhodium(III)-NHC-Komplex in Lösung
56
4.3.3 Zusammenfassung
57
4.4 NHC-Komplexe mit unfunktionalisierten Resten und Ethylestergruppen 4.4.1 Zusammenfassung
5. GOLD-NHC-KOMPLEXE DURCH TRANSMETALLIERUNG 5.1 Synthese linearer NHC-Gold(I)- und quadratisch-planarer Gold(III)-Komplexe 5.1.1 Verlängerung des Peptidrestes
58 60
61 62 69
5.2 Ersatz des ancillaren Chlorliganden durch Thiol-funktionalisierte Aminosäuren und Peptide
70
5.3 Zusammenfassung
72
6. VERSUCHE ZUR MESSUNG DER LIPOPHILIE UND DER HYDROLYSE VON CHLORID-LIGANDEN 6.1 Zusammenfassung
7. BIOLOGISCHE AKTIVITÄT 7.1 Zytotoxizitätsassays und Krebszelllinien
74 78
79 79
7.1.1 Zytotoxizitätsassays
79
7.1.2 Zelllinien
81
7.2 Durchführung der Zytotoxizitätstests 7.2.1 Zytoxizitätstests der NHC-Ruthenium(II)-Komplexe
81 82
Inhalt 7.2.2 Zytoxizitätstests der NHC-Gold(I, III)-Komplexe
83
7.2.3 IC50-Werte für die NHC-Gold-Verbindungen
85
7.2.4 Zusammenfassung
88
7.3. Test auf antimetastatische Aktivität
89
8. ZUSAMMENFASSUNG
93
9. EXPERIMENTELLER TEIL
98
9.1 Apparativer Teil
98
9.2 Methoden
100
9.3 Synthese und Charakterisierung
107
10. LITERATUR
187
11. ANHANG
193
11.1 Verzeichnis der im Rahmen dieser Arbeit erstmalig hergestellten Verbindungen
193
11.2 HPLC- Spektren
198
11.3 Massenspektren
199
Abkürzungen 2-Cl-Trt Ac äq. Ar AS ATR Boc br. BSA °C cm CMF-PBS CO CO2 Dansyl d DCM DCC dd DIPEA DMF DMS-AuCl DMSO EN Enk ESI Et EtOAc Et2O FAB GGFL FCS Fmoc FT-IR g h HOBt HPLC Hz IBCF IR J KH KHMDS KOtBu
2-Chlortrityl Acetyl Äquivalente Aromat Aminosäure abgeschwächte Totalreflexion Tert-butoxycarbonyl breit Rinderserum Albumin (bovine serum albumin) Grad Celsius Zentimeter Calcium- und Magnesium- freies- PBS Kohlenmonoxid Kohlendioxid 5-(Dimethylamino)naphthalene-1-sulfonyl Dublett Dichlormethan Dicyclohexylcarbodiimid Dublett vom Dublett Diisopropylethylamin Dimethylformamid Dimethylsulfid- Gold(I) Chlorid Dimethylsulfoxid Elektronegativität Enkephalin Electro-Spray Ionisation Ethyl Ethylacetat Diethylether fast atom bombardment Gly-Gly-Phe-Leu Fötales Kälberserum (fetal calf serum) Fluorenylmethoxycarbonyl Fourier-Transform-Infrarot Gramm Stunde 1-Hydroxy-1H-benzotriazol High Performance Liquid Chromatography Hertz Isobutylchloroformiat Infrarot Kopplungskonstante Kaliumhydrid Kaliumhexamethyldisilazid Kalium-tert-butylat
log logP m m/z Me MeOH min mL MOPS MS μL NaH N2 NHC MeOH Mes MS MTP neg NEt3 NMM NMR p P PBS PFA Pfp Ph ppm pos RP rpm RT s SPPS t T tBuOH tBu TCA TFA THF TIS tR TRIS
dekadischer Logarithmus logarithmischer Octanol/ WasserVerteilungskoeffizient Multiplett Masse über Ladung Methyl Methanol Minuten Milliliter 3-Morpholinopropansulfonsäure Molsieb Mikroliter Natriumhydrid Stickstoff N-heterozyklisches Carben Methanol Mesityl-Gruppe Massenspektrometrie Mikrotiterplatte negativ Triethylamin N-Methylmorpholin Nuclear Magnetic Resonance para Watt phosphate buffered saline, Phosphat-gepufferte Salzlösung Paraformaldehyd Pentafluorphenyl Phenyl parts per million positiv Reverse Phase Revolutions per minute, Umdrehung/ Minute Raumtemperatur Singulett, Sekunde, siehe Solid Phase Peptide Synthesis, Festphasenpeptidsynthese Triplett Temperatur Tert-butanol Tert-butyl Trichloro acetic acid, Trichloressigssäure Trifluoro acetic acid, Trifluoressigsäure Tetrahydrofuran Triisopropylsilan Retentionszeit Tris-hydroxymethyl-aminomethan
U ü.N. V Δ w/v δ ν
Units (Einheit bei Antibiotika), Umdrehung über Nacht Volumen Differenz Masse/Volumen Chemische Verschiebung Frequenz
Abkürzungen der Aminosäuren Gly Leu Phe Cys Thia His
G L F C H
Glycin Leucin Phenylalanin Cystein Thiazolylalanin Histidin
Einleitung
1. Einleitung 1.1 Historisches
In den letzten zwei Jahrzehnten hat eine neue Klasse von Verbindungen zunehmendes Interesse gefunden. Bereits 1968 entdeckten WANZLICK und ÖFELE unabhängig voneinander die Synthese von Metall-Carben-Komplexen.[1, 2] Beide fanden heraus, dass heterozyklische Imidazolium- und Pyrazoliumsalze außerordentlich stabile Komplexe mit bestimmten Übergangsmetallen eingingen. Die Synthese von Pentacarbonyl (1,3-dimethylimidazolin-2-yliden) Cr(0) und Bis(1,3-diphenylimidazolin-2-yliden) Hg(II)-Perchlorat waren bahnbrechende Beispiele.
2
N
N
N
Cr(CO)5
Hg
N
2 ClO4
N
N
Abbildung 1.1: Die ersten Carben-Komplexe von Öfele (links) und Wanzlick (rechts)
Bei der Synthese der Komplexe nutzten beide die leichte Abstrahierbarkeit des aziden Imidazoliumprotons
der
Ligandenprekursoren
aus,
z.B.
durch
das
nukleophile
-
Cabonylchromat [Cr(CO)5H] oder durch das basische Hg(OAc)2 (Abb. 1.1). Allerdings konnten beide keine Intermediate isolieren. Erst 1991 wurde von ARDUENGO[3] das erste stabile N-heterozyklische Carben (NHC) hergestellt (Abb. 1.2). Unter Ausschluss von Luft und Feuchtigkeit ist 1,3-Diadamantylimidazolin-2-yliden ein stabiler, kristalliner Feststoff (Schmelzpunkt 240°C). Stabilität wird hier vor allem durch die sterisch anspruchsvollen Adamantylreste erhalten. Das Carben wird aus dem Diadamantylimidazoliumchlorid durch Deprotonierung mittels NaH und katalytischen Mengen an DMSO in THF bei - 40°C hergestellt. 1
Einleitung
N N
NaH
N
THF, kat. DMSO
N
Cl
+ H2 + NaCl
Abbildung 1.2: Synthese des ersten freien stabilen NHC
Diese Synthesevorschrift war die erste allgemein zugängliche Methode zur Synthese von NHC und bedeutete den Startpunkt für die Entwicklung neuer NHC-Komplexe und für deren vielfältige Anwendungen.[4-6] Die Annahme, dass die Aromatizität für die Stabilität der ungesättigen Carbene (6π-Elektronen) verantwortlich ist, wurde später durch die Isolation von stabilen, ungesättigen NHC widerlegt.[7, 8] Die Bedeutung der NHC-Komplexe wurde 2005 nochmals eindrucksvoll belegt, als Robert H. GRUBBS, Richard R. SCHROCK und Yves CHAUVIN den Nobelpreis für ihre Arbeiten auf dem Gebiet der Metathese erhielten.[9-11] In der Jurybegründung wurde unterstrichen, dass die Metathese eine bahnbrechende Methode ist, die neue kostengünstige Möglichkeiten für die industrielle Synthese von bis dahin schwer zugänglichen Molekülen eröffnet hat.[12] Die Katalysatoren auf diesem Gebiet sind fast ohne Ausnahme NHC-Komplexe.[13-15]
2
Einleitung
1.2. Eigenschaften von N-heterozyklischen Carbenen
Das denkbar einfachste Carben ist Methylen („CH2“). Allgemein bezeichnet man als Carbene neutrale Verbindungen des zweiwertigen Kohlenstoffes mit sechs Valenzelektronen. N-heterozyklische Carbene (NHC) sind nicht-lineare Moleküle, die ein sp2-hybridisiertes Kohlenstoffatom haben, und sich von Imidazol, Thiazol oder Pyrazol ableiten. Es gibt noch eine Vielzahl weitere Vertreter dieser Stoffklasse, auf die in dieser Arbeit jedoch nicht näher eingegangen wird. Ein Übersicht über eine große Auswahl von Carbenliganden geben z.B. HAHN und JAHNKE.[16] Freie NHC sind starke Nukleophile, die sowohl zu Haupt- als auch Nebengruppenmetallen Bindungen eingehen.[17, 18] Sie binden gleichermaßen an harte und weiche Metallzentren, was sie zu einem sehr vielseitigen Ligandensystem macht. NHC reagieren phosphananalog unter Substitution
anderer
Zweielektronenliganden
(z.B.
Substitution
von
CO
ohne
Lichtaktivierung). Häufig sind die Metall-Carbenkohlenstoffbindungen sogar stärker als die der isolobalen Phosphane.[6, 17, 19]
..
R C
M
..
M
..
..
..
R
C
R a)
.. M
..
..
N C
R b)
.. N
c)
Abbildung 1.3: Orbitaldiagramme von Fischer (a)), Schrock (b)) und NHC (c)).
Die Bindungsart der NHC an Metallatome unterscheidet sich von Fischer- und Schrockcarbenen. Fischercarbene binden über eine σ-Bindung an das Metallatom. Gleichzeitig besitzen sie ein leeres p-Orbital, in das Rückbindung erfolgen kann. Zumeist ist mindestens einer der der Reste R ein guter π-Donor, der zusätzlich das leere p-Orbital des Carbens stabilisiert.[20] Fischer-Carbene sind besonders stabil, wenn sie an späte Übergangsmetalle in niedrigen Oxidationsstufen binden, d.h. es kommt zu einer Rückbindung aus gefüllten dπ-Orbitalen des Metalls in leere p-Orbitale des Carbens. Schrock-Carbene dagegen binden frühe Übergangsmetalle in hohen Oxidationsstufen. Die Stabilisierung erfolgt durch π-Rückbindung vom gefüllten p-Orbital des Carbens in das dπ-Orbital des Metalls. 3
Einleitung Besonders gute Stabilisierung erfolgt, wenn die d-Orbitale nicht gefüllt sind, da so der Abstoßungseffekt der Elektronen in den überlappenden Orbitalen verringert wird.[21] Bei NHC, die sich von Imidazol oder 4,5-Dihydro-Imidazol ableiten, wird der CarbenKohlenstoff durch die pπ-pπ-Elektronendonoreigenschaften der angrenzenden Stickstoffatome des Heterozyklus stabilisiert. Der Energiegewinn beträgt dabei ca. 70 kcal/mol. Für ungesättigte Systeme kann Aromatizität zusätzlich einen Stabilisierungsenergiegewinn von 25 kcal/mol beitragen.[6] Zusätzlich erfolgt noch eine induktive Stabilisierung des C2Kohlenstoffes durch die freien Elektronenpaare an den beiden Stickstoffatomen.[19] Zumeist werden NHC als reine σ-Donoren beschrieben, wobei das freie Elektronenpaar am C2-Kohlenstoff die Bindung zum Metallzentrum eingeht. ÖFELE und HERRMANN zogen IR-spektroskopische Messungen heran, um die π-Akzeptor- und σ-Donoreigenschaften der Carbene zu untersuchen. Dabei stellte sich heraus, dass NHC ähnliche π-Akzeptor- und σDonoreigenschaften wie z.B. PMe3 besitzen.[22] NOLAN et al. postulierten aufgrund von Struktur- und thermodynamischen Studien, dass NHC allgemein bessere Donoreigenschaften aufweisen als Phosphanliganden, mit Ausnahme des sterisch gehinderten AdamantylCarbens.[23] Neuere theoretische Berechnungen schlagen allerdings die Existenz von π-Rückbindungen für einige Übergangsmetallzentren vor.[24,
25]
NHC-Komplexe von Hauptgruppenmetallen sind
nicht zu Rückbindungen in die pπ-Orbitale des Carbens befähigt, was wahrscheinlich auch die relative Schwäche der Metall-Carbenkohlenstoffbindung erklärt, sowie die Empfindlichkeit gegenüber Luft und Feuchtigkeit.[26] Die Exklusivität der Deprotonierung am C2-Kohlenstoffatom ist bedingt durch die höchste Azidität an dieser Stelle im Heterozyklus. Experimentell und auch durch Berechnung ist der pKa- Wert für das C2-Proton als 23 ± 1 bestimmt worden.[27] Für das C4-Proton liegt dieser Wert um 9 pKa- Einheiten niedriger (pKa = 33).[28] Die Tatsache, dass es C4-zentrierte Carbenkomplexe, so genannte „unkonventionelle“ oder nicht-klassische NHC-Komplexe, gibt, ist auf einen anderen Komplexierungsmechanismus zurückzuführen. Anstelle der C-HBindungsaktivierung der Imidazoliumsalze tritt hier eine oxidative Addition auf.[29]
5 4
2
N 2 [M]
N 4
N
N
[M]
5
Abbildung 1.4: Klassischer (links) und unkonventioneller NHC-Komplex (rechts).
4
Einleitung
1.3 Synthese von Imidazoliumsalzen als Ligandenvorstufen für die Komplexierung
Prinzipiell stehen mehrere Synthesewege zur Herstellung von Imidazoliumsalzen zur Verfügung. Die einfachste Methode geht von Imidazol aus. Dabei wird zuerst basenvermittelt der Stickstoff der NH-Gruppe am Imidazol deprotoniert. Das so erhaltene Salz reagiert anschließend mit einer Reihe von Alkylhalogeniden unter N1-Alkylierung zum Alkylimidazol (Abb. 1.5).[30]
H N H N
R1 N Br H N R2
1. NaHCO3 2. 2 R1-Br
1. Base
R1 N
1. Base
N
2. R1-Br
H
H 2. R2-Br
H N N
R1 = R2; R1 = R2
Abbildung 1.5: Synthese von symmetrischen und unsymmetrischen Imidazoliumsalzen, ausgehend von Imidazol.
Mit einem zweiten Äquivalent Alkylhalogenid erfolgt die Reaktion zum N,N’Dialkylimidazoliumsalz.[31] Diese Methode der schrittweisen Reaktionsführung wird vor allem für unsymmetrische Imidazoliumsalze verwendet. Durch Deprotonierung des Imidazols mit einer Base und anschließender Umsetzung mit zwei Äquivalenten Alkylhalogenid lassen sich symmetrische Imidazoliumsalze erzeugen. Diese Art der Reaktionsführung ist im Wesentlichen auf primäre und sekundäre Alkylhalogenide beschränkt. Zur Einführung aromatischer Reste und tertiärer Alkylreste müssen alternative Methoden verwendet werden. In einer Art Ullmann-Kondensation erfolgt die Reaktion von Imidazol und Arylhalogeniden (X = Br, I) katalysiert durch CuI, Cs2CO3 und N,N’-Dimethylethylendiamin.[32] Dies eröffnet den Zugang zu einer Reihe von sterisch stark gehinderten N-Arylimidazolen (Abb. 1.6). 5
Einleitung 10% CuI, 40%
X
H N
MeHN
NHMe
Cs2CO3
N
+ N
Δ
N
X = Br, I
Abbildung 1.6: Synthese von Arylimidazol
Die
Einführung
von
Tertiärbutylgruppen
erfolgt
durch
eine
so
genannte
Mehrkomponentensynthese (Abb. 1.7).[33] Dabei wird Glyoxal mit Tert-butylamin, Formaldehyd und Ammoniak zum Tert-butylimidazol zyklisiert.
O
NH2 +
O
35% CH2O, 25% NH3, MeOH
N
70°C, 5-15 h
N
Abbildung 1.7: Synthese von N-Tert-butylimidazol
Durch die Wahl der Reaktionsführung bei der Mehrkomponentensynthese lassen sich symmetrische oder unsymmetrische Imidazoliumsalze herstellen.
O
O
HX - 3 H2O
O H
CH2O, HX
R N
R NH2
O
+
R NH2 + H2N R
R N Br H N R
- H2 O
H
N R
O NH2 R
Abbildung 1.8: Mehrkomponentensynthese von symmetrischen Imidazoliumsalzen
Für die Einführung auch reaktiver N,N’-Substituenten werden primäre Amine, Glyoxal und Formaldehyd in Gegenwart einer Protonensäure erhitzt. So lassen sich flexibel zahlreiche symmetrisch substituierte Imidazoliumsalze erhalten. Die Reaktion kann auch auf der Stufe 6
Einleitung der Diimine gestoppt werden, um vor der Zyklisierung mit Formaldehyd ungewöhnliche Moleküle einzubauen, wie z.B. Ferrocenyleinheiten (Abb. 1.8).[34] Sollen unsymmetrisch N,N’-substituierte Imidazoliumsalze hergestellt werden, kann man eine Mehrkomponentenzyklisierung mit anschließender N-Alkylierung durchführen.[35] Bei pH 1 wird durch Mehrkomponentenzyklisierung ein N-Alkylimidazoliumsalz erzeugt, das anschließend am zweiten Stickstoffatom zum unsymmetrisch substituierten Produkt alkyliert werden kann (Abb. 1.9).
O +
R1 NH3 X
+
NH4 Y
+
CH2O
O
H
R1 N X H N H
+
R1 N X H N R2
Base, R2 X - HX
Abbildung 1.9: Mehrkomponentensynthese von unsymmetrischen Imidazoliumsalzen
1.4 Synthese von Imidazolin-2-thionen
Anstelle
von
Imidazoliumsalzen,
können
auch
alternativ
Imidazolin-2-thione
als
Ausgangsverbindungen zur Carbenkomplexsynthese verwendet werden.[36, 37] Durch Kondensation von α-Hydroxyketonen mit N,N’-Thioharnstoffderivaten werden Imidazolin-2-thione in guten Ausbeuten erhalten. Diese Methode hat sich wegen ihrer guten Durchführbarkeit seit 1993 als Standardverfahren etabliert.
R
H N
H N S
O R
Rückfluß
R N S
+ OH
N R
Abbildung 1.10: Synthese von Imidazolin-2-thionen
7
Einleitung
1.5 Synthese N-heterozyklischer Carbenkomplexe
Klassisch erfolgt die Synthese N-heterozyklischer Carbenkomplexe durch die Deprotonierung eines Imidazoliumsalzes mit einer starken Base (z.B. NaH oder KOtBu) bei niedrigen Temperaturen in THF. Man erzeugt so in situ das freie Carben, das mit einem Metallkomplex zum NHC-Komplex umgesetzt wird.[38, 39] Da NaH und KH in THF unlöslich sind, muss mit katalytischen Mengen deprotonierten DMSO oder KOtBu gearbeitet werden, um eine vertretbare Reaktionsgeschwindigkeit zu erreichen.[3] Für Salze mit aziden Substituenten kann auch die sperrige Base Kaliumhexamethyldisilazid
(KHMDS)
verwendet
werden,
um
eine
ausschließliche
Deprotonierung am C2-Kohlenstoff zu gewährleisten. Anstelle von den Alkalihydriden kann auch stöchiometrisch KOtBu zugesetzt werden. Dann entsteht anstelle von Wasserstoff das weniger flüchtige tBOH. Bei den bisher beschriebenen Verfahren liegt das Imidazoliumsalz aufgrund der geringen Löslichkeit in THF meist als Suspension vor, insbesondere bei tiefen Temperaturen. Das bei der Reaktion erzeugte freie Carben ist in THF problemlos löslich und lässt sich daher gut durch Filtration isolieren. Als Alternative zu den bisher beschriebenen Suspensionsreaktionen wurde von HERRMANN et al. ein Verfahren entwickelt, bei dem in einem 5:1 Gemisch von flüssigen Ammoniak und THF gearbeitet wird.[40] Bei Temperaturen von – 80°C bis – 30°C geht das in reinem THF unlösliche
Imidazoliumsalz
in
Lösung.
Nach
Zugabe
von
NaH
läuft
die
Deprotonierungsreaktion im Allgemeinen innerhalb weniger Minuten vollständig ab. Nach Entfernen des Ammoniaks lässt sich das freie Carben problemlos durch Filtration von den Alkalisalzen abtrennen. Allerdings ist die Toleranz funktioneller Gruppen bei den bisher beschriebenen Deprotonierungsreagenzien äußerst gering. Selbst die Wahl von KHMDS verhindert häufig nicht die Deprotonierung von anderen, ebenfalls aziden Substituenten.
R1 N N X R2
NaH, kat. DMSO, THF; o. KOtBu, NH3/THF (5:1)
-40°C
R1 N N R2
W(CO)6, THF
-40°C
R1 R1 N OC CO W(CO)6, THF N W CO N -40°C N OC CO R R2 2
R1 K, THF Δ
N S N R2
Abbildung 1.11: Schematische Übersicht über Standardverfahren zur NHC-Komplexsynthese.
8
Einleitung Eine weitere Methode zur Synthese N-heterozyklischer Carbenkomplexe ist die Reduktion von Imidazolin-2-thionen mit Kalium in siedenden THF innerhalb von 4 h zum freien Carben. Nachteilig hierbei ist die thermische Labilität der freien Carbene in Lösung, was stark von den Substituenten an den Stickstoffatomen des Carbens abhängt.[36] 2005 stellten CRABTREE et al. ein alternatives Verfahren zur Komplexsynthese vor.[41] Dabei wird ausgehend vom Zwitterion Dimethylimidazolium-2-Carboxylat und einem µHalogenkomplex der NHC-Komplex bei 60°C in Acetonitril erhalten. Als Abgangsgruppe dient hierbei CO2 (Abb. 1.12). Dimethylimidazolium-Carboxylat wird durch die Reaktion von Methylimidazol und Dimethylcarbonat bei 90°C erhalten.[42] Bei Reaktionstemperaturen über 120°C erhält man anstelle des 2-Carboxylat-Adduktes das 4-Carboxylat-Addukt, das ebenfalls zu einem so genannten nicht-klassischen NHC-Komplex umgesetzt werden kann (vgl. Abb. 1.4).[29]
CH3 O N
[Rh(COD)Cl]2, CH3CN
N O CH3
60°C
CH3 N Rh N Cl CH3
Abbildung 1.12: Decarboxylierung nach Crabtree
Weiterhin ist es auch möglich, mithilfe von Isobutylchlorformiat (IBCF) aus sterisch gehinderten Imidazoliumsalzen (z.B. R = Mes) eine Ausgangsverbindung herzustellen, die ähnlich dem Imidazoliumcarboxylat reagiert (Abb. 1.13).[41] Das Imidazoliumsalz wird mit NaH deprotoniert und dann direkt mit IBCF bei 0°C zum 2-Ester-Addukt umgesetzt. Dieses reagiert ebenfalls mit µ-Halogenkomplexen zu NHC-Komplexen.
Mes N N Cl Mes
+ Cl
O
NaH, CH3CN
Mes O N
0°C, RT
N O Mes
O
Abbildung 1.13: Synthese von IBCF-Addukt
9
Cl
Einleitung Prinzipiell lässt sich also das Konzept des Carboxylat-Adduktes über das des N,N’-DimethylAddukts erweitern, sofern nicht Nebenreaktionen mit den Seitenketten durch die Base NaH auftreten können. Der in Abb. 1.13 dargestellte Ester ist stabil und kann als NHC-Transferreagenz benutzt werden. Da diese Methode nicht luft- und wasserempfindlich ist, scheint es unwahrscheinlich, dass bei der Komplexierung ein freies Carben als Intermediat entsteht.[41, 43] Eine weitere Methode, die nahezu alle funktionellen Gruppen toleriert, wurde von WANG und LIN 1998 entwickelt.[44] Dabei wird das Imidazoliumsalz in Dichlormethan mit Ag2O zum Bis(Carben) Silber-Salz umgesetzt. NHC-Silber-Komplexe sind labile Verbindungen, die als Carbentransferreagenzien eingesetzt werden. Die milden und allgemein übertragbaren Bedingungen haben dieses Verfahren für die Synthese funktionalisierter NHC-Komplexe als Standard etabliert (Abb.1.14, Beispiel für Transmetallierung mit dem µ-Halogenidkomplex Chloro(COD) Rhodium(I)-Dimer).
R1 N
R1 N Ag
N R2
N R2
X AgX
[Rh(COD)Cl]2, CH2Cl2 MS
R1 N Rh N R2
Cl
Abbildung 1.14: Transmetallierung von einem NHC-Silber-Komplex durch [Rh(COD)Cl]2.
10
Einleitung
1.6 Transmetallierung mit NHC-Silber(I)-Komplexen
Vor dem Jahr 2000 waren nur einige wenige NHC-Silber-Komplexe bekannt.[19,
45]
Erst
nachdem WANG und LIN 1998 ein Verfahren zur Transmetallierung mit NHC-SilberKomplexen publizierten, hat sich die so genannte Silber-Carbenroute als Hauptverfahren zur Synthese von funktionalisierten Carbenkomplexen durchgesetzt.[44] Es gibt mehrere Methoden, NHC-Silber-Komplexe zu synthetisieren. Ausgehend vom freien Carben kann durch Zugabe von AgOTf oder AgX (X = Halogen) das Silber-Carben erhalten werden.[38] In situ Deprotonierung der Imidazoliumsalze mit milden basischen Silbersalzen, wie Ag2O, Ag2CO3 und Ag(OAc)2/Na2CO3, ist jedoch die weitaus häufiger verwendete Methode.[38, 46] Die Vorteile dieses Verfahrens liegen auf der Hand: 1) Schutzgas
und
wasserfreie
Lösemittel
sind
nicht
erforderlich,
außer
das
Imidazoliumsalz selber ist empfindlich. 2) Es wird keine zusätzliche Base benötigt. 3) Die Deprotonierung erfolgt ausschließlich am C2-Kohlenstoff des Imidazoliumringes. 4) Toleranz nahezu aller funktioneller Gruppen und anderer azider Protonen durch die Silbersalze (endständige Alkine und Carbonsäuren gehen allerdings Nebenreaktionen ein). Punkt 4 unterstreicht deutlich die Sonderstellung der NHC-Silber-Komplexsynthese. Mit ihr sind nun auch Komplexe mit funktionellen Gruppen wie z.B. Estern oder primären Aminen zugänglich, die unter den stark basischen Standardmethoden nicht darstellbar wären.[47, 48] Bei Verwendung von stöchiometrischen Mengen an Ag2O lässt sich die Reaktion gut durch das Verschwinden des schwarzen, in CH2Cl2 unlöslichen Silbersalzes verfolgen.[49] Die NHC-Silber-Komplexe liegen in Lösung nicht als eine einzelne Spezies vor. Vielmehr unterliegen sie einer stetigen Fluktuation zwischen kationischen Komplexen mit Silbersalzaddukten und monomeren Silbercarbenen (vgl. Abb. 1.15).[38, 50]
11
Einleitung
R1 N
R1 N
N R R1 R N 2 1 N Ag Br Ag N Br R2
Ag N N R2 R2 Br Ag Br
R1 N 2
Ag Br N R2
Abbildung 1.15: Angenommenes Gleichgewicht der NHC-Silber-Komplexe in Lösung.
Die in Abbildung 1.15 dargestellten Strukturen stellen allerdings nur einen kleinen Ausschnitt an möglichen Strukturen dar. Welcher Typ von Silbercarben vorliegt, ist einerseits abhängig vom Halogen selber und andererseits von den Seitenketten an der Imidazoleinheit.[51] Eine gute Übersicht dazu bietet auch der sehr ausführliche Review von YOUNGS und GARRISON.[52] Die Labilität der Silber-Carbenkohlenstoffbindung spiegelt sich im wieder. Die erwartete
13
13
C NMR-Spektrum
C-107,109Ag-Kopplung wird nicht beobachtet, was das fluktuierende
Verhalten in Lösung zwischen der neutralen und der ionischen Spezies unterstreicht.[53] Aufgrund dieses Befundes wurde unter anderem angenommen, dass Silbercarbene die idealen Carbentransferreagenzien darstellen würden,[54] was die Vielzahl der Veröffentlichungen, die sich der Silbertransfermethode bedienen, unterstreicht.[53, 55-57]
12
Einleitung
1.7 Ausgewählte NHC-Komplexe mit unterschiedlichen Anwendungen
Seit ihrer Entdeckung haben sich NHC als Standardliganden in der organischen Katalyse etabliert.[58, 59] Eine schier unglaubliche Anzahl von NHC-Komplexen wird aktuell hergestellt und es scheint für jedes Syntheseproblem einen maßgeschneiderten NHC-Komplex zu geben. Zu den bekanntesten Vertreter dieser Komplexklasse ist sicherlich der Grubbs-Katalysator (1st und 2nd Generation, Grubbs-Hoveyda-Katalysator) zu zählen, der hauptsächlich als Metathesekatalysator verwendet wird.[60]
N
N
N
Cl Ru Cl Cy3P
N
Cl Ru Cl O
Abbildung 1.16: Grubbs 2nd Generation- (links) und Grubbs-Hoveyda 2nd GenerationKatalysator(rechts)
Carben-Komplexe werden auch auf ihre Eignung als photoaktive Substanzen,
[61]
antibakteriellen Eigenschaften und Antitumor-Aktivität untersucht.[62, 63]
O S N O
N N
N N
N Cl
Pd
O N S O
Abbildung 1.17: Fluorophor-NHC-Komplex[61]
13
N
auf ihre
Einleitung Die Dansylgruppen der Liganden des in Abbildung 1.17 dargestellten Komplexes werden in der Gruppe von PLENIO aktuell dazu genutzt, katalytische Prozesse zu verfolgen, da sich bei Komplexierung das Fluoreszenzsignal verändert. Man erhofft sich so tieferen Einblick in die Natur der Palladiumkatalyse. Weiterhin ist die Fluoreszenz auch dazu geeignet, Restspuren des Katalysators im Produkt zu detektieren.[61] Die Gruppe um MELDAL beschäftigt sich mit festphasen-gebundenen, optisch-aktiven Peptid-NHC-Palladiumkomplexen
zur
Kupplung.[64,
Festphasensynthese
65]
Durch
die
Suzuki-Cross-Kupplung
und
können
Sonogashira-
Ligandenbibliotheken
unterschiedlicher NHC-Peptidkomplexe hergestellt werden, und in einem ScreeningVerfahren
auf
Katalysatoreigenschaften
untersucht
werden.
In
der
Gruppe
von
GILBERTSON wurde der erste bekannte NHC-Ruthenium-Peptidkomplex hergestellt, allerdings wurde als Beweis für die Existenz der Verbindung nur das Auftreten zweier neuer Signale im NMR-Spektrum angegeben; eine vollständige Charakterisierung wurde nicht durchgeführt.[66] Abgesehen von diesen beiden Gruppen steckt die Chemie der NHCPeptidkonjugate als Komplexliganden noch in den Anfängen. Ein interessantes Beispiel für ein Carbenbiokonjugat ist das Carben-Analogon von Auranofin. Auranofin ist eine Organogoldverbindung die als antirheumatischer Arzneistoff zur Basistherapie von chronisch fortschreitender Polyarthritis eingesetzt wird (Abb. 1.18).
H OAc AcO AcO
H H
OAc H
S Au N R
O
N
N
N
X
O
N
X = OSO2CH3. PF6 H OAc
N Rh N
N
Ag
Auranofin
O
O
N
N
N
Au PEt3
R = Me, iPr, n-Bu, tBu, Cy
N
O
O
R N
HO
N
PF6
SOC2H5
HO
AcO AcO
H H
OAc Cl Cl
O N
N
N Au
Ir
N
N O
S O
Abbildung 1.18: Biokonjugate von Carbenkomplexen
Bei Auranofin befindet sich anstelle des Carbenliganden das isolobale Triethylposphan als Ligand (2,3,4,6-Tetra-O-acetyl-1-thio-β-D-glucopyranosato(triethylphosphan) Gold(I)). Das 14
Einleitung Zuckermolekül ist über eine Thiolfunktion an das Goldzentrum gebunden. Die Auranofinanalogen Carbenkomplexe zeigen antimitochondriale Aktivität, was sie potentiell interessant für die Krebsforschung macht.[67] Ein weiterer Carbenkomplex, der als Substituenten am Stickstoffatom des Imidazol ein Zuckermolekül enthält, wurde von NISHIOKA et al. hergestellt.[68] Dabei wurde die anomere OH-Gruppe des Zuckers durch ein Bromatom substituiert. Das so erhaltene Bromalkylderivat reagierte mit Methylimidazol unter N-Alkylierung zum Imidazolium-Zuckerderivat. Zwei weitere bemerkenswerte NHC-Biokonjugate sind das Silbersalz und ein RhodiumCyclooctadien-DMSO-Komplex von Koffein (Abb. 1.18).[69] Ein weiteres interessantes GoldCarbenbiokonjugat mit Saccharin wurde von NOLAN et al. synthetisiert.[70] Die DNABindungseigenschaften und die Eignung als potentielles Chemotherapeutikum werden derzeit untersucht. Dies lässt auf zahlreiche weitere Carbenkomplexe von Naturstoffen und Vitaminen hoffen, da viele Imidazol- oder Thiazoleinheiten enthalten, wie z. B. die Aminosäure Histidin oder Vitamin B1, das bereits als N-alkyliertes Thiazoliumsalz vorliegt (Abb. 1.19). Von Vitamin B1 gibt es z.B. bisher nur Palladium-Komplexe, die über den Schwefel komplexiert sind und keine Carbenkomplexe.
NH2
NH2
N
O
N
OH
N
N S
NH OH
Abbildung 1.19: Aminosäure Histidin (links) und Vitamin B1 (rechts).
1.8 Metalle in der Medizin
In der Medizin haben sich metallorganische Verbindungen sowohl zur Diagnostik,[71] als auch zur Behandlung von Tumoren etabliert.[72-74] Das bekannteste Antitumortherapeutikum ist dabei sicherlich Cisplatin. ROSENBERG untersuchte 1965 die Wirkung von Cisplatin auf die Zellteilung von E. coli-Bakterien.[75] 15
Einleitung 1969 wurden die Antitumoreigenschaften von Cisplatin publiziert und seit 1978 ist es als Medikament zugelassen.[76,
77]
Allerdings weisen viele Tumore bereits Resistenzen auf und
Cisplatin selber besitzt eine Reihe von Nebenwirkungen. Daher wurden neue, nicht-Platinbasierte Verbindungen entwickelt.[78] Gute Eignung besitzen dabei insbesondere Rutheniumbasierte Verbindungen.
NH
N Cl Cl Ru Cl Cl N HN
HN
H N
H N N H
O Cl Cl
S Ru N
Cl Cl
NH
KP1019
NAMI-A
Cl Cl
P Au Cl
Ru P N
RAPTA-C
N N
Triethylphosphin-AuCl
Abbildung 1.20: Metallkomplexe mit Antitumoreigenschaften.
Gute Wirksamkeit gegen Metastasen zeigten Rutheniumverbindungen,[74] wie z.B. NAMI-A und KP1019.[79-83] Zudem wird NAMI-A von Patienten in klinischen Studien gut toleriert und weist nur eine geringe Zytotoxizität auf das gesunde Körpergewebe auf.[84, 85] Ein weitere Verbindungsklasse sind die so genannten RAPTA-Komplexe (Ruthenium-ArenPTA–Komplexe; pta = 1,3,5-Triaza-7-phosphaadamantan). RAPTA-C ist ein RutheniumHalbsandwichkomplex, der nicht nur gegen Metastasen aktiv ist,[86] sondern auch gegen primäre Tumore wie Eierstockkrebs.[87] Zusätzlich ist RAPTA-C auch aktiv gegen Cisplatinresistente Zelllinien.[88] Weitere potentielle Zytostatika sind Verbindungen der Metalle Gallium, Titan, Eisen und Cobalt.[72] Des Weiteren wird auch aktiv geforscht an Verbindungen der Münzmetalle. Silberund Kupferverbindungen weisen häufig gute antimikrobiale Eigenschaften auf.[47, 62] In den letzten Jahren hat sich jedoch gezeigt, dass metallorganische Phosphin- und Nheterozyklische Carbenkomplexe von Gold interessante Antitumoreigenschaften besitzen, wie z.B. Triethylphosphin-Gold Chlorid oder Auranofin (vgl. Abb.1.18, 1.20).[89] Von BERNERS-PRICE wurden die antimitochondrialen Eigenschaften lipophiler, kationischer NHC-Goldkomplexe in Hinblick auf ihre Fähigkeit, Apoptose zu induzieren, untersucht (ausgewählte Komplexe in Abb. 1.21).[90] Dies steht aktuell im Fokus der Forschung.[62, 90-93] 16
Einleitung Ein vielversprechender Therapieansatz untersucht dabei das Phänomen, daß Tumorzellen erhöhte Plasma- und Mitochondrialmembranpotentiale, im Vergleich zu normalen Zellen, aufweisen.[94] Dies wird genutzt, um gezielt lipophile Kationen in den Mitochondrien von Tumorzellen anzureichern, um so Apoptose zu induzieren.[90, 95] Von Goldcarbenkomplexen gibt es derzeit noch keine zugelassenen Therapeutika.
2
N
N N
N Au
N
N
Cl
Au N
N
N
N
Au N
N
2 Br
Abbildung 1.21: Kationische NHC-Goldkomplexe mit antimitochondrialen Eigenschaften
17
Aufgabenstellung
2. Aufgabenstellung
Ziel dieser Arbeit ist es, eine allgemein nutzbare Syntheseroute für funktionalisierte, unsymmetrische NHC-Komplexe zu entwickeln, die geeignet sind für die Konjugation von Biomolekülen in Lösung oder an der festen Phase. Die Stabilität und Eignung unterschiedlicher Übergangsmetall-NHC-Komplexe werden hierzu unter Festphasenbedingungen evaluiert. Als Ligandensystem wurden das von Imidazol abgeleitete NHC ausgewählt, da das Strukturmotiv auch in der Aminosäure Histidin vorkommt (vgl. Abb. 1.19). Man kann NHCKomplexe somit als künstliche Histidinkomplexe beschreiben. Des Weiteren wurde die künstliche Aminosäure Thiazolylalanin ausgewählt, um sowohl Imidazolyl- als auch Thiazolylkomplexe herzustellen. Die NHC-Komplexe sollen alle spektroskopisch analysiert und ihre Besonderheiten herausgestellt werden. Es sollen NHC-Ruthenium-Analoga bekannter Phosphan-Metallkomplexe hergestellt, um den Einfluß des NHC-Liganden auf die biologische Aktivität auf humanen Tunorzelllinien zu untersuchen (vgl. RAPTA-C, Abb. 2.1). Dazu werden Ruthenium-p-Cymene-Komplexe synthetisiert. Zusätzlich sollen noch lineare NHC-Gold-Komplexe hergestellt werden, um diese ebenfalls auf zytotoxische Eignung zu untersuchen, da kationische Goldcarbene, sowie einige Phosphan-Goldkomplexe biologische Aktivität zeigen (vgl. Abb.1.18, 1.21). Zusätzlich soll das Synthesepotenial auf andere Metalle erweitert werden.
Cl Cl
Cl
Ru P N
N N
R2 N
Ru
Cl R1
R N Au X N R
N
Et3P Au Cl
X = Cl, Br, Br3, S-Peptid
Abb. 2.1: Ersatz des Phosphanliganden des RAPTA-C (links) und von einem Gold-Phosphankomplex (rechts) durch einen NHC- Liganden.
18
Synthese der Imidazoliumsalze
3. Synthese der Imidazoliumsalze
Die unsymmetrisch substituierten Imidazoliumsalze wurden nach folgenden Gesichtspunkten aufgebaut: Der Rest R1 sollte ein unfunktionalisierter Alkyl- oder Arylrest sein, wohingegen am Rest R2 eine funktionelle Gruppe vorhanden sein sollte, die weitere Kopplungsreaktionen zulässt, um einen monofunktionalisierten Carbenkomplex zu erhalten. Die eingeführte funktionelle Gruppe sollte allerdings nicht in späteren Komplexierungsreaktionen unerwünschte Nebenreaktionen eingehen können. Dies
limitiert
die
Einführung
der
funktionellen
Gruppen
und
die
Wahl
der
Komplexierungsmethoden bereits erheblich.
R1 N Br
R1 = Me, iPr, tBu, -CH(Ph)2 R2 =
n
X = Br, I
N R2 H CO2CH3 CO2H
Pfp =
F
F
F
F
CO2Pfp X n = 0, 1
F
Abbildung 3.1: Schematische Übersicht der funktionalisierten unsymmetrischen Imidazoliumsalze.
Als funktionelle Gruppen für die anschließende Kopplung von Biomolekülen stehen Carbonsäuren zur Auswahl, die mit einem primären Amin basenvermittelt zu einer Peptidbindung kondensieren, wobei Wasser abgespalten wird. Weiterhin gibt es die Möglichkeit, mithilfe eines Enzyms (PeptiCLECTM, ALTUS BIOLOGICS INC.) eine Peptidbindung zwischen einem primären Amin und einem Carbonsäuremethylester aufzubauen. Dieser Katalysator bewirkt die Abspaltung des Methylesters bei gleichzeitig nukleophilen Angriff der freien Aminogruppe. PeptiCLECTM
19
Synthese der Imidazoliumsalze (CLEC Cross Linked Enzyme Crystals) besteht aus vernetzten Mikrokristallen einer Serin Endoprotease (Subtilopeptidase A) aus Bacillus licheniformis. Der Vorteil dieser Reaktion liegt in den milden Reaktionsbedingungen (37°C).[96] Eine weitere Möglichkeit der Peptidbindungsknüpfung bietet die Einführung eines Aktivesters (Abb. 3.2). Pentafluorphenylester (Pfp) werden häufig in der Peptidsynthese eingesetzt.[97] Die Voraktivierung durch entsprechende Reagenzien, wie es bei Carbonsäuren nötig ist, entfällt. Die Pfp-Gruppe wird durch die Reaktion der Carbonsäure mit Pentafluorphenol
in
einer
DCC-vermittelten
Veresterung
eingeführt
(Dicyclohexylcarbodiimid).[98]
Br
OH F
F
F
F
+ CO2H
DCC, DMF/EtOAC 0°C, RT
F
O F
F
O
Br 1
F F
F
Abbildung 3.2: Synthese von Pfp-funktionalisierten Bromalkylverbindung 1.
Ein anderer Ansatz für die spätere Kopplung der NHC-Komplexe sind Arylhalogenreste bzw. Alkinreste. Durch Sonogashira-Kopplung zwischen einer Arylhalogenverbindung und einem terminalen Alkin kann ein Peptid- oder eine Aminosäure eingeführt werden (als Alkinkonjugat).[99] Terminale Alkine können weiterhin mit Azido-funktionalisierten Biokonjugaten in einer so genannten „Click“-Reaktion verknüpft werden, wobei Triazoleinheiten entstehen.[100] Beide beschriebenen Kopplungsreaktionen haben den Nachteil, dass sie metallkatalysiert sind und einige Carbenkomplexe mit den eingesetzten Katalysatoren Transmetallierungsreaktionen eingehen können.
20
Synthese der Imidazoliumsalze
3.1 Synthese der N-Alkylierten Imidazole
Neben dem käuflich erworbenen N-Methylimidazol wurden zwei weitere N-alkylierte Imidazole verwendet (Isopropylimidazol und Tert-butylimidazol). Die Synthese von Isopropylimidazol ging von Imidazol aus. Dabei wurde eine Suspension von Kalium in wasserfreiem Toluol unter Erwärmen hergestellt, und das Imidazol portionsweise zugegeben, bis das Reaktionsende durch die vollständige Abreaktion des Kaliums und die Entstehung des Kaliumimidazolats als Niederschlag erreicht war.[101] Durch Umsetzung des Kaliumimidazolats mit 2-Brompropan und anschließender extraktiver Aufarbeitung wurde Isopropylimidazol als gelbes Öl in guter Reinheit erhalten.
H N N
Br K, Toluol
N
reflux - H2
N
K
N reflux
N 2
Abbildung 3.3. Synthese von N-Isopropylimidazol
Die Synthese von Tert-butylimidazol (3) erfolgte durch eine Mehrkomponentensynthese, da tertiäre Alkylhalogenide keine Reaktion mit Kaliumimidazolat eingehen. Daher wurden Tertbutylamin mit Glyoxal, Formaldehyd und Ammoniak in einer Einstufenreaktion zum N-Tertbutylimidazol zyklisiert. Das Produkt wurde mit der Kugelrohrdestille aufgereinigt (vgl. Abb.1.5).[33] Man erhält ein gelbliches Öl mit einer Reinheit > 90% (GC-MS). Alternativ kann auch die Reaktion von Silberimidazolat mit einem Alkylhalogenid zum gewünschten Alkylimidazol verwendet werden. Die Vorteile dieser Methode liegen auf der Hand. Das Silberimidazolat bildet sich direkt an Luft aus einer wässrigen Lösung von Imidazol und Silbernitrat bei Raumtemperatur. Durch Kristallisation bei 4°C erhält man farblose Nadeln. Die Reaktion läuft nahezu quantitativ ab. Man umgeht so sowohl die Verwendung des leicht entzündlichen Metalls Kalium, als auch Schutzgas und wasserfreie Lösemittel. 21
Synthese der Imidazoliumsalze Das Diphenylmethylimidazol wird durch die Reaktion des Silberimidazolats mit Bromdiphenylmethan in Acetonitril bei Raumtemperatur erhalten. Als Nebenprodukt fällt Silberhalogenid an. Das Produkt kann nach Filtration säulenchromatographisch aufgereinigt werden.
H N N
AgNO3 H 2O
N
Ag +
N
Br
- HNO3
Acetontril
N
2 Tage
N
- AgBr
4
Abbildung 3.4: Synthese von Diphenylmethylimidazol 4
Dieses Verfahren kann prinzipiell für alle primären und sekundären Alkylhalogenide verwendet werden. Die Verbindung 4 konnte zwar in guter Ausbeute und Reinheit erhalten werden, jedoch ließ sich kein N,N’-substituiertes Imidazoliumsalz von dieser Verbindung synthetisieren. Der Hauptgrund liegt wahrscheinlich in der äußerst schlechten Löslichkeit von 4 in nahezu jedem organischen Lösemittel. Charakteristisch für N-Alkylimidazole ist das Auftreten von nur einem Signal bei ca. 122 ppm im 13C NMR-Spektrum für die olefinischen Kohlenstoffatome des Imidazolrings.
Abbildung 3.5: 13C NMR von N-Diphenylmethylimidazol 4, ν = 63 MHz.
22
Synthese der Imidazoliumsalze
3.2 Synthese der Arylimidazole
Da sich Arylimidazole nicht durch die bisher beschriebenen Methoden darstellen lassen, wurde ein alternatives Verfahren entwickelt. In der Literatur beschrieben sind Kupferkatalysierte Kondensationen von Brom- oder Iodaromaten. Zusätzlich werden Cs2CO3 und ein Amin als Katalysator benötigt.[32] Nachteilig hierbei ist die relativ geringe Ausbeute und die Notwendigkeit von mehreren Reagenzien. Das in dieser Arbeit verwendete Verfahren bedient sich der Bildung von Natriumfluorid und Wasserstoff als Triebkraft für die Reaktion. Allerdings sind auch hier die Ausbeuten nur moderat (ca. 20%), da der Aromat nicht genug aktiviert ist. Imidazol wird mit 1-Fluor-4iodbenzol oder 1-Fluor-4-brombenzol in wasserfreiem DMF gelöst und mit Natriumhydrid versetzt und für 5 h bei 100°C gerührt.
Nach
Extraktion aus Wasser und
säulenchromatographischer Aufreinigung erhält man die Arylimidazole als weiße Pulver.
X
F
H N
NaH, DMF
+
100°C, 5 h, RT, ü.N.
N
N N
X 5a: X = Br, 26% 5b: X= I, 13%
Abbildung 3.6: Synthese der Arylimidazole 5a und 5b
Im Gegensatz zu den Alkylimidazolen findet sich bei den Arylimidazolen eine Aufspaltung der olefinischen Kohlenstoffatome der Imidazoleinheit im 13C NMR wieder. Das Signal von C4 findet sich tieffeldverschoben bei ca. 131 ppm wieder, wohingegen das Signal für C5 weiter hochfeldverschoben bei 118 ppm erscheint. Dies ist bedingt durch das Bromatom in para-Position zum Imidazol am Aromaten.
23
Synthese der Imidazoliumsalze
Abbildung 3.7: 13C NMR in CDCl3 von 1-(4-Bromphenyl)-1H-imidazol 5a, ν = 63 MHz.
24
Synthese der Imidazoliumsalze
3.3 Synthese von N,N’-substituierten Imidazoliumsalzen
3.3.1 Synthese von N’-substituierten Imidazoliumsalzen mit Methylenbenzoesäure –und Methylenbenzoesäureestern
Die von N-Alkylimidazol (Alkyl = Me, iPr) abgeleiteten Imidazoliumsalze 6a- 7b wurden alle nach Literaturmethoden synthetisiert.[102] Zu einer Lösung des Alkylimidazols in wasserfreiem THF wurde der entsprechende 4-(Brommethyl)-benzoesäureester als Lösung in THF zugetropft und das Gemisch über Nacht unter Rückfluß gehalten. Während der Reaktion fielen die Produkte als weiße Feststoffe aus. Im Falle von 4-(Brommethyl)-Benzoesäure wurden zwei Äquivalente N-Alkylimidazol eingesetzt, um die Protonierung am Stickstoff des Imidazols durch die Carbonsäure abzufangen.
R1 N + N
CO2R2 Br
R1 N
THF, N2 reflux, ü.N.
6a: R1 = Me, R2 = H, 66% 6b: R1 = Me, R2 = Me, 78% 6c: R1 = Me, R2 = Pfp, 78% 7a: R1 = iPr, R2 = Me, 74% 7b: R1 = iPr, R2 = Pfp, 87%
Br
N
CO2R2
Abbildung 3.8: Synthese der Imidazoliumsalzester und –Säuren
Alle Salze wurden vollständig charakterisiert und sind sowohl in Wasser, als auch in den meisten polaren organischen Lösemitteln löslich, mit Ausnahme der Verbindung 6a, die ausschließlich in Wasser, DMSO und leidlich in DMF löslich ist. Exemplarisch für die Verbindungen 6a- 7b ist das 1H NMR-Spektrum von 6b in DMSO-d6 in Abbildung 3.9 dargestellt. Es sind alle charakteristischen Signale des Imidazoliumsalzes auffindbar.
Das
Signal
des
aziden
Protons
der
Imidazoliumeinheit
erscheint
tieffeldverschoben bei δ = 9.31 ppm als breites Singulett. Die Signale der olefinischen Protonen der Imidazoliumeinheit finden sich als Tripletts bei δ = 7.83 und 7.76 ppm wieder. 25
Synthese der Imidazoliumsalze Charakteristisch für Imidazoliumsalze ist die vicinale 3J Kopplung der olefinischen Protonen, typischerweise mit einem Wert um 2 Hz. Für 6b beträgt 3J 1.62 Hz. Bei allen Imidazoliumsalzen wird im Massenspektrum (ESI, positiver Modus) der [M-Br]+Peak als Basispeak gefunden. Dies korreliert mit der Tatsache, dass das Imidazoliumsalz aus einem organischen Kation mit einem Halogenid als Gegenion besteht. Im FAB-MS erscheint der Molekülpeak als Basispeak [M-Br]+. Zusätzlich gibt es noch einen weiteren Peak, der als [2M+Br]+ anhand des Isotopenmusters charakterisiert werden konnte.
Abbildung 3.9: 1H NMR in DMSO-d6 von 6b, ν = 250 MHz.
26
Synthese der Imidazoliumsalze
3.3.2 Synthese von N,N’-substituierten Imidazoliumsalzen mit Arylhalogenidresten
Ausgehend von Verbindungen mit Arylimidazol, wurden die Imidazoliumsalze durch NAlkylierung mit 5 Äquivalenten Methyliodid in wasserfreiem THF hergestellt. Die Substanzen wurden in THF gelöst, kurz geschwenkt und stehen gelassen. In der Literatur wird stattdessen ein 1:1 Gemisch für 48 h unter Rückfluß gehalten.[103] Über einen Zeitraum von zwei Tagen fielen die Produkte als glitzernde Nadeln aus, die durch Filtration abgetrennt werden konnten. Die Produkte 8a und 8b wiesen die charakteristischen Signale für Imidazoliumsalze, sowohl im NMR- als auch im Massenspektrum auf. X
N
X
CH3I, N2, THF
8a: X = Br, 74% 8b: X = I, 74%
N
I
48 h
N
N CH3
Abbildung 3.10: Synthese von 1-Aryl-3-methylimidazoliumiodiden.
3.3.3 Synthese von N,N’-substituierten Imidazoliumsalzen mit Benzylhalogenidresten
Die Synthese der p-Halogen-benzylimidazoliumsalze erfolgte nach den bereits beschriebenen Standardbedingungen.[102] Die erwarteten Signale in den NMR- sowie in den Massenspektren wurden erhalten. 9a und 9b fielen beide als weiße Pulver mit guter bis sehr guter Ausbeute an.
R N X
+ N
Br
R N
THF, N2 reflux, ü.N.
9a: R = iPr, X = I, 69% 9b: R = Me, X= Br, 89%
Br
N X
Abbildung 3.11: Synthese von 1-Alkyl-3-benzylimidazoliumbromid 9a und 9b.
27
Synthese der Imidazoliumsalze
3.3.4 Synthese von N’-substituierten Imidazoliumsalzen durch Propargylbromid
Bei
der
Synthese
des
N’-Alkinsubstituierten
Imidazoliumsalzes
10
musste
das
Standardverfahren zur N’-Alkylierung modifiziert werden. Bei der Umsetzung von Methylimidazol mit Propargylbromid unter Rückfluß zersetzte sich das Produkt und konnte nicht isoliert werden, was sich durch Schwarzfärbung der Lösung bemerkbar machte. Daher wurde die Reaktion bei 30°C durchgeführt, bei ansonsten gleicher Durchführung. Das Produkt fiel hierbei nicht als Feststoff aus, sondern bildete ein bräunliches Öl, das nach mehrmaligem Waschen mit THF und Trocknung am Ölpumpenvakuum als bräunliches, hygroskopisches Pulver erhalten werden konnte. Bei längerer Lagerung an Luft verfärbt sich das Salz allerdings schwarz, daher wurde eine neue Charge unter Luftausschluss gelagert.
CH3 N
THF, N2
+ N
Br
30°C ü.N.
CH3 N Br N
10: 72%
Abbildung 3.12: Synthese des Alkin-funktionalisierten Imidazoliumsalzes 10.
3.3.5
Synthese
von
N’-unfunktionalisierten
und
N’-Ethylesterfunktionalisierten
Imidazoliumsalzen
Die Synthese der N’-Ethylester Imidazoliumsalze und die der unfunktionalisierten Imidazoliumsalze verlief nach Standardmethoden. Die Ethylesterimidazoliumsalze fallen jedoch als gelbliche Öle an, die stark hygroskopisch sind. Daher wurden 11a und 11b unter Ausschluss von Feuchtigkeit aufbewahrt. Verbindung 12 wurde analog 8a und 8b synthetisiert. Allerdings war hier die Ausbeute deutlich geringer. 28
Synthese der Imidazoliumsalze Die NMR- und Massenspektren der Verbindungen 11a – 13 zeigen alle typischen Signale ohne Besonderheiten.
R1 N Br N
O O
O +
Br
1
R N
H3C I
+ N
O
R1 N I
THF, N2 Rückfluß, ü.N.
+
2a: R1 = Me, x% 2b: R1 = iPr, x%
Br
3: R1= Me, x%
N CH3
R1 N Br
4: R1 = Me, x%
N
Abbildung 3.13: Synthese unfunktionalisierter und Ethylester-funktionalisierter Imidazoliumsalze.
29
Synthese der Imidazoliumsalze
3.4 Synthese von N-Methyl-Imidazoliumpeptiden
Anstelle eines funktionalisierten Alkylhalogenids, das später mit einer Aminosäure oder Peptid gekoppelt wird, kann die „Biokonjugation“ auch durch direkte N-Alkylierung von Alkylimidazolen erfolgen. In dieser Arbeit wurden dazu Methyl- und Tert-Butylimidazol als Ausgangssubstanzen verwendet. Der Versuch, Verbindung 4 zu funktionalisieren (Diphenylmethylimidazol), erbrachte keine Umsetzung. Es wurden nur die Edukte zurück gewonnen. Um eine Aminosäure oder Peptid direkt durch N-Alkylierung zum Imidazoliumsalz umzusetzen, muss ein Alkylhalogenid in die Peptidsequenz eingeführt werden. Dies geschah durch die Kopplung von Bromessigsäure mit Aminosäuren und Peptiden unter Ausbildung einer Peptidbindung. Alternativ kann auch Chloressigsäure verwendet werden.
3.4.1 Peptidsynthese in Lösung
Eine Peptidbindung wird allgemein geknüpft zwischen einer freien Säure und einer Aminogruppe unter Abspaltung von Wasser. Das
gängigste
Verfahren
ist
die
Carbodiimid-
Methode
mit
Reagenzien
wie
Dicyclohexylcarbodiimid (DCC)[104] oder 1-(3-(Dimethylamino)propyl)-3-ethyl-carbodiimid Hydrochlorid (EDC).[105] Für die Peptidsynthese in Lösung hat sich die Mischanhydrid-Methode mit dem Kopplungsreagenz IBCF bewährt.[96] Die Nebenprodukte lassen sich abfiltrieren, bzw. im Ölpumpenvakuum entfernen und die Reaktion verläuft nahezu quantitativ. Letzteres Verfahren wurde in dieser Arbeit für die Peptidsynthese in Lösung standardmäßig verwendet (vgl. Abb. 3.14). Bromessigsäure wurde in THF gelöst und mit N-Methylmorpholin (NMM) und IBCF aktiviert. Dazu wurde Phenylalaninmethylester Hydrochlorid gegeben, dessen Aminogruppe durch Zugabe von NEt3 aus dem Ammoniumhydrochlorid freigesetzt wurde. Man erhält nach
30
Synthese der Imidazoliumsalze Aufarbeitung Bromacetylphenylalaninmethylester (14) in guten Ausbeuten und hoher Reinheit. Bromacetyl-Leu-Phe-OMe (16c) wurde aus dem Dipeptid Boc-Leu-Phe-OMe hergestellt. Die Boc-Gruppe des Leucins wurde mittels 50% TFA Lösung in DCM abgespalten und das so erhaltene TFA-Salz mit NEt3 freigesetzt und ebenfalls mit voraktivierter Bromessigsäure zu 16c umgesetzt.
NMM
O OH
Br
+
O
N
O
O O
Br
Cl
O N
IBCF
O Cl
+
H2N
OCH3
O
H
H N
Br
O
O
O
OH OCH3
+
CO2
+
O
14
Abbildung 3.14: Mischanhydrid-Synthese von Peptide 14.
3.4.2 Methyl- und Tert-butylimidazolium-Peptidsalze
Die Synthese der Methyl- und Tert-butylimidazolium-Peptidsalze erfolgte analog der unter 3.3.1 und 3.3.3 beschriebenen Methode. Im Unterschied zu der bisherigen Synthese fällt hier das Produkt nicht im Verlauf der Reaktion aus. Daher musste nach beendeter Reaktion das THF unter vermindertem Druck entfernt werden. Der Rückstand wurde dann mit Pentan oder Ether mehrmals gewaschen und am Ölpumpenvakuum getrocknet. In allen drei Fällen wurden die Produkte als gelbliche, hygroskopische Pulver erhalten, die bei Kontakt mit Luftfeuchtigkeit sofort eine klebrige Masse bildeten. Daher wurden sie unter Ausschluss von Feuchtigkeit aufbewahrt.
31
Synthese der Imidazoliumsalze
R N
O +
Br
N H 14
N
OCH3
THF, N2
R N Br
reflux, ü.N.
N
O
O
15a: R = Me, 47% 15b: R = tBu, 46%
HN OCH3
R N
O + Br
N
N H
H N O
R N Br
O OCH3
O
THF, N2
O
reflux, ü.N.
N
N H
H N
O OCH3 17: R = tBu, 46%
O
16c
Abbildung 3.15: Synthese der Imidazoliumpeptidsalze durch N-Alkylierung von Alkylimidazol mit Bromacetylpeptidkonjugaten
Die Imidazoliumpeptidsalze wurden alle vollständig analysiert. Im Massenspektrum (ESIpos.) wurde der erwartete einfach positiv geladene [M-Br]+-Peak als Basispeak für alle Salze gefunden. Die NMR-Spektren zeigten alle erwarteten Signale. Exemplarisch ist hier das 1H NMRSpektrum von 15b dargestellt (Abb. 3.16). Das Signal des aziden Imidazoliumprotons (N=CH-N), erscheint tieffeldverschoben bei δ = 9.36 ppm. Die beiden olefinischen Protonen des Imidazolrings (N-CH=CH-N) zeigen jeweils ein Signal mit Triplettstruktur bei δ = 8.03 ppm und δ =7.68 ppm. Die vicinale 3J Kopplung zwischen den olefinischen Protonen beträgt 1.78 Hz. Die NHGruppe der Peptidbindung weist ein Dublett bei δ = 9.16 ppm auf, mit einer 3J Kopplung von 7.57 Hz. Die beiden Hβ,Phe sind chemisch nicht äquivalent, daher kommt es zusätzlich zur vicinalen 3J Kopplung auch zu einer geminalen 2J Kopplung. Daher erscheint das Signal als Dublett von Dubletts von Dubletts (ddd). Die Karplus-Kurve beschreibt die Abhängigkeit der vicinalen Kopplungskonstante 3J vom Torsionswinkel. 3J ist am kleinsten bei einem Winkel von 90° und am größten bei 0° und 180°.[106, 107] Für das im 180°-Winkel zu Hα,Phe stehende Hβ,Phe,1 findet man daher eine 3J Kopplung von 8.5 Hz und für das im 90°-Winkel zu Hα,Phe stehende Hβ,Phe,2 eine 3J Kopplung von 5.9 Hz. Die geminale Kopplung von Hβ,Phe beträgt 13.74 Hz. Anhand der Kopplungskonstante kann man
32
Synthese der Imidazoliumsalze das tieffeldverschobenere dd dem 90°-ständigen Hβ,Phe zuordnen. Das Signal für das Hα,Phe erscheint durch die chemisch nicht äquivalenten Hβ,Phe- Protonen als Dublett von Tripletts.
Abbildung 3.16: 1H NMR von 15b in DMSO-d6, ν = 250 MHz.
3.4.3 Methyl-Imidazolium-Pseudoenkephalin durch SPPS
Da der sequenzielle Aufbau von Peptiden über eine Anzahl von mehr als zwei Peptidbindungen in Lösung ein sehr aufwendiges Verfahren ist, wurde für die Darstellung des Methyl-Imidazolium-Pseudoenkephalins die Festphasenpeptidsynthese gewählt. Durch die Entwicklung der Festphasenpeptidsynthese (Solid Phase Peptide Synthesis, SPPS) vom Nobelpreisträger Robert Bruce MERRIFIELD im Jahr 1963, erfolgte ein Durchbruch in der Synthese von artifiziellen Peptiden.[108] Dabei wird sukzessive die gewünschte Sequenz an Aminosäuren, unter Verwendung der Fmoc-Strategie, aufgebaut. Als Trägermaterial dient ein Harz, an das über einen Linker die 33
Synthese der Imidazoliumsalze Fmoc-geschützten Aminosäuren C-terminal gekoppelt werden. Durch Abspalten der FmocSchutzgruppe mittels 20% Piperidin in DMF und erneute Kopplung der nächsten Aminosäure an den N-Terminus der harzgebundenen Aminosäure, erfolgt der Aufbau der Peptidsequenz. Die Abspaltung von der festen Phase erfolgt durch die für den jeweiligen Linker geeigneten Reagenzien, zumeist eine Lösung von Trifluoressigsäure (TFA) in DCM. Vorteil dieser Methode ist der geringe Zeitaufwand und die einfache Handhabung. Eine genaue Beschreibung der Fmoc-Festphasensynthese findet sich im Buch von CHAN und WHITE.[109] Enkephaline gehören zu den Endorphinen. Strukturelle Gemeinsamkeit aller Endorphine ist die gleiche Sequenz der ersten 4 N-terminalen Aminosäuren Tyr-Gly-Gly-Phe.[110,
111]
Sie
dient als Erkennungssequenz für bestimmte Rezeptoren.[110] Desweiteren können Enkephaline die Blut-Hirn-Schranke überwinden,[111] was auf ihre Lipophilität zurückzuführen ist. In unserem Fall wurde anstelle des Tyrosins die Methyl-Imidazoliumsalze 6a und 6c in die Sequenz integriert. Beide haben eine Carbonsäure bzw. einen Aktivester als geeignete funktionelle Gruppe zum Aufbau einer Peptidbindung. Das für die Rezeptorbindung wichtige Tyrosin ist in dieser Verbindung nicht mit eingeführt, da es nur als Modellverbindung dienen sollte. Es wurden die Harze H-Leu-2-Cl-Trt (Trityl) und Sieber Amid ausgewählt. Im ersten Falle erhält man nach Abspaltung von der festen Phase die freie Säure am C-Terminus, im zweiten Fall ein Amid. Die Aminosäuren wurden nach dem Fmoc-Standardprotokoll gekoppelt. Die Imidazoliumsalze 6a bzw. 6c wurden ü.N. gekoppelt, um eine vollständige Umsetzung zu gewährleisten. Die Wahl des Aktivesters oder der freien Säure spielten für das Endprodukt keine Rolle, allerdings war die Löslichkeit von 6a in DMF bedeutend schlechter als für 6c. Beide Imidazoliumpeptide wurden vollständig analysiert. Im Falle 18 musste das Produkt mittels präparativer RP-HPLC aufgereinigt werden. Die Ausbeute betrug in beiden Fällen ca. 70% (Abb.3.17).
34
Synthese der Imidazoliumsalze
O
FmocHN
H2N O
O Cl
O
SPPS (4 steps)
N
N
F
Br
SPPS (4 steps)
Br
F N
F
N
F O
HOBt*H2O, TBTU, DIPEA
HOBt*H2O
CO2H
F
O 6a
6c N
N Br
N
N
Br
O
HN-Gly-Gly-Phe-Leu NH
HN-Gly-Gly-Phe-Leu Cl O
O O
1% TFA, CH2Cl2
2% TFA, CH2Cl2 N
N Br
Br
N
N H N O
O N H
H N O
O N H
H N
OH O
O
18
O N H
H N O
O N H
NH2 O
19
Abbildung 3.17: Festphasenpeptidsynthese von Methyl-Imidazolium-Pseudoenkephalin-(OH) 18 und Methyl-Imidazolium-Pseudoenkephalin-(NH2) 19. Verwendet wurden die Harze 2-Cl-Trt (links) und Sieber Amid (rechts).
In Abbildung 3.18 ist das 1H-NMR von 18 exemplarisch dargestellt. Alle erwarteten Signale konnten zugeordnet werden. Die Signale der Imidazoliumeinheit werden als breites Singulett (N=CH-N) und als Tripletts für die olefinischen Imidazoliumprotonen im erwarteten ppmBereich gefunden.
35
Synthese der Imidazoliumsalze
Abbildung 3.18: 1H NMR von 18 in Acetonitril-d3, ν = 400 Hz (COOH Signal durch H/ D-Austausch nicht vorhanden).
Die Retentionszeiten in der analytischen RP-HPLC betrugen tR = 13.47 min für 18 und tR = 12.96 min für 19, da die Carboxylgruppe deutlich lipophiler ist als das entsprechende Carboxamid. Vergleicht man die Retentionszeiten mit den Werten für Ac-Enk-OH und AcEnk-NH2, so weisen die Imidazolium-Pseudoenkephaline eine verlängerte Retentionszeit um etwa 1 Minute auf.[112] Dies spricht für eine leicht erhöhte Lipophilie, hergerufen durch das fehlende Tyrosin in der Peptidsequenz, das mit seiner Hydroxylgruppe hydrophile Eigenschaften mitbringt.
36
Synthese der Imidazoliumsalze
3.4.4 Thiaozolium-Peptide als Ligandenprekursoren
Versuche, N,N’-substituiertes Histidin herzustellen, blieben ohne großen Erfolg Die Ausbeute lag bei allen Experimenten nach Aufreinigung unter 5%, so dass auf weitere Versuche verzichtet wurde. Als Hauptproblem stellten sich hierbei die Einführung geeigneter Schutzgruppen
und
die
damit
einhergehenden
Löslichkeitsprobleme,
bzw.
Aufreinigungsprobleme heraus. Daher wurden stattdessen Azoliumsalze von der künstlichen Aminosäure Thiazolylalanin hergestellt. In der Literatur sind zahlreiche Carbenkomplexe von Thiazoliumsalzen bekannt.[113] Sie lassen sich analog der NHC-Komplexe, ausgehend von Imidazoliumsalzen, herstellen. Carbenkomplexe ausgehend von der künstlichen Aminosäure Thiazolylalanin sind bisher nicht beschrieben worden. Thiazolylalanin ist strukturell eng verwandt mit Histidin. Anstelle der NH-Gruppe ist hier jedoch ein Schwefelatom im Heterozyklus vorhanden. Dies bedingt, dass nur NAlkylierungen möglich sind. S-Alkylierung tritt nicht auf, da die Elektronendichte am Stickstoff höher ist als am Schwefel und der Thiazolring ansonsten seine Aromatizität verlieren würde.[114]
N
HN
S
N NH2
H2N
CO2H
HO2C
Abbildung 3.19: Vergleich von Thiazolylalanin mit Histidin.
Die Biokonjugation von Aminosäuren oder Peptiden mit Thiazolylalanin kann in diesem Fall direkt an der freien Säuregruppe erfolgen; d.h. es müssen keine funktionellen Gruppen im Alkylhalogenid vorhanden sein. Um Nebenreaktionen auszuschließen, wurde die N-terminal geschützte Boc-Aminosäure verwendet.
37
Synthese der Imidazoliumsalze Die Peptide 20a und 20b wurden mittels der Mischanhydridmethode hergestellt (vgl. 3.4.1). Nach Aufarbeitung und Lyophilisierung lagen 20a und 20b als gelbliche Pulver in guter Ausbeute
vor.
Die
N-Alkylierung
erfolgte
nach
einer
leicht
veränderten
Literaturvorschrift.[115] Dabei wurden die Thiazolylalanin-Peptide in einer geringen Menge wasserfreien Acetonitril gelöst und mit Ethylbromid (1 mL/ 100 mg Substanz) für 60 h bei 90°C in einem Schlenkrohr gerührt. Anschließend wurde die Mischung direkt auf eine Kieselgelsäule geladen und mit Ethylacetat/Pentan (Abtrennung des überschüssigen Ethylbromids), gefolgt von DCM/MeOH (1-15% MeOH) aufgereinigt. Nach erneuter Lyophilisierung konnten die Azoliumsalze in moderater Ausbeute als orange-weiße, stark hygroskopische Pulver erhalten werden.
Br S
N S
O N Boc NH
O
NH
+
Br
Acetontril, N2 60 h, reflux
Boc NH
NH
CO2CH3
CO2CH3
20a: 77%
21a: 33% Br
S
O N Boc NH
N
NH O
+
Br
S
Acetontril, N2
O
60 h, reflux Boc NH
HN H3CO2C
NH O HN
H3CO2C 20b: 61%
21b: 31%
Abbildung 3.20: Synthese der Thiaozoliumeptide 21a und 21b.
38
Synthese der Imidazoliumsalze Die Verbindungen 20-21 wurden alle vollständig charakterisiert. Für die Peptide 20a und 20b findet man in ESI-MS (pos. Modus) den einfach positiv geladenen [M+Na]+ als Basispeak. Im NMR-Spektrum finden sich alle erwarteten Signale. Die Azoliumpeptide 21a und 21b weisen im ESI-MS (pos. Modus) den [M-Br]+-Peak als einziges Signal auf. Dies korreliert mit den Befunden für Imidazoliumsalze (Abschnitt 3.4.2). Im NMR-Spektrum konnten alle Signale zugeordnet werden. Exemplarisch sind hier die 1H und 13C NMR- Spektren von 21a in CDCl3 abgebildet.
Abbildung 3.21: 1H und 13C NMR von 21a in CDCl3, ν = 250 MHz (1H), ν = 63 MHz (13C).
39
Synthese der Imidazoliumsalze Im 1H NMR-Spektrum erscheint das azide Azoliumproton (N=CH-S) stark tieffeldverschoben bei 10.6 ppm, das C=CH-S-Proton bei 8.15 ppm. Die
4
J Kopplung zwischen den
Azoliumprotonen beträgt 2.25 Hz. Die restlichen Signale erscheinen alle in den für die einzelne Aminosäure üblichen Verschiebungen. Das Signal für das Proton H-20 (N-CH2-CH3) erscheint relativ tieffeldverschoben bei ca. 4.75 ppm. Dies ist ebenfalls typisch für NAlkylprotonen α-ständig zum Stickstoff. Im 13C NMR-Spektrum findet sich das Signal für C-2 (N=CH-S) stark tieffeldverschoben bei ca. 145 ppm, wohingegen das Signal für C-4 mit ca. 125 ppm im Bereich der olefinischen Imidazoliumkohlenstoffe aufzufinden ist. Das Signal für C-20 (N-CH2-CH3) findet sich bei ca. 51 ppm, was ebenfalls der erwarteten Verschiebung für N-Alkylgruppen entspricht.
3.5 Zusammenfassung
Imidazoliumsalze, ausgehend von verschiedenen Aryl- und Alkylimidazolen, konnten durch N-Alkylierung
des
zweiten
Imidazolstickstoffes
mittels
Halogenalkylverbindungen
erfolgreich synthetisiert werden. Somit steht eine breite Palette an Ligandenprekursoren mit funktionellen Gruppen zur weiteren Modifizierung zur Verfügung. Die Einführung von Bromessigsäure-substituierten Peptiden führte in einer analogen Synthese zu Peptid-funktionalisierten Imidazoliumsalzen. Durch Verwendung der Verbindungen 6a und 6c in der Festphasenpeptidsynthese konnten Imidazolium-Pseudoenkephaline hergestellt werden. Diese Biokonjugate sollten prinzipiell alle geeignete Vorstufen für Carbenliganden darstellen. Lediglich die Verbindung 4 konnte nicht durch eine weitere N-Alkylierung zum gewünschten Imidazoliumsalz umgesetzt werden. Die N-Alkylierung von Peptidkonjugaten der künstlichen Aminosäure Thiazolylalanin erbrachte Thiazoliumsalze, die ebenfalls als Ligandenvorstufen für Carbenkomplexe geeignet sind. Alle Verbindungen wurden mittels NMR, MS und EA vollständig charakterisiert.
40
Synthese der Carbenkomplexe
4. Synthese der NHC-Komplexe
4.1 Synthese durch Deprotonierung mittels starker Basen
Für die Synthese von NHC-Komplexen aus in situ generierten Carbenen stehen prinzipiell die bereits beschriebenen Methoden (vgl. Kap. 1) zur Verfügung. Die Wahl des geeigneten Imidazoliumsalzes stellt allerdings ein nicht unerhebliches Problem dar. Da bei den meisten Verfahren starke Basen verwendet werden, wie z.B. NaH oder KOtBu, sind nicht alle funktionellen Gruppen kompatibel. Ester und Carbonsäuren sind daher nicht geeignet, da unerwünschte Deprotonierungsreaktionen ablaufen würden. Endständige Alkinreste sind ebenfalls nicht geeignet, da nicht nur das C2-Proton, sondern auch das Alkinproton azide reagiert, was zu Nebenreaktionen, bis zur Zersetzung des Eduktes führt. Fehlgeschlagene Versuche machten ebenfalls deutlich, dass selbst Methylenprotonen azide genug reagierten, um die Zersetzung des Ausgangsmaterials einzuleiten. Letztlich blieben nur noch die Halogen-funktionalisierten Imidazoliumsalze übrig, die als einziges azides Proton das Imidazoliumproton am C2-Kohlenstoff enthielten. Dies waren die Verbindungen 8a und 8b. Versuche, diese Imidazoliumsalze nach klassischen Methoden in Gemischen von flüssigen Ammoniak und THF zu deprotonieren,[40] scheiterten allerdings auch hier. Während der Entfernung des Ammoniaks traten bereits unerwünschte Nebenreaktionen auf, was sich in einer Braunfärbung der Lösung bemerkbar machte. Es konnte hier kein Produkt isoliert werden. Da der Rückstand unlöslich in nahezu allen organischen Lösemitteln war, sind wahrscheinlich Polymere entstanden. Aufgrund dieser Befunde wurde zur Carbenerzeugung die Suspensionsmethode gewählt, da hier das Produkt durch Filtration isoliert werden kann, ohne zuerst noch das Ammoniak entfernen zu müssen. Das Imidazoliumsalz 8a wurde mit KOtBu in einen gekühlten Schlenkkolben bei – 40°C mit THF versetzt und nach 30 min Reaktionszeit, in der sich die Lösung leicht gelblich verfärbte, in einen zweiten Schlenkkolben kanüliert, in dem sich photoaktiviertes Wolframpentacarbonyl-(THF) in THF, ebenfalls bei – 40°C, befand. Das
41
Synthese der Carbenkomplexe Wolframhexacarbonyl wurde in THF für 3 h bestrahlt, wobei ein CO-Ligand durch THF ausgetauscht wurde. Dabei verfärbt sich die Lösung von farblos nach gelb-orange.[116] Nach beendeter Zugabe wurde ü.N. gerührt, wobei keine Temperaturkontrolle mehr nötig war. Da das Wolframhexacarbonyl im Überschuss eingesetzt wurde, musste dies noch durch Sublimation aus dem Reaktionsgemisch entfernt werden. Komplex 22 wurde nach Umkristallisation aus DCM/Pentan bei 4°C als gelbliches Pulver erhalten. Es ist eine luft- und feuchtigkeitsstabile Verbindung, die allerdings nur in Gemischen aus CHCl3 und DCM oder DMF ausreichend löslich ist.
W(CO)6
h∗ν
W(CO)5(THF)
THF
Br
N N I CH3
- CO
KOtBu, THF - 40°C - KI, - HOtBu
Br
Br
W(CO)5(THF), THF
N N CH3
- 40°C -THF
N OC CO W CO N OC CO CH3
8a
22: 44%
Abb. 4.1: Synthese von Wolframkomplex 22
Ansätze, bei denen auf die Photoaktivierung verzichtet wurde, erbrachten schlechtere Ausbeuten. Die Aktivierung erleichtert den Ligandenaustausch, da THF eine bessere Abgangsgruppe als das Carbonyl darstellt. Im 1H NMR-Spektrum von Verbindung 22 sind die erwarteten Dubletts der olefinischen Imidazol-Protonen mit einer Kopplungskonstante von
3
J = 1.9 Hz zu finden. Die
aromatischen Signale erscheinen als stark aufgespaltene Pseudo-Dubletts. Im IR-Spektrum befinden sich die typischen starken Absorptionsbanden für Carbonylliganden bei 1914 und 1882 cm-1. Zusätzlich befindet sich eine typische Absorption um 2900 cm-1 für aromatische Valenzschwingungen.[112]
42
Synthese der Carbenkomplexe
Abbildung 4.2: 1H NMR von 22 in CDCl3/CD2Cl2 (ν = 200 MHz) und IR-Spektrum.
4.1.1 Zusammenfassung
Die direkte NHC-Komplexsynthese durch Deprotonierung mit starken Basen konnte nur für einen Liganden erfolgreich durchgeführt werden. Alle anderen Liganden erwiesen sich als ungeeignet, da diese azidere Protonen als das C2-Proton aufweisen (vgl. Kap. 1). Von den verwendeten Metallcarbonylen (M(CO)6, M = Cr, W, Mo) ließ sich nur mit Wolframhexacarbonyl ein Carbenkomplex synthetisieren. Versuche, Komplex 22 durch Sonogashira-Kopplung mit einem Alkin-funktionalisierten Peptid zu koppeln, scheiterten. Somit standen für die Synthese von Carben-Biokonjugaten keine NHC-Metall-Carbonylkomplexe zur Verfügung. Dies wären geeignete IR-Sonden gewesen, da die Valenzschwingung von Metall-Carbonylen in einem anderen spektroskopischen Bereich erscheint als die Carbonylschwingungen der Peptidbindungen.[117]
43
Carbenkomplexsynthese
4.2 Synthese von NHC-Komplexen durch Transmetallierung mit µHalogenkomplexen
4.2.1 Funktionalisierte NHC-Rhodium(I, III)- und Ruthenium(II)-Komplexe
Aufgrund der im Kapitel 4.1 angesprochenen Inkompatibilität der meisten funktionellen Gruppen unter Deprotonierungsbedingungen zur Erzeugung freier Carbene wurde versucht, die NHC-Silbertransfermethode auf funktionalisierte Imidazoliumsalze zu übertragen. Lediglich Liganden mit freier Carbonsäuregruppe oder endständigen Alkinen reagierten nicht zu NHC-Silber(I)-Komplexen, sondern gingen Nebenreaktionen ein, wie z.B. Deprotonierung am Alkin-Proton oder Bildung polymerer Strukturen.[118, 119] Versuche, Carboxylat-Addukte nach CRABTREE herzustellen (vgl. Kap. 1.5) scheiterten ebenfalls.[41] Lediglich das bereits in der Literatur bekannte 1,3-Dimethylimidazolium-2Carboxylat konnte synthetisiert werden. Daher wurde im weiteren Verlauf der Arbeit ausschließlich das Transmetallierungsverfahren verwendet. Als µ-Halogenkomplexe wurden zum einen Dichloro-ruthenium(II)-p-cymeneDimer gewählt, da die Ruthenium-Aren-Einheit ein Strukturmotiv des antimetastatisch wirksamen RAPTA-C- Komplexes ist.[120] Außerdem wurden Rhodium(I)- und Rhodium(III)-Edukte gewählt, da sie analog der Rutheniumverbindungen zu den gewünschten Komplexen umgesetzt werden können und sie möglicherweise ebenfalls interessante Eigenschaften aufweisen. Abbildung 4.3 zeigt schematisch die Synthese der Rhodium- und Ruthenium-NHCKomplexe. Dazu wurde für alle Komplexe die gleiche Methode verwendet. Zwei Äquivalente des entsprechenden Imidazoliumsalzes werden mit einem Äquivalent Ag2O in DCM gelöst und im Dunkeln auf dem Schüttler geschwenkt, bis eine teilweise oder vollständige Umsetzung zum NHC-Silber(I)-Komplex erfolgte. Da während der Reaktion Wasser gebildet wird, gibt man Molekularsieb (MS) zum Reaktionsgemisch. Dies soll u.a. die Reaktionsgeschwindigkeit erhöhen.[50, 121, 122] Dann wurde ein Äquivalent des jeweiligen µ-Halogenkomplexes zugegeben und ü.N. geschwenkt. In den meisten Fällen trat eine sofortige Reaktion ein, sichtbar durch den gebildeten Niederschlag von Silberhalogenid und einer Farbänderung von orange nach gelb 44
Carbenkomplexsynthese (Rhodium(I)-Verbindungen), oder von dunkelrot-braun nach orange (Rhodium(III)- und Ruthenium(II)-Verbindungen).
R2 Br R1 N
Rh Rh
N
Cl Rh Cl
N Cl
Cl
Ru Cl Cl
N
N CH2Cl2, MS
N R1
R2
24a: R1= Me, R2 = CO2CH3, 42% 24b: R1= Me, R2 = CO2Pfp, 61% 24c: R1 = iPr, R2 = CO2Pfp, 65% 24d: R1 = iPr, R2 = I, 81%
2
R
Cl Rh Cl
CH2Cl2, MS
Rh
Cl Cl
R2
AgBr
23a: R1= CH3, R2 = CO2CH3, 42% 23b: R1= CH3, R2 = CO2Pfp, 93%
R1 N Ru
N Ag
CH2Cl2, MS
Cl Ru
R1
Cl Cl
R1 N Rh N
Cl
Cl
25: R1 = Me, R2 = CO2Pfp, 63% R2
Abbildung 4.3: Synthese von Rhodium(I)-, Rhodium(III)- und Ruthenium(II)-NHC-Komplexen.
Abbildung 4.4: 1H NMR von 24a in CD2Cl2 , ν = 250 MHz.
45
Carbenkomplexsynthese In Abbildung 4.4 ist exemplarisch ein typisches 1H NMR-Spektrum dargestellt, in diesem Fall von der Verbindung 24a. Alle Signale konnten zugeordnet werden mit Ausnahme der Methylenprotonen.
Wahrscheinlich
erfolgt
ein
H/D-Austausch
in
DCM,
da
die
Methylenprotonen relativ azide sind, was einen Austausch erleichtert. Dieses Phänomen war bei vielen der NHC-Komplexe zu beobachten, wenn in CD2Cl2 NMR-Spektren aufgenommen worden. Im
13
C NMR-Spektrum ist das Signal des Methylenkohlenstoffatoms zweifelsfrei
zuzuordnen bei 82 ppm. Charakteristisch sind auch die als breite Singuletts auftretenden Signale der aromatischen Protonen des p-Cymenes im 1H NMR-Spektrum, anstelle der erwarteten Pseudodubletts. Dies spricht für eine Rotation des p-Cymeneliganden um die η6Rutheniumbindung bei Raumtemperatur. Bei den ESI-Massenspektren wiesen alle Komplexe als Basispeak die charakteristischen einfach geladenen, positiven [M-Cl]+-Peaks auf. Im Falle von Verbindung 24a war dies der [M-Cl]+-Peak mit m/z = 501.01. Von Verbindung 24d war es möglich, durch Überschichtung von DCM mit Pentan bei Raumtemperatur geeignete Einkristalle für die Röntgenstrukturanalyse zu erhalten. Verbindung 24d kristallisiert im monoklinen Kristallsystem mit der Raumgruppe P21/n. Charakteristisch
für
NHC-Komplexe
ist
die
relativ
lange
Ruthenium-Carben-
Kohlenstoffbindung mit 2.063 Å. Die Isopropylgruppe am N(1)-Stickstoff dreht sich von der p-Cymene-Einheit weg (Abb 4.5). Die Methylenbrücke ist abgeknickt, so dass der Aromat ebenfalls von der p-Cymene-Einheit wegzeigt. In Tabelle 4.1 sind einige ausgewählte Bindungslängen und - Winkel dargestellt.
Abbildung 4.5: Molekülstruktur von 24d
46
Carbenkomplexsynthese Tabelle 4.1: Ausgewählte Bindungslängen und Bindungswinkel von 24d Bindungslängen [Å]
Bindungswinkel [°]
C(1)-Ru(1)
2.063(9)
C(3)-N(2)-C(1)
110.5(7)
C(1)-N(2)
1.356(12)
C(2)-N(1)-C(1)
111.1(8)
C(1)-N(1)
1.417(11)
Cl(2)-Ru(1)-C(1)
83.75(7)
C(3)-C(2)
1.344(14)
Cl(1)-Ru(1)-C(1)
90.7(2)
Versuche, Komplex 24d durch Sonogashira-Kopplung am Iodaromaten mit einem AlkinAminosäure-Konjugat zu funktionalisieren, blieben ohne Erfolg.[99] Eine mögliche Transmetallierung durch das Palladium des Katalysators als Nebenreaktion ist nicht auszuschließen.
CH3 N Ru N
Cl
O Cl
+
Pd(PPh3)4, CuI, Base
CH3 N Ru Cl N Cl
HN OCH3 O
I
O HN O
OCH3
Abbildung 4.6: Schema für Sonogashira-Kopplung
Die Reaktion der Methylester-funktionalisierten NHC-Ruthenium- und Rhodiumkomplexe 23a und 24a mit einer freien Aminogruppe zur Peptidbindung mittels Enzymreaktion blieb ebenfalls ohne Ergebnis. Die Pfp-funktionalisierten Komplexe sind prinzipiell zur Peptidbindung
in
Lösung
befähigt,
allerdings
Festphasenbedingungen gedacht (Abschnitt 4.3).
47
sind
aktivierte
Ester
eher
für
Carbenkomplexsynthese
4.2.2 Komplexierung von Methylimidazolium-Peptidkonjugaten
Aufgrund der vorherigen Misserfolge bei der Kopplung von Komplexen mit Biomolekülen wurden
die
Pseudoenkephaline
zur
Komplexierung
herangezogen.
Bei
diesen
Ligandenprekursoren entfällt die nachträgliche Funktionalisierung mit einem Peptid zum gewünschten Biokonjugat. Die Imidazolium-Pseudoenkephaline wurden zuerst unter Standardbedinungen behandelt, wobei hier schon als Lösungsmittel DCM/Acetonitril bzw. reines Acetonitril eingesetzt werden mussten, da die Peptide komplett unlöslich in DCM waren. Sowohl der Einsatz von Ag2O, als auch Ag2CO3, beides bei RT oder unter Rückfluß brachten keine Umsetzung zum gewünschten Rhodium- oder Rutheniumkomplex. Die Bildung des NHC-Silber-Komplexes konnte ebenfalls nicht beobachtet werden. Eine mögliche Erklärung dafür ist eine verringerte Azidität des Imidazoliumprotons am C2Kohlenstoff oder sterische Hinderung durch den Peptidrest am Imidazolstickstoff.
N Br
Ag2O o. Ag2CO3, µ -Halogenkomplex
N H N O
O N H
keine Reaktion
O
H N
N H
O
R
CH2Cl2 o. Acetonitril, RT o. Rückfluß
O
R = OH, NH2
CH3 N Br N
Ag2O o. Ag2CO3, µ -Halogenkomplex
O
CH2Cl2
HN
H3C N
Ru N Cl
Cl O HN
OCH3
OCH3 O
O 26: 32%
Abbildung 4.7: Komplexierungsschema für Methylimidazoliumpeptide
48
Carbenkomplexsynthese Beim Versuch, die kleineren Imidazoliumpeptidsalze als Ligandenprekursoren einzusetzen, lief die Reaktion ab, jedoch trat keine vollständige Umsetzung ein. Verbindung 26 konnte nach säulenchromatographischer Aufreinigung in moderater Ausbeute als oranges Pulver erhalten werden. Alle Signale konnten im NMR zugeordnet werden. Im ESI-Massenspektrum wurde als Basispeak m/z = 572.10 gefunden, was dem erwarteten kationischen [M-Cl]+-Peak entspricht. Bei Komplexierungsversuchen mit Ligand 17 (vgl. Kap. 5.1.1) zeigte sich, dass eine erheblich längere Zeit zur Umsetzung zum gewünschten Metallkomplex benötigt wird. Dies bedeutet, dass die Reaktivität des Imidazoliumsalzes mit zunehmender Länge des Peptidrestes abnimmt. Experimentell abschätzbar ist, dass ab einer Größe von 3 gekoppelten Aminosäuren am Stickstoffatom des Imidazol keine Reaktion mehr eintritt.
4.2.3 Komplexierung von Ethylthiazolium-Peptidkonjugaten
Die Synthese von Thiazolyl-2-yliden-Komplexen ausgehend von N-Ethyl-ThiazoliumPeptidkonjugaten konnte erfolgreich in Lösung durchgeführt werden. Allerdings war die Umsetzung hier auch schon ähnlich schlecht wie für Komplex 26. In den NMR-Spektren der Rohprodukte waren neben den Produkten auch noch die Edukte zu finden. Versuche, mittels HPLC aufzureinigen scheiterten, da die Verbindungen nicht ausreichend UV/VIS-aktiv waren, um vom Detektor erkannt zu werden. Daher wurde die Aufreinigung mittels Kieselgelchromatographie (DCM/MeOH 1-20%) durchgeführt. Die Komplexe 27a-28b konnten in ausreichender Reinheit erhalten werden, allerdings nur in moderaten Ausbeuten. Sowohl die Rhodium(III)-, als auch die Ruthenium(II)-Verbindungen sind orange. Die 4JKopplung der Thiazol-Protonen fällt nach der Komplexierung weg; das verbleibende Proton (C=CH-S) erscheint nur noch als Singulett. Das ESI-Spektrum zeigt die erwarteten einfach positiv geladenen [M-Cl]+-Peaks als Basispeak. In Abbildung 4.9 sind exemplarisch die ESI-Spektren von 27a und 21a dargestellt. Zusätzlich kann für 27a auch noch ein kleiner Peak bei m/z = 722.2 detektiert werden, der dem [M-Cl-H+Na]+-Peak entspricht. Für 21a wird als einziger Peak der [M-Br]+-Peak bei m/z = 428.2 gefunden. Die Komplexe 27a, 28a, und 28b weisen analoge ESI-Spektren auf. Im Falle von 28a findet sich im ESI-MS der [M-Cl]+-Peak mit m/z = 847.28 und dazu noch ein
49
Carbenkomplexsynthese Peak bei m/z = 893.17. Dieser wurde als [M-Et-H+K]+-Peak durch Vergleich des Isotopenmusters mit einem simulierten Spektren der gleichen Masse eindeutig identifiziert.
Boc HN
Br
N
H3CO N
S
O
Ag2O, µ -Halogen komplex
O Boc NH
27b: 28% Ru
N H
O
Cl
Cl
N
H3CO
CO2CH3
S
O
Boc HN
NH
27a: 28%
Rh
N H
S
O
Cl
Cl
21a Br N
O
S O
Boc NH
Ag2O, µ -Halogen komplex
H N
H3CO
O
Boc HN N N H
28a: 27%
Rh O
S
Cl
Cl
NH O HN
H3CO2C
O H3CO
H N O
21b
Boc HN N N H
28b: 24%
Ru O
S Cl
Cl
Abbildung 4.8: Syntheseschema der N-Ethyl-thiazolyl-2-yliden-Komplexe.
Abbildung 4.9: ESI-MS (positiver Modus, Acetonitril) von 21a (rechts) und 27b (links).
50
Carbenkomplexsynthese
4.2.4 Zusammenfassung
NHC-Komplexe durch Transmetallierung der in situ generierten NHC-Silber-Komplexe ließen sich von fast allen funktionalisierten Liganden in guten Ausbeuten herstellen. Die Charakterisierung konnte mittels NMR, MS und EA für alle Verbindungen eindeutig durchgeführt werden. Eine Aufreinigung durch chromatographische Methoden ist aufgrund der vollständigen Umsetzung nicht nötig. Die erhaltenen Komplexe sind stabil und nicht luftoder feuchtigkeitsempfindlich, so dass keine speziellen Lagerbedingungen erforderlich sind. Selbst Komplexe hygroskopischer Edukte weisen keine hygroskopischen Eigenschaften mehr auf. Im Falle der Methylimidazolium-Pseudoenkephaline ließen sich keine Komplexe durch Reaktion mit Silbersalzen und anschließender Transmetallierung durch entsprechende µHalogenkomplexe herstellen. Zur Synthese von NHC-Pseudoenkephalin-Komplexen muss eine alternative Syntheseroute, z.B. Festphasenpeptidsynthese, etabliert werden. Methylimidazolium-Peptidsalze und auch N-Ethyl-Thiazoliumpeptide ließen sich in moderaten Ausbeuten zu den entsprechenden Rhodium- und Ruthenium-NHC-Komplexen umsetzen. Sie wurden ebenfalls vollständig charakterisiert.
51
Carbenkomplexsynthese
4.3 NHC-Biokonjugate durch Kopplung von Peptiden an funktionalisierte NHC-Komplexe
4.3.1 Kopplung von NHC-Rutheniumkomplexen mittels SPPS
Da sich die Methylimidazolium-Pseudoenkephaline nicht als Ligandenvorstufen eigneten (vgl. Abschnitt 4.2.2), wurde eine alternative Vorgehensweise gewählt. Zur Kopplung von Peptiden, sowohl in Lösung, als auch an der festen Phase, sind die Komplexe 23b, 24b, 24c und 25 geeignet, die mit dem Pfp-Aktivester bereits eine zur Peptidbindungsbildung befähigte funktionelle Gruppe tragen. Somit können prinzipiell alle Verbindungen mit einer freien Aminogruppe an diese Komplexe gekoppelt werden. Erste Tests an fester Phase zeigten jedoch Probleme mit der Komplexstabilität. Bei Verwendung eines Standard-Harzes unter stark sauren Abspaltbedingungen (Wang, 95% TFA), wurde nach Aufreinigung mittels RP-HPLC nur das Imidazoliumsalz mit der Masse des Peptides plus der des Imidazolium-Arylfragmentes, ohne die Masse des MetallKomplexfragmentes, gefunden. Die Metall-Carben-Kohlenstoffbindung ist somit zu labil für Harze, deren Linker stark saure Abspaltbedingungen erfordern. Positiv festzuhalten ist hierbei, dass die Peptidbindung zwischen dem Pfp-Ester und der Aminogruppe des harzgebundenen Peptides gebildet wurde. Um die geeigneten Festphasenbedingungen herauszufinden, wurden in für Abspaltungen geeigneten Lösemitteln (MeOH, DCM) mit ansteigender TFA-Konzentration NMR-Studien in
den
entsprechenden
deuterierten
Lösungsmitteln
durchgeführt,
wobei
die
Methylesterkomplexe der entsprechenden Metalle (23a und 24a) verwendet worden. Dabei wurde mit 0.5% TFA gestartet und nach 2-4 h die Konzentration auf 1, 2, 3, 4, 5, 10 und 20% TFA erhöht. Dabei stellte sich schnell heraus, dass der Rhodiumkomplex 23a schon bei einer Konzentration von 0.5% TFA gespalten wird, sichtbar durch das erneute Auftreten der Signale des entsprechenden Imidazoliumsalzes. Für den Ruthenium-Komplex 24a wurde eine 30% Zersetzung bei 2% TFA nach 4 h beobachtet. Eine vollständige Zersetzung trat erst bei 3% TFA in DCM auf. Eine 30% Zersetzung liegt in einem tolerierbaren Rahmen, da die Aufreinigung durch HPLC die Abtrennung von Nebenprodukten ermöglicht. In MeOH waren die Ruthenium-NHC-Komplexe selbst bis 20% TFA stabil.[123] 52
Carbenkomplexsynthese Harze mit extrem säurelabilen Linkern sind z.B. 2-Cl-Trt oder das Sieber Amid-Harz. Sie benötigen als Abspaltlösung 2% bzw. 1% TFA in DCM. Der Sieber Amid-Linker reagiert nicht bei Verwendung von TFA-Lösungen in MeOH, wohingegen der 2-Cl-Trt-Linker auch unter diesen Bedingungen unter Freisetzung des Produktes reagiert. Daher wurden weitere Versuche mit dem 2-Cl-Trt-Harz und Verbindung 24b durchgeführt, unter Verwendung beider Abspaltmischungen.
H2N O
i) Fmoc-Phe-OH, HOBt*H2O,TBTU, DIPEA
O Cl
O H2N
N H
ii) Piperidin/DMF (1:4)
O
O Cl
CH3 Fmoc-Gly-OH
N
Fmoc-Gly-OH
N 24b, HOBt
Ru Cl Cl H N
2% TFA, 2.5%
O N H
TIS/ DCM
O
H N O
O N H
OH O
29
Abbildung 4.10: SPPS von NHC-Ruthenium-Pseudoenkephalin 29.
Die Synthese von 29 wurde nach dem Fmoc-Standardprotokoll durchgeführt. Die Fmocgeschützten Aminosäuren wurden nacheinander aktiviert und für ca. 1 h gekoppelt. Anschließend wurde durch 20% Piperidin in DMF die Fmoc-Gruppe abgespalten und die nächste Aminosäure gekoppelt. Es wurden dabei 4 Äquivalente (äq.) der entsprechenden Aminosäure verwendet. Nach dem Einbau des zweiten Glycins wurden 2.5 äq. des Pfpfunktionalisierten Komplexes 24b mit ebenfalls 2.5 äq. HOBt in DMF gelöst, und für 48 h gekoppelt, um eine vollständige Umsetzung zu gewährleisten. Das HOBt bedingt eine höhere Reaktionsgeschwindigkeit.[124,
125]
Anschließend wurde das Biokonjugat durch Zugabe von
2% TFA und 2.5% Triisoproylsilan (TIS) in DCM für 2 h abgespalten und die erhaltene orange Lösung wurde mit kaltem Diethylether/Pentan versetzt, um das Produkt zu fällen. Das Harz wurde ein zweites Mal für 2 h mit derselben Abspaltmischung behandelt und ebenfalls gefällt. Die analytische HPLC zeigte starke Verunreinigung, daher wurde mittels präparativer 53
Carbenkomplexsynthese HPLC aufgereinigt und die Produktfraktionen anschließend lyophilisiert. Man erhält ein oranges Pulver in einer Reinheit von 95%. Eine verbesserte Spaltmethode beinhaltet die Behandlung des Harzes mit 10% TFA in MeOH für 2 h, gefolgt von einem zweiten Abspaltzyklus mit 20% TFA in MeOH. So konnte die Rohausbeute auf 30% gesteigert werden. Bei dieser Methode konnte das Produkt nach präparativer HPLC ebenfalls in einer Reinheit > 95% erhalten werden. Bei einem Ansatz von 100 µmol betrug die Ausbeute 3 mg nach der ersten Spaltmethode und 8 mg bei Verwendung der verbesserten Spaltbedingungen und nach HPLC-Aufreinigung (3% bzw. 9%).
Abbildung 4.11: 1H NMR in DMSO-d6 von Verbindung 29, ν = 400 MHz.
In Abbildung 4.11 ist das 1H NMR-Spektrum von Verbindung 29 dargestellt. Alle Signale konnten einwandfrei mittels HMQC- und COSY-Spektren zugeordnet werden. Das fehlende Signal für das azide Imidazoliumproton an C2 zeigt, dass keine Zersetzung der Verbindung durch die HPLC-Aufreinigung vorlag. Anhand des Integralverhältnisses der beiden Isopropylgruppen (Leucin und p-Cymene-Ligand) von 1:1 kann von einer eindeutigen 54
Carbenkomplexsynthese Kopplung des Rutheniumkomplexes ausgegangen werden. Im
13
C NMR-Spektrum ist das
Ruthenium-Carben-Kohlenstoffsignal bei 174.5 ppm aufzufinden. Dies entspricht der erwarteten Verschiebung, da das Carben-Kohlenstoffsignal von Komplex 24b bei 175.8 ppm ebenfalls in diesem Bereich erscheint. Beim Vergleich der ESI-Massenspektren des Methylimidazolium-Pseudoenkephalins 18 mit dem Spektrum von 29 (Abb. 4.12), fällt auf, dass zusätzlich zum erwarteten [M-Cl]+-Peak von m/z = 861.15 für den Rutheniumkomplex in diesem Fall ein zweiter Peak von m/z = 825.20 auftritt. Dies entspricht einem einfach positiv geladenen Massenpeak von [M-2Cl-H]+. Dieser Befund konnte durch den Vergleich des Isotopenmusters mit simulierten Spektren der erwarteten Zusammensetzung bestätigt werden (vgl. Abb. 4.12, a) und b)).
Abbildung 4.12: ESI-MS von 18 und 29, a), b): simulierte Spektren für [M-Cl]+ und [M-2Cl-H]+. (oben) und RP-HPLC bei 254nm (unten), blau: 18; orange: 29.
Die Retentionszeit in der analytischen RP-HPLC erhöht sich von 13.52 min, im Falle des Methylimidazolium-Pseudoenkephalins 18, auf 15.97 min für das NHC-RutheniumPseudoenkephalin 29. Die um ca. 3 min längere Retentionszeit der Verbindung 29 spricht für 55
Carbenkomplexsynthese eine höhere Lipophilie der Verbindung, hervorgerufen durch die Ruthenium-p-CymeneEinheit.
4.3.2 Kopplung von Rhodium(III)-NHC-Komplex in Lösung
Verbindung 25 wurde ursprünglich ebenfalls zur Kopplung in der Festphasenpeptidsynthese hergestellt. Die erwartete Stabilität, vergleichbar zum analogen Ruthenium-p-CymeneKomplex wurde allerdings unter Abspaltungsbedingungen nicht beobachtet. Die RhodiumCarbenkohlenstoffbindung ist sowohl für Rhodium(I), als auch Rhodium(III) deutlich schwächer als für Ruthenium(II). Daher wurde 25 in Lösung mit einem Dipeptid gekoppelt. Da die Reinheit der Reaktion nicht mittels analytischer HPLC untersucht werden konnte (keine UV/VIS-Aktivität von 30 im Wellenlängenbereich des HPLC-Detektors), wurde mittels Kieselgelsäule aufgereinigt (DCM/MeOH, 1-20%). 30 wurde nach anschließender Fällung aus DCM mit Pentan als hellgelbes Pulver erhalten. Komplex 25 hingegen ist ein dunkel-oranger Feststoff.
N
N N
Rh
F
Cl F Cl
+
O
H3N
F
O
N
O
F
O
F F3C
N H
OCH3
NEt3, HOBt
Rh Cl
Cl H N
Acetonitril, ü.N.
O
O
O
O N H
OCH3 O
Abbildung 4.13: Synthese von 30 in Lösung.
Verbindung 30 wurde vollständig charakterisiert. Der Rhodium-Carben-Kohlenstoff erscheint im 13C NMR-Spektrum bei 166.7 ppm. Im ESI-MS findet sich neben dem [M-Cl]+-Peak bei m/z = 763.3 auch der einfach positiv geladene [M-2Cl-H]+-Peak bei m/z = 727.3 wieder. Dies ist in Analogie zu Verbindung 29.
56
Carbenkomplexsynthese
Abbildung 4.14: ESI-MS (pos. Modus, Acetonitril) von 30.
4.3.3 Zusammenfassung
Versuche, Abspaltbedingungen für Rhodium-und Ruthenium-NHC-Komplexe mittels NMRStudien mit steigenden TFA-Konzentrationen zu ermitteln, wurden durchgeführt. Einzig die Ruthenium-Carbenkohlenstoffbindung erwies sich unter schwach sauren Bedingungen (2% TFA in DCM, oder 20% TFA in MeOH) als geeignet. Somit wurde für die Festphasensynthese der Komplex 24b an ein harzgebundenes Peptid gekoppelt und anschließend abgespalten und mittels HPLC aufgereinigt. Dies ist das erste publizierte Ruthenium-NHC-Biokonjugat durch SPPS-Synthese.[123] Da sich die Rhodium(I)- und (III)-Carbene als ungeeignet für SPPS-Spaltbedingungen erwiesen haben, wurde der Pfp-funktionalisierte NHC-Komplex 25 in Lösung mit einem Dipeptid gekoppelt und vollständig analysiert. Die Synthese von Ruthenium-NHC-Biokonjugate mittels der Festphasenpeptidsynthese ist also auf Harze mit extrem säurelabilen Linkern beschränkt, was die Auswahl der möglichen Peptide stark einschränkt (Schutzgruppen und deren Spaltbedingungen). Eine andere Möglichkeit wäre, auf die Boc-Strategie auszuweichen. Im Falle der Rhodium-NHC-Komplexe muss auf die Funktionalisierung in Lösung als einzig durchführbare Methode zurückgegriffen werden. 57
Carbenkomplexsynthese
4.4 NHC-Komplexe mit unfunktionalisierten Resten und Ethylestergruppen
Zusätzlich zu den NHC-Komplexen, die funktionelle Gruppen tragen, wurde noch unfunktionalisierte NHC-Komplexe von Rhodium(I) und Ruthenium(II) hergestellt. Des Weiteren wurden Imidazoliumsalze verwendet, die eine Ethylestergruppe tragen, da dies eine mögliche biologische Anwendung beinhaltet. In jedem Organismus befinden sich Esterasen, die Ester zu den entsprechenden Säuren spalten. Daher können Ethyl- oder Methylester als Prodrug benutzt werden, da freie Säuren meist nicht lipophil genug sind, um in Zellen aufgenommen zu werden, bzw. eine schlechtere Resorption haben.[126] Dies wird allgemein als mögliche Eigenschaft für eine Medikamentenvorstufe diskutiert, die erst im Körper zum aktiven Wirkstoff metabolisiert wird.
31a: R1 = Me, 41% 31b: R1 = iPr, 60%
O
R1 N Br
O
O O
N
N
O
CH3 N I N CH3
N Rh
N R1
O Ag2O, µ-Halogen komplexe DCM, Ms
32a: R1 = Me,52 % 32b: R1 = iPr, 50%
Ru N Cl Cl R1
Cl
CH3 N Ru N Cl Cl CH3
CH3 N Br
CH3 N
N
N
33: 50 %
CH3 N
Ru Cl
34a: 61%
Rh Cl
N
Cl
34b: 65%
Abbildung 4.15: Komplexsyntheseschema für unfunktionalisierte NHC-Komplexe und Ethylesterkomplexe.
58
Carbenkomplexsynthese In Abbildung 4.15 ist das Syntheseschema für die Komplexe 31a-34b dargestellt. Die NMRSpektren und ESI-Massenspektren zeigen die erwarteten Signale. Die chemischen Verschiebungen der Metall-Carben-Kohlenstoffatome sind in einer Tabelle am Ende des Kapitels 5 zusammengestellt. Von den Verbindungen 31a und 33 konnten Einkristalle für die Röntgenstrukturanalyse durch Diffusion von Pentan in DCM bei RT gewonnen werden. Die Abstände der Rh-C- bzw. RuC-Carbenkohlenstoffbindung sind mit 2.022 Å und 2.087 Å deutlich länger als eine C-CEinfachbindung. Dies ist ein typischer Befund für NHC-Metall-Carbenbindungen. Die Isopropylgruppe des p-Cymene-Liganden von 33 zeigt wie bei 24d vom Ruthenium weg (vgl. Abb. 4.5). Ausgewählte Bindungswinkel und -Abstände sind in Tabelle 4.2 zusammengestellt.
Abbildung 4.16: Strukturen der Verbindung 33 und 31a. Tabelle 4.2: Ausgewählte Bindungslängen und- Winkel von 33 (links) und 31a (rechts). Bindungslänge [Å]
Bindungswinkel [°]
Bindungslänge [Å]
Bindungswinkel [°]
Ru(1)-C(11)
C(11)-
Rh(1)-C(1)
C(1)-Rh(1)-
2.087(7)
90.5(2)
2.022(5)
Ru(1)-Cl(2) C(13)-N(2)
1.409(9)
N(2)-C(11)-
Cl(1) 103.6(6)
Rh(1)-Cl(1)
2.4004(18)
N(1) N(2)-C(11)
1.359(9)
C(11)-
1.365(9)
Cl(1)-Ru(1)-
88.5(2)
N(1)-C(1)
1.355(8)
1.329(11)
129.2(4)
N(2)-C(1)-
127.1(4)
Rh(1) 83.53(8)
N(2)-C(1)
1.358(7)
Cl(2) C(12)-C(13)
N(1)-C(1)Rh(1)
Ru(1)-Cl(1) N(1)-C(11)
87.88(15)
N(1)-C(1)N(2)
C(2)-C(3)
59
1.335(9)
103.6(5)
Carbenkomplexsynthese Verbindung 33 kristallisiert monoklin in der Raumgruppe P21/c, Verbindung 31a hingegen triklin in der Raumgruppe P1.
4.4.1 Zusammenfassung
Die
Synthese
unfunktionalisierter
NHC-Komplexe
mittels
Transmetallierung
ist
unproblematisch. Nach Umkristallisation erhält man die gewünschten Komplexe in guten Ausbeuten und hoher Reinheit. Sie sind luft- und feuchtigkeitsstabil und in allen polaren organischen Lösungsmitteln löslich. Wenn man die Komplexe in ein wenig DMSO löst, sind sie auch in Wasser komplett löslich. Dies ist wichtig, da einige der Rutheniumverbindungen für Zelltests verwendet werden sollten (vgl. Abschnitt 6).
60
Carbenkomplexsynthese
5. Gold-NHC-Komplexe durch Transmetallierung
Zusätzlich zu den bisher besprochenen NHC-Komplexen, die sich von µ-Halogenkomplexen ableiten, sollten auch NHC-Gold-Komplexe hergestellt werden, um sie auf ihre biologische Aktivität zu untersuchen. Bekannt aus der Literatur sind bereits kationische Bis(carben)-Gold(I)-Komplexe, die Antitumoraktivität besitzen.[63] In der Gruppe von BERNERS-PRICE wird der Einfluss der kationischen Carbene auf Mitochondrien untersucht, und dabei im Speziellen der Einfluss der NHC-Komplexe auf die Mitochondrial Membrane Permeability (MMP), d.h. die Eigenschaft, die mitochondriale Membran zu durchdringen, und daraus folgend, Apoptose zu induzieren.[127] Dabei wird ausgenutzt, dass Tumorzellen ein gegenüber normalen Zellen erhöhtes Plasma- und Membranpotential aufweisen, und daher mehr lipophile Kationen in den Mitochondrien aufnehmen können.[128]
R N
R N
Cl N
Au N R
AuCl N R
N
R = Me, Et, iPr, tBu, Cy...
Abbildung 5.1: Kationische Bis(NHC)-Gold(I)-Komplexe (links) und neutraler NHC-Gold(I)Chlorid-Komplex (links).
Der lineare, neutrale zweifach-koordinierte Gold-Komplex Auranofin zeigt ebenfalls antimitochondriale Aktivität (vgl. Abb. 1.17).[129, 130] Anscheinend ist bei Auranofin auch ein anti-mitochondrialer
Mechanismus
aktiv,
der
die [93]
Mitochondriale Thioredoxin- Reduktase beinhaltet.
Inhibierung
des
Selenoenzyms
Dies ist ein anderer Wirkmechanismus
als für tetraedrische bis-chelatisierende Gold(I)-Phosphinkomplexe gefunden wurde.[92] NHC werden als Alternative zu Phosphinliganden untersucht, da sie ähnliche Donoreigenschaften als Liganden haben und leichter zu synthetisieren sind. 61
Carbenkomplexsynthese Da die Forschung auf dem Gebiet der kationischen, einfach geladenen, linaeren Bis-NHCGold(I)- Komplexe bereits weit fortgeschritten ist, haben wir versucht, funktionalisierte und unfunktionalisierte neutrale, lineare NHC-Gold(I)- und quadrarisch-planare Gold(III)Komplexe zu synthetisieren, um deren biologische Aktivität zu untersuchen. Lineare NHC-Gold-Komplexe mit Biomolekülen gibt es bereits in der Literatur. Sowohl ein Auranofin- Analogon,[67] als auch ein Saccharin-Komplex wurden hergestellt und wurden auf ihre biologische Aktivität u.a. von NOLAN untersucht (vgl. Kap. 1).[70] Lineare NHC-Auund NHC-Ag-Chlorid Komplexe wurden von GHOSH et al. auch auf Antitumoraktivität untersucht, jedoch zeigten sie keine Aktivität. Stattdessen wiesen sie antimikrobielle Eigenschaften auf. [62]
5.1 Synthese linearer NHC-Gold(I)- und quadratisch-planarer Gold(III)Komplexe
Um neutrale NHC-Gold(I)-Komplexe herzustellen, gibt es mehrere Syntheseverfahren. Da allerdings auch funktionalisierte Imidazoliumsalze als Ligandenvorstufen verwendet werden sollten, wurde auf die Transmetallierung von NHC-Silber-Salzen zurückgegriffen. Versuche,
analog
Literaturvorschrift
monomere
NHC-Gold-Komplexe
herzustellen,
scheiterten.[67] Die Reaktion des Liganden 6b mit Ag2O und anschließender direkter Transmetallierung mit DMS-AuCl (Dimethylsulfid-Gold(I) Chlorid) erbrachte keine vollständige Umsetzung. Im NMR fand sich sowohl das NHC-Silbersalz, als auch der NHCGold-Komplex, wobei das Verhältnis bei 10:1 von Silber- zu Gold-Carben lag. Die gleiche Reaktion, ausgehend von dem vorher isolierten entsprechenden Silbersalz 35 des Liganden 9b, erbrachte eine vollständige Umsetzung. Allerdings zeigte die ESI-MS Analyse, dass sich der kationische Bis(NHC) Gold(I)-Komplex gebildet hatte (vgl. Abb. 5.2). Trotz Einhalten der Literaturvorschrift, anhand der selbst mit Dimethylimidazoliumsalzen lineare, neutrale NHC-Gold-Komplexe darstellbar sind,[131] ließ sich dies nicht auf die verwendeten funktionalisierten Liganden übertragen. Aufgrund dieser Ergebnisse wurde versucht, den sterischen Anspruch der Substituenten am Imidazoliumsalz zu erhöhen, um so ausschließlich lineare, neutrale NHC-Gold(I)-Komplexe zu synthetisieren. 62
Carbenkomplexsynthese Anstelle der Methylgruppe wurden Tert-butyl- und Diphenylmethylgruppen als sterisch gehinderte funktionelle Gruppen an einem der beiden Stickstoffatome des Imidazols eingeführt.
CO2CH3
1) Ag2O 2)
S
N
Au Cl
AuCl
Br
N DCM
N
N CO2CH3
6b
Br
Br S
N
N Ag
N
N
AuCl
N
Br CH2Cl2, N2
N Au
N
Cl
N
Br
Br
35
36
Abbildung 5.2: Synthese von kationischen Bis(NHC)-Gold(I)-Komplexen.
Bei den weiteren Versuchen wurde von einer „Eintopf“-Transmetallierung abgesehen, da die Umsetzung der Edukte zu den NHC-Gold-Komplexen teilweise sehr schlecht war. Daher wurden von den verwendeten Spezies zuerst die NHC-Silber-Salze hergestellt, um diese dann im zweiten Schritt mit DMS-AuCl zum entsprechenden NHC-Au(I) Chlorid umzusetzen. Die Vorstufe 37 wurde durch eine Mehrkomponentenzyklisierung aus Tert-butylamin, Glyoxal und Formaldehyd hergestellt (vgl. Abschnitt 1.3). Allerdings kam es bei der Umsetzung mit Ag2O nicht zur Bildung des NHC-Ag-Salzes. Daher wurde eine alternative Methode gewählt.
[67, 91]
Zu einer Lösung des Imidazoliumsalzes 37 in wasserfreien DMF
wurde Lithium-bis(trimethylsilylamid) zugegeben, um in situ das freie Carben zu erzeugen. Dieses wurde anschließend mit DMS-AuCl zu dem entsprechendem NHC- Au(I) Chlorid 38a 63
Carbenkomplexsynthese umgesetzt (vgl. Abb. 5.3). Diese Methode funktioniert nur bei Imidazoliumsalzen, deren einziges azides Proton das C2-Proton ist (s. Abschnitt 1.5). Die Imidazoliumsalze 13 und 15b wurden zu den entsprechenden NHC-Ag-Salzen umgesetzt und konnten als weiße Feststoffe isoliert werden. Für das Imidazoliumpeptid 15b wurde die Reaktionszeit auf 24 h erhöht, um eine vollständige Umsetzung zu gewährleisten. Anschließend wurden die NHC-Silber-Salze mit zwei Äquivalenten DMS-AuCl im Dunkeln ü.N. zu den NHC-Au(I) Chloriden 39a und 40a umgesetzt. Da sich das DMS-AuCl nicht in DCM löst, muss in Suspension gearbeitet werden. Nach beendeter Reaktion wird filtriert und man erhält die Komplexe durch Umkristallisation mit Pentan aus DCM. Die NHC-Au(I) Chloride sind weiße Feststoffe. Beim Lösen in DMSO färbte sich Komplex 39a grau-lila, jedoch zeigte das ESI-MS keine Zersetzungsprodukte. Bei den anderen Komplexen konnte dies nicht beobachtet werden. Die Lagerung erfolgte jedoch unter Ausschluss von Licht, da Gold-, ebenso wie Silberverbindungen, lichtempfindlich sind.[121, 132]
N Cl N
1) Li N(SiMe3)2 2) DMS-AuCl
N
DMF, N2, RT
N
37
AuCl
38a: 42%
N
N N O
AuCl N
Br HN
O
HN
O
O
H3CO
H3CO 1) Ag2O 2) DMS-AuCl, N2 15b
39a: 54% DCM
N
N
N Br
N
AuCl
13
40a: 75%
Abbildung 5.3: Synthese von symmetrischen und unsymmetrischen NHC-Au(I) Chloriden.
64
Carbenkomplexsynthese Versuche, diese Reaktionsvorschrift auf Pfp-funktionalisierte Liganden zu übertragen, scheiterten an der schlechten Umsetzung zum Silbercarben. Selbst Reaktionszeiten über 3 Tage konnten das Gleichgewicht nicht auf die Produktseite schieben. Im NMR wurden Gemische von Imidazoliumsalze zu Silbercarben im Verhältnis 9:1 gefunden. Erhöhte Reaktionstemperaturen führten ebenfalls nicht zum Silbercarben, sondern zur Zersetzung des Ag2O. Daher kann eine weitere Funktionalisierung des NHC-Gold-Komplexes nur durch den Austausch des Chloridliganden durchgeführt werden, und nicht durch den Aufbau einer Peptidbindung mittels eines mit einem Aktivester funktionalisierten Goldcarbens, wie es für die Ruthenium- und Rhodiumverbindungen möglich war (vgl. Abschnitt 4.3.1, 4.3.2). Um den Chloridliganden durch ein anderes Halogen zu ersetzen, werden keine speziellen Reaktionsbedingungen benötigt. Das Gold(I)-Kation ist eine der weichsten Lewissäuren, die erhältlich sind. Daher wurde postuliert, dass ein Austausch des Chlorids durch Bromid sehr leicht sein sollte.[133] Durch eine Metathesereaktion des NHC-Au(I) Chlorids mit LiBr in Aceton wurde das entsprechende NHC-Au(I) Bromid quantitativ erhalten. Die teilweise sehr schlechten Ausbeuten hängen mit der Aufarbeitung zusammen, da das entstehende LiCl sehr schlecht abtrennbar ist. Die Existenz des entstandenen NHC-Au(I) Bromids ist durch 1H NMR und Massenspektren nicht zu beweisen, da sich die Signale der Protonen nur unwesentlich durch die veränderte Ligandensituation verschieben. Im Massenspektrum findet sich üblicherweise der [MHalogen]+-Peak als Hauptpeak wieder, daher kann dies nicht als Beweis herangezogen werden. Einen eindeutigen Hinweis auf die ausschließliche Existenz des NHC-Au(I) Bromides
liefert
das
13
C NMR
Spektrum,
insbesondere
das
Signal
des
C2-
Carbenkohlenstoffatoms. Das Signal ist relativ schwach, da der Carbenkohlenstoff quartär ist und zudem durch das Quadrupolmoment des Goldatoms beeinflusst wird (I =3/2).
N
AuBr
N O
HN
O
HN
O
Br Au Br Br
HN O
O H3CO
H3CO
39a
N
N
O H3CO
N
N AuCl
39b: 30%
39c: 90%
Abbildung 5.4: Synthese der NHC-Au(I) Bromid und NHC-Au(III) Bromid Komplexe.
65
Carbenkomplexsynthese Die chemische Verschiebung des Carbenkohlenstoffes wird mit der Azidität des Metalls, an das es gebunden ist, korreliert. Das Signal für einen freien NHC-Ligand, ohne Elektronendonation an eine Lewis-Säure, wäre extrem tieffeldverschoben, typischerweise über 200 ppm.[134] Dies spiegelt die erhöhte Elektronendichte durch das freie Elektronenpaar am Carbenkohlenstoff wieder. Im Gegensatz dazu würde durch die σ-Donorbindung an ein Metallzentrum das Signal hochfeldverschoben werden, da partiell Ladung auf das Metallatom übertragen wird.[26] Das Gold- Carbenkohlenstoffsignal erfährt eine signifikante Tieffeldverschiebung um 4.1 ppm von 171.0 (NHC-Au(I) Chlorid) zu 175.1 ppm im Falle des Bromides. Dies ist in Einklang mit der Literatur.[131,
133]
Begründet wird dies im Allgemeinen mit einer leichten
Aziditätsänderung am Goldzentrum durch die veränderte Ligandensituation. Das Gold ist weniger azide im Falle des Bromidligandens, da dieser weniger elektronegativ als das Chlorid ist. Dies wurde auch für die Metathese des Chlorids durch den Bromidliganden bei den Komplexen 38b und 40b experimentell bestätigt. Auch hier wurde eine signifikante Tieffeldverschiebung des Carbensignals um 3-4 ppm gefunden (vgl. Tab. 5.1).
N AuCl N
LiBr
N
Aceton
N
38a
AuBr
Br2
N
DCM
N
38b: 26%
N Au Cl N 40a
LiBr
N
Aceton
N
Br Au Br Br
38c: 48%
AuBr
Br2
N
DCM
N
40b: 65%
Br Au Br Br
40c: 51%
Abbildung 5.5: Synthese der Komplexe 38b-40c.
Da bei einer oxidativen Addition von Brom Gemische von NHC-Au(III)Br2Cl1 und NHCAu(III)Br3 entstehen würden, wurde der Ligandenaustausch des Chlorids durch Bromid vorher durchgeführt.[133] 66
Carbenkomplexsynthese Tabelle 5.1: Chemische Verschiebungen der NHC-Au(I) Chloride im Vergleich zu den NHC-Au(I) Bromiden. (NHC)AuCl
δC (ppm)
(NHC)AuBr
δC (ppm)
δΔC (ppm)
38a
168.5
38b
172.3
+ 3.8
39a
171.0
39b
175.1
+ 4.1
40a
172.9
40b
176.3
+ 3.4
Um NHC-Au(III) Bromide herzustellen, wurden die entsprechenden NHC-Au(I) Bromide in DCM gelöst und 1.2 Äquivalente Brom zugegeben und für 1.5 h gerührt. Nach Entfernen des Broms und Umkristallisation aus DCM/Pentan erhält man die Gold(III)-Verbindungen als stabile, orange Verbindungen. Bei der Reaktion wurde keine Bindungsspaltung beobachtet und es fand keine Bromaddition an die Doppelbindung der Imidazoleinheit statt. Im Gegensatz zu den NHC-Gold(I) Bromiden wird hier eine Hochfeldverschiebung des Carbenkohlenstoffatoms im 13C NMR Spektrum beobachtet, typischerweise zwischen 35 und 39 ppm (vgl. Tab. 5.2).
Tabelle 5.2: Chemische Verschiebungen der NHC-Au(I) Bromide im Vergleich zu den NHC-Au(III) Bromiden. (NHC)AuBr
δC (ppm)
(NHC)AuBr3
δC (ppm)
δΔC (ppm)
38b
172.3
38c
133.8
- 38.5
39b
176.3
39c
135.8
- 39.3
40b
175.1
40c
141.33
- 35
Der Trends dieser Hochfeldverschiebung der Carbenkohlenstoffsignale liegt im Bereich der in der Literatur gefundenen Werte für NHC-Goldkomplexe.[133, 135, 136] Typischerweise bedeutet die Hochfeldverschiebung eine erhöhte Azidität am Goldzentrum, einhergehend mit einer höheren Oxidationsstufe. Von den Verbindungen 39c und 40c konnten Einkristalle für die Röntgenstrukturanalyse durch Überschichten von DCM mit Pentan bei RT gewonnen werden. Beide kristallisieren monoklin, 39c in der Raumgruppe P21 und 40c in der Raumgruppe P21/n. 67
Carbenkomplexsynthese
Abbildung 5.6: Molekülstruktur von 39c.
Abbildung 5.7: Molekülstruktur von 40c.
68
Carbenkomplexsynthese Tabelle 5.3: Ausgewählte Bindungslängen und –Winkel von 39c und 40c.
39c Bindungslänge
[Å]
Bindungswinkel
[°]
Au(1)-C(1)
2.0251(167)
C(1)-Au(1)-Br(3)
87.89(47)
Au(1)-Br(3)
2.4079(24)
C(1)-Au(1)-Br(2)
87.97(47)
Au(1)-Br(2)
2.4178(22)
C(1)-Au(1)-Br(1)
176.05(43)
Au(1)-Br(1)
2.4431(18)
Br(1)-Au(1)-Br(3)
91.39(8)
Br(2)-Au(1)-Br(3)
177.84(7)
40c Bindungslänge
[Å]
Bindungswinkel
[°]
Au(1)-C(1)
2.0160(78)
C(1)-Au(1)-Br(2)
87.43(18)
Au(1)-Br(3)
2.4220(9)
C(1)-Au(1)-Br(3)
89.34(18)
Au(1)-Br(2)
2.4151(8)
C(1)-Au(1)-Br(4)
178.71(19)
Au(1)-Br(4)
2.4399(10)
Br(4)-Au(1)-Br(2)
91.29(3)
Br(2)-Au(1)-Br(3)
176.25(4)
Wie bei d8-Metallen zu erwarten, ist das Goldzentrum nahezu quadratisch-planar koordiniert. Der NHC-Ligand übt einen leichten trans-Effekt aus, ersichtlich in der verlängerten Au-BrBindung trans zum NHC-Liganden mit 2.443 Å für 39c und 2.440 Å für 40c. Zusätzlich ist Verbindung 39c am C-10-Kohlenstoffatom S-konfiguriert; d.h. es ist keine Racemisierung während der gesamten Reaktion von der L-Aminosäure zum fertigen Imidazoliumpeptidsalz als Ligandenvorstufe aufgetreten.
5.1.1 Verlängerung des Peptidrestes
Zusätzlich zu Komplex 39a, die als Aminosäure Phenylalanin enthält, wurden aus dem Imidazoliumpeptidsalz 17 NHC-Gold-Komplexe hergestellt. Diese enthielten somit noch eine zusätzliche Aminosäure, was die Lipophilie erhöht. Das Imidazoliumsalz 17 wurde mit Ag2O über einen Zeitraum von 28 h zum NHC-Silber(I)Komplex umgesetzt. Dieser wurde dann nach der Isolierung direkt mit dem DMS-AuCl zum 69
Carbenkomplexsynthese entsprechenden Goldkomplex 44 umgesetzt, da er sich als nicht besonders stabil erwies. Die Farbänderung des Silberkomplexes von farblos nach braun im Verlauf mehrerer Stunden in Lösung legt die Vermutung nahe, dass wieder Ag2O entsteht. Der Gold(III)-Komplex 45 wurde analog der bereits diskutierten Methoden hergestellt. Beide Komplexe wurden vollständig analysiert. Im
13
C NMR-Spektrum findet sich das Gold-Carben-Signal für
Verbindung 44 bei 171.2 ppm und für 45 bei 137.9 ppm. Dies korreliert mit den erwarteten chemischen Verschiebungen. Die Gold-Verbindungen sind im Gegensatz zum Silbercarben stabil, auch in Lösung. Die Komplexe 44 und 45 wurden nicht für zytotoxische Untersuchungen verwendet, da sie bereits bei Zugabe weniger Tropfen Wasser aus DMSO ausfielen, somit also extrem hydrophob sind. Daher sollte die Auswahl der Aminosäuren verändert werden, oder die Funktionalisierung über den Ersatz der Halogenatome erfolgen (vgl. Abschnitt 5.2).
N Br O N
H N
N H
N
1) Ag2O 2) DMS-AuCl
O OCH3
AuCl N
CH2Cl2
O
HN
1) LiBr 2) Br2
N
CH2Cl2, Aceton
N
Au Br
O
HN
O
Br O
O NH
H3CO
Br
O
17
NH H3CO
44
O 45
Abbildung 5.8: Synthese der Goldcarbene 44 und 45.
5.2 Ersatz des ancillaren Chlorliganden durch Thiol-funktionalisierte Aminosäuren und Peptide
Um eine zusätzliche Biokonjugation der NHC-Gold-Komplexe zu erhalten, wurde Verbindung 40a durch Substitution des Chlorliganden mit einem Thiol-funktionalisierten Peptid, respektive Aminosäure funktionalisiert (s. Abb. 5.9).[70] 70
Carbenkomplexsynthese Zum einen sollte damit eine bessere Löslichkeit in organischen Lösungsmitteln/Wasser erreicht werden (43), sowie eine höhere Lipophilie im Falle von Verbindung 42, um so möglicherweise einen Einfluss auf die biologische Aktivität der Verbindungen zu nehmen.
NHBoc HN
O O
HS
N +
AuCl
NEt3,DCM
Au S
N
O
NHBoc
N HN
N
O O O
41
HS
NHBoc OH O
40a
+
42
NEt3,DCM
N
N Au S
AuCl
NHBoc
N
N
OH O 43
Abbildung 5.9: Ersatz des Chlorliganden durch Thiol-funktionalisierte Verbindungen.
Bei dem Ersatz des Chlorids durch den Schwefel der Thiolgruppe kann man sich den auranophilen Charakter des Schwefels zu Nutze machen. Basenvermittelt (hier NEt3) entsteht HCl aus den Edukten (als NEt3-Hydrochlorid abgefangen) und die Gold-Schwefelbindung wird aufgebaut. Die Reaktion kann mit Dünnschicht-Chromatographie verfolgt werden. Typischerweise war die Reaktion nach ca. 14 h beendet. Nach Filtration und Kristallisation aus DCM/Pentan erhält man die Produkte als weiße Pulver. Im
13
C NMR-Spektrum macht sich die Komplexierung durch eine Tieffeldverschiebung des
Carben-Kohlenstoffsignals um ca. 12.5 ppm zu 185.4 ppm im Falle von Verbindung 43, bzw. um 12.3 ppm zu 185.1 ppm für Verbindung 42 bemerkbar. Dies korreliert mit den Befunden für Thiol-funktionalisierte Gold-Carbene.[131] Das Goldatom ist durch den deutlich weniger elektronegativen Schwefel schwächer azide. Des Weiteren ist Schwefel ein besserer σ-Donor als Chlor und Brom; daher erscheint das Carben-Signal tieffeldverschoben im Vergleich zum NHC-Gold Chlorid.[67] 71
Carbenkomplexsynthese
5.3 Zusammenfassung
Die Synthese von linearen NHC-Gold(I) und (III)-Komplexen ließ sich gut auf die verwendeten Imidazoliumsalz-Vorstufen übertragen, nachdem der sterische Anspruch durch die Wahl von Tert-butyl- oder Diphenylmethylgruppen erhöht wurde. Allerdings stellte sich heraus, dass die Reaktion zum NHC–Gold-Komplex vom isolierten NHC-Silber-Komplex ausgehen muss, damit man eine kontrollierte Umsetzung erreicht. Alle synthetisierten Komplexe sind an Luft stabil, allerdings zersetzen sich einige bei längerer Exposition an Licht (39a) oder in Lösung (Silbersalz von 17). Daher wurden alle Verbindungen im Dunkeln gelagert. Es konnte keine Temperaturempfindlichkeit festgestellt werden.
72
Carbenkomplexsynthese Tabelle 5.4: Übersicht der chemischen Verschiebung des Metall-Carbenkohlenstoffes im 13C NMR (* : Signal zu schwach).
Verbindung
δ 13C [ppm]
Lösungsmittel
23a
142.1
CD2Cl2
23b
*
CD2Cl2
24a
175.5
CD2Cl2
24b
175.8
CD2Cl2
24c
175.0
CD2Cl2
24d
*
CD2Cl2
25
171.7
CD2Cl2
26
175.3
CD2Cl2
27a
170.7
DMSO-d6
27b
171.9
DMSO-d6
28a
170.0
DMSO-d6
28b
171.7
DMSO-d6
29
174.5
DMSO-d6
30
166.7
CD2Cl2
31b
*
CD2Cl2
32b
175.5
CD2Cl2
33
*
CD2Cl2
34a
176.1
CD2Cl2
34b
*
CD2Cl2
38a
168.5
CD2Cl2
38b
172.3
CD2Cl2
38c
133.8
CD3CN
39a
171.4
CD2Cl2
39b
175.1
CD2Cl2
39c
135.8
CD3CN
40a
172.9
CD2Cl2
40b
176.3
CD2Cl2
40c
141.3
CD3CN
42
185.1
CD2Cl2
43
185.4
CD2Cl2
44
171.2
CD2Cl2
45
137.9
CD2Cl2
73
Versuche zur Lipophilie und Hydrolyseexperimente
6. Versuche zur Messung der Lipophilie und der Hydrolyse von Chlorid-Liganden
Für die Vorhersage der Zellaufnahme einer Substanz ist die Lipophilie ein wichtiges Kriterium. Sie sollte hoch genug sein, um die Phospholipidmembran zu durchdringen. Allgemein wird die Lipophilie als Logarithmus des Wasser-Octanol-Verteilungskoeffizienten ausgedrückt (logP-Wert). Da viele Peptide selbst sehr hydrophil sind, können sie die Membran nicht durchdringen. Durch die Verbindung von Peptiden und metallorganischen Fragmenten ändern sich die Substanzeigenschaften; sie werden lipophiler und sollten damit eine höhere Chance haben, Zellmembranen zu durchdringen. Eine klassische Methode zur logP-Bestimmung ist die so genannte Shake-Flask-Methode, wobei Wasser mit n-Octanol ausgeschüttelt wird.[137] Mit der aliphatischen Kette und der Hydroxy-Gruppe des n-Octanols wird das H-Donor-H-Akzeptor-System von Phospholipiden nachempfunden. Eine elegantere Methode bedient sich der HPLC zur Ermittelung des logPWertes.[138, 139] Auf die HPLC-Methode wird hier nicht näher eingegangen, da beim Versuch, von Verbindung 29 den logP-Wert zu bestimmen, widersprüchliche Ergebnisse erhalten wurden. Während der Analyse trat die Bildung eines zweiten Peaks bei geringerer Retentionszeit und letztlich das vollständige Verschwinden des Ursprung-Peaks auf. Somit konnte kein logPWert ermittelt werden. Da für die HPLC-Methode Uracil, Decylamin und MOPS-Puffer zugesetzt werden müssen, wurde Verbindung 29 in MeOH gelöst und mit den drei Substanzen sowie Mischungen davon versetzt und mit der HPLC vermessen, um zu untersuchen, ob der Komplex 29 durch diese zersetzt wird bzw. mit diesen reagiert. Allerdings wurden keine zusätzlichen Peaks in der HPLC detektiert. Da zur Bestimmung des logP-Wertes mittels der HPLC-Methode ein höherer Wasseranteil in den Proben vorhanden ist, wurden Tests auf Hydrolyse durchgeführt. Bei den strukturverwandten RAPTA-Verbindungen ist die Hydrolyse der Ruthenium-ChloridBindung ein bekanntes Phänomen. Sobald der erste Ligand durch Wasser ausgetauscht wird, tritt sofort die zweite Hydrolyse auf.[120]
74
Versuche zur Lipophilie und Hydrolyseexperimente Anstelle von Verbindung 29 wurde Komplex 32a für Hydrolyseexperimente verwendet. Diese wurden wie folgt durchgeführt. Die Verbindung wurde entweder für 12 h in einem MeOH/Wasser-Gemisch (1:5) äquilibriert oder in ein wenig MeOH gelöst und mit 2 äq. AgNO3 (1 äq. pro Chlorid) in Wasser für 24 h äquilibriert. Anschließend wurden die Retentionszeiten mittels analytischer HPLC bestimmt. Als Bezugswert wurde Verbindung 32a in Acetonitril gelöst und sofort vermessen, um Hydrolyse zu unterbinden (vgl. Abb. 6.1).
Abbildung 6.1: HPLC-Studie zur Bestimmung der Stabilität in Wasser (Acetonitril- WasserGradient, 5-95% Acetonitril).
Bereits bei sofortiger Messung fällt die Bildung eines Peaks bei ca. 11 min auf (oranger Graph, a)). Dies könnte bereits auf eine Hydrolyse der Ruthenium-Chloridbindung hindeuten. Möglich ist auch eine partielle saure Hydrolyse des Ethylesters, da TFA in der mobilen Phase der HPLC vorhanden ist. Die Retentionszeit des Komplexes liegt jedoch eindeutig bei 15.35 min. 75
Versuche zur Lipophilie und Hydrolyseexperimente Der blaue Graph stellt die 12 h Hydrolysereaktion dar (b)). Der Peak bei 15.35 min ist vollständig verschwunden und es tritt ein neuer Peak bei 11.42 min auf. Es liegt also eine verringerte Retentionszeit um ca. 4 min vor. Eine leichte Schulter bei ca. 12.5 min kann nicht eindeutig zugeordnet werden. Somit ist die entstandene Verbindung deutlich hydrophiler als die Ausgangsverbindung. Vermutlich liegt eine vollständige Hydrolyse der RutheniumChloridbindungen vor, eventuell zusätzlich auch die Hydrolyse des Ethylesters. Ähnliche Ergebnisse wurden auch mit anderen Ruthenium-Aren-Komplexen beobachtet.[140] Um die vollständige Hydrolyse zu erhalten, wurde eine Lösung mit 2 äq. AgNO3 für 24 h umgesetzt. Das entstehende AgCl wurde abzentrifugiert und die Lösung ebenfalls mittels HPLC untersucht (grauer Graph, c)). Die Retentionszeit liegt hier bei 10.74 min. Der Unterschied in den Retentionszeiten für b) und c) kann nicht eindeutig interpretiert werden. Die wahrscheinlichste Ursache sind Druckschwankungen während der Messung. Im grauen Graph kann ebenfalls kein Edukt mehr detektiert werden. In Abbildung 6.1 sind Nitrat-Anionen als Gegenionen dargestellt. Möglich ist aber auch ein Austausch mit TFAAnionen aus der mobilen Phase. Prinzipiell kann dies auch für b) angenommen werden. Normalerweise tauschen Anionen mit dem TFA-Anion während der HPLC aus. Dies kann durch ESI-MS nicht verifiziert werden, da die Komplexe im positiven Modus vermessen wurden. Zusätzlich zu den HPLC-Versuchen wurden noch „erzwungene“ Hydrate erzeugt. Dafür wurde Komplex 32a in 1 mL MeOH gelöst und mit 1 bzw. 2 äq. AgNO3 (in 100 µL Wasser) für 24 h äquilibriert. Das AgCl wurde anschließend abzentrifugiert und Massenspektren (ESI+) aufgenommen (vgl. Abb. 6.2). Beim Vergleich des Edukt- Spektrum von 32a (oben) mit den erzwungenen Hydraten sieht man sofort anhand des Isotopenmusters, dass bei den erzwungenen Hydraten keine Chloridliganden mehr vorhanden sind. Als Peaks finden sich mit m/z = 375.0 der [M-2ClEtH]+-Peak und mit m/z = 331.0 der [M-2Cl-HCO2Et]+ -Peak als einzige Signale wieder. Diese Zuordnungen konnten anhand des Vergleichs mit den Isotopenmustern berechneter Molekülmassen getroffen werden.[141] Die Spektren für 1 oder 2 äq. AgNO3 gaben identische ESI-Massenspektren. Wahrscheinlich ist, dass, sobald ein Chloridligand abstrahiert wird, sofortige Hydrolyse des zweiten Chlorids auftritt. Dies wäre wiederum in Analogie zu den RAPTA-Verbindungen.[120]
76
Versuche zur Lipophilie und Hydrolyseexperimente
Abbildung 6.2: Vergleich der ESI-MS von Komplex 32a in Acetonitril und den erzwungenen Hydraten (24 h mit 1 bzw. 2 äq. AgNO3 in Wasser (Spektren identisch)). a) gemessenes Spektrum, b) simuliertes Spektrum.
77
Versuche zur Lipophilie und Hydrolyseexperimente
6.1 Zusammenfassung
Beim Versuch, logP-Werte für die synthetisierten Ruthenium-Verbindungen zu ermitteln, stellte sich heraus, dass die Chlorid-Liganden durch Wassermoleküle ausgetauscht werden. Dies hatte eine Verringerung der Retentionszeit um ca. 4 min und somit eine verringerte Lipophilie zur Folge. Dieser Befund konnte sowohl durch HPLC-Experimente, als auch durch ESI-MS bestätigt werden. Im Falle des exemplarisch untersuchten Ethylesters 32a wurde zusätzlich eine Hydrolyse des Esters festgestellt. Dies ist für das angestrebte Prodrug-Design dieses Komplexes eine erwünschte Eigenschaft, da davon auszugehen ist, dass auch unter in vivo-Bedingungen Hydrolyse durch Esterasen auftritt.[126] Somit scheinen Verbindungen, die Metall-Halogenbindungen aufweisen, für die Ermittelung von logP-Werten nicht geeignet zu sein, da sie sich in eine andere Spezies umwandeln, die viel hydrophiler als die Ausgangsverbindungen sind. Die NHC-Gold-Verbindungen wurden nicht auf logP-Werte untersucht, da fast alle bei Zugabe geringster Mengen Wasser ausfallen. Dies hätte die HPLC-Säule verstopft und wahrscheinlich unbrauchbar gemacht. Daher wurde auf diese Methode verzichtet. Aus dem hydrophoben Verhalten dieser Substanzen kann man von jedoch hohen logP-Werten ausgehen.
78
Biologische Aktivität
7. Biologische Aktivität
Um die Eigenschaften der synthetisierten NHC-Ruthenium(II)- und NHC-Gold(I, III)Komplexe zu untersuchen, wurden Tests auf antiproliferative Wirkung an den drei humanen Krebszelllinien HT-29, HeLa und HepG2 durchgeführt. Um die Zytotoxizität zu bestimmen, wird sowohl der Zellmetabolismus mittels Resazurin quantifiziert, als auch die absolute Zellzahl mit dem Kristallviolett-Assay bestimmt. Die IC50-Werte der getesteten Substanzen wurden ermittelt und diskutiert (Tests durchgeführt von Annika Groß (Ru) und Antonio Pinto (Au)). Des Weiteren wurde noch die antimetastatische Wirkung einiger strukturverwandter NHCRuthenium(II)-Komplexe auf MDA-MB-231 Zellen (hoch-invasive Brustkrebszellen) untersucht (Kollaboration mit Alberta Bergamo aus der Gruppe von Prof. Gianni Sava, Trieste).
7.1 Zytotoxizitätsassays und Krebszelllinien
7.1.1 Zytotoxizitätsassays
Für das Screening auf Zytotoxizität wurde der Resazurin-Assay als Indiz für Proliferation (Zellteilung) verwendet. Resazurin wird in der aktuellen medizinisch-chemischen Forschung als eine Art Gift-Indikator zur Messung der Zytotoxizität von Substanzen benutzt.[142] Man verwendet dabei eine wässrige blaue Resazurinlösung, welche von normal arbeitenden Zellen allmählich zum fluoreszierenden, rosafarbenen Resorufin metabolisiert wird. Lebende Zellen produzieren während ihres Stoffwechsels NADH, welches in einem Redoxprozess zur Produktion der Farbstoffe führt. Zytotoxische Stoffe verlangsamen oder stoppen diese Reduktion je nach ihrer toxischen Wirksamkeit. Die Farbabsorption wird mit einem UV/VISSpektrometer bestimmt und korreliert mit der metabolischen Aktivität der Zellen.
79
Biologische Aktivität Abnahme der Zellproliferation, Beschädigung oder Absterben der Zellen durch toxische Substanzen sind durch eine geringere Absorption des Resazurins ersichtlich.[142] Es kann auch alternativ die Zunahme der Fluoreszenz des Resorufins als Maß für die Viabilität der Zellen gemessen werden. Sind Zellen allerdings nur leicht beschädigt, so kann es sein, dass sie ihren Metabolismus hochregeln und damit einhergehend auch die Redoxaktivität. Dies kann zu höheren Absorptionswerten bei der Auswertung führen, die nicht unbedingt mit der absoluten Zellzahl übereinstimmen. Ein wichtiger Aspekt des Resazurin-Assays ist, dass er an lebenden Zellen durchgeführt wird und der Farbstoff nach dem Test durch Waschen entfernt werden kann. Somit kann die absolute Zellzahl durch den Kristallviolett-Assay nachträglich bestimmt werden. Kristallviolett ist ein basisches Chromophor, das bevorzugt die Zellkerne anfärbt und einen linearen Nachweis der Zellzahl ermöglicht.[143] Es ist nur bei adhärent wachsenden Zellen anwendbar. Sterben solche Zellen ab, verlieren sie ihre Fähigkeit zur Adhärenz und werden deshalb mit dem initialen Waschschritt des Assays entfernt. Alle verbliebenen Zellen werden anschließend fixiert und die Zellkerne angefärbt, und die Färbung wird photometrisch ausgewertet.[144] Die Stärke der Anfärbung korreliert mit der Anzahl der vitalen, adhärenten Zellen. Anschließend können diese jedoch nicht mehr für weitere Tests verwendet werden.
N O N
N NADH
O Na
O
N
O
NAD+ O Na
Resazurin
O
O N
Resorufin
Kristallviolett
Abbildung 7.1: Darstellung der Farbassays Resazurin (links) und Kristallviolett (rechts).
80
Biologische Aktivität 7.1.2 Zelllinien
Als Zelllinien wurden drei humane Krebszelllinien verwendet. HepG2 ist eine menschliche Hepatozyten-Krebslinie (Leberzellen). Hepatozytom-Zellen werden bevorzugt für anfängliche Zytoxizitätsstudien benutzt, da die Leber das hauptsächliche Entgiftungsorgan des Körpers ist, und deshalb als Sammelstelle für körperfremde Substanzen fungiert.[145] HepG2 sind adhärent wachsende Zellen. HeLa-Zellen sind immortalisierte menschliche Epithelzellen eines Zervixkarzinoms (Gebärmutterhalskrebs). Sie wachsen besser adhärent, können aber auch in Suspension wachsen. HT-29-Zellen stammen aus einem epithelialen Kolonadenokarzinoms (Darmkrebs). Sie wachsen ebenfalls adhärent.
7.2 Durchführung der Zytotoxizitätstests
Sowohl die Ruthenium- als auch die Gold-Carbene waren nicht in reiner wässriger Lösung löslich,
daher
wurde
eine
DMSO-Stammlösung
verwendet.
Daraus
wurde
eine
Verdünnungsreihe angesetzt, so dass die Endkonzentration des DMSO auf den Zellen bei 0.5% lag. In diesen Konzentrationen ist DMSO nur gering toxisch. Um eine Positivkontrolle bei den durchgeführten Zelltests zu haben, wurden zusätzlich als Testsubstanz Puffer mit 0.5% DMSO und reinem Nährmedium verwendet. Als zusätzliche zytotoxische Kontrolle wurde Cisplatin als Standard mitgeführt. Cisplatin ist ein seit mehr als zwanzig Jahren verwendetes Zytostatikum.[146] Im Falle der Gold-Carbene darf die Stammlösung nur schwach konzentriert sein, da ansonsten bei Zugabe von Wasser Präzipitation auftritt, was für die große Lipophilie der Substanzen spricht. Die Zellen wurden jeweils für 48 h mit den Testsubstanzen inkubiert, mit den Farbassays behandelt und die Absorption bei 590 nm bestimmt.
81
Biologische Aktivität 7.2.1 Zytoxizitätstests der NHC-Ruthenium(II)-Komplexe
Für den Test auf biologische Aktivität wurden die NHC-Rutheniumverbindungen 24a und 29 auf zwei Zelllinien getestet (HepG2 und HeLa). Die Imidazoliumsalze 6b, 18 und 19 wurden ebenfalls getestet, um die Zytotoxizität des Liganden selber zu untersuchen (vgl. Abb. 7.2). Die ebenfalls synthetisierten Rhodium(I)-Verbindungen wurden nicht getestet, da Rhodium(I)-Komplexe nicht stabil in wässriger Lösung waren (COD-Ligand). Die Zellen wurden für 48 h mit verschiedenen Konzentrationen (20, 50, 100, 500 µM und 1 mM für die Komplexe, 0.1 und 1 mM für die Imidazoliumsalze) inkubiert. Allerdings konnte keine Wachstumsinhibierung der Zellen festgestellt werden. Einzig der Komplex 24a zeigte bei 500 µM
eine
minimale
Verringerung
der
Zellzahl,
was
allerdings
in
diesen
Konzentrationsbereichen kein Indiz für gute zytotoxische Eigenschaften ist. Im Allgemeinen kann man den IC50-Wert für alle Substanzen als > 500 µM angeben.
N Br
N
N O
H N
N H
O
N
O
H N
R
N H
O
Br
O
CO2CH3
18: R = OH 19: R = NH2
CH3
6b
N N
Ru Cl
N
Cl H N
O N H
O
H N O
Ru
O N H
OH
N
Cl
Cl
O CO2CH3
29
24a
Abbildung 7.2: Getestete NHC-Ru(II)-Komplexe und deren Imidazoliumsalz-Vorstufen.
82
Biologische Aktivität Dieser Befund ist nicht weiter verwunderlich. Die strukturverwandten RAPTAVerbindungen, bei denen ein Phosphanligand anstelle des isolobalen NHC-Liganden vorhanden ist, zeigen ebenfalls keine hohe biologische Aktivität in in vitro Tests.[147] Einzig der RAPTA-C-Komplex zeigt Wirksamkeit gegen Eierstockkrebs.[87] Vielmehr weisen RAPTA-Verbindungen eine antimetastatische Wirkung auf.[120] Aufgrund dieser Befunde wurden verschiedene NHC-Ruthenium(II)-Komplexe in der Arbeitsgruppe von G. SAVA getestet, um diese auf antimetastatische Eigenschaften zu untersuchen (s. Abschnitt 7.3).
7.2.2 Zytoxizitätstests der NHC-Gold(I, III)-Komplexe
Die
NHC-Gold-Komplexe
wurden
vorrangig
hergestellt,
um
deren
zytotoxische
Eigenschaften zu untersuchen. Es wird vermutet, dass das Halogenatom in den Zellen durch SH-oder SeH-Gruppen von Enzymen ausgetauscht wird, und dadurch dann bestimmte Enzyme in ihrer Aktivität gehemmt werden, was zu Apoptose führen kann. In Mitochondrien erfolgt dies z.B. mit den SeH-Gruppen des Selenoenzyms Thioredoxin Reduktase TrX, dessen Inhibierung zu Apoptose führt.[95]
83
Biologische Aktivität
N AuX N N O
AuX
HN N
O
N
AuX
H3CO
N
38a: X = Cl, 38c: X = Br3
39a: X = Cl 39c: X= Br3
NHBoc
N Au S
40a: X= Cl 40c: X = Br3
N
HN
N
Au S O O
NHBoc
N OH
O
O
42
43
Abbildung 7.3: Getestete NHC-Goldverbindungen
In einer ersten Testreihe wurden alle hergestellten NHC-Au(I, III) Chlorid-, Bromid- und Thiolverbindungen in drei Konzentrationen (10, 100 und 500 µM) auf HT-29-, HepG2- und HeLa-Zellen getestet. Abbildung 7.4 zeigt exemplarisch die Auswertung für den ResazurinAssay von Verbindung 39a auf HT-29-Zellen. Die Absorption der nur mit Medium inkubierten Zellen wird als Standardwert auf 100% gesetzt und die anderen Werte werden dementsprechend angeglichen. Schon bei Konzentrationen ab 100 µM sieht man eine starke Abschwächung der Absorption des Resazurin. Die Ergebnisse der anderen Verbindungen waren ähnlich viel versprechend, daher wurden in der nächsten Testreihe die IC50-Werte der Verbindungen ermittelt.
84
Biologische Aktivität
Abbildung 7.4: Metabolische Aktivität (bestimmt mit Resazurin) nach Behandlung von HT-29-Zellen mit Verbindung 39a (Daten wurden von A. Pinto zur Verfügung gestellt).
7.2.3 IC50-Werte für die NHC-Gold-Verbindungen
Der IC50-Wert* gibt die minimale Konzentration einer Substanz an, bei der 50% der behandelten Zellen abgetötet worden sind. Dies wird allgemein als Maß für die Wirksamkeit einer Substanz betrachtet. Es werden mehrere Konzentrationen einer Substanz auf die jeweiligen Zellen aufgebracht und dann die gemessene Absorption gegen den Logarithmus der Konzentrationen aufgetragen. Normalerweise ergibt sich ein sigmoider Kurvenverlauf. Mit Hilfe der Boltzmann-Funktion ist der Wendepunkt der Kurve berechenbar, der die Konzentration bei halbmaximaler Absorption liefert – den IC50-Wert. Die Kurven wurden bis zur Konvergenz gefittet. Abbildung 7.5 gibt die Dosis-Wirkungskurven für die Verbindung 39c auf HeLa-Zellen und für Verbindung 40a auf HT-29-Zellen an, beide ermittelt aus dem Kristallviolett-Assay. Der IC50 für 39c beträgt 41.3 µM, der für 40a 2.7 µM. (vgl. linker Graph, Abb. 7.5).
* engl.: Inhibitory Concentration
85
Biologische Aktivität
Abbildung 7.5: Dosis-Wirkungskurve von 39c und 40a (die Konzentration ist logarithmisch aufgetragen) bestimmt aus dem Kristallviolett-Assay (Daten wurden von A.Pinto zur Verfügung gestellt).
Wenn man die einzelnen Substanzen vergleicht, fällt auf, dass die Zelllinien unterschiedlich stark von den Goldverbindungen im Wachstum gehemmt werden. Im Schnitt waren die Substanzen deutlich zytotoxischer auf den HeLa-Zellen und am wenigsten aktiv auf den HepG2-Zellen, mit Ausnahme von Verbindung 40a, die ähnliche IC50-Werte wie die Vergleichssubstanz Cisplatin liefert. Der Vergleich zwischen Gold(I)- und Gold(III)-Verbindungen zeigt nur im Falle der Verbindung 38c eine erhöhte Aktivität, ebenso für 39c auf HeLa-Zellen. Bei den anderen Tabelle 7.1: IC50-Werte auf HeLa-Zellen. Substanz
Resazurin IC50 [µM]
Kristallviolett IC50 [µM]
38a 38c 39a 39c 40a 40c 42 43 Cisplatin
12.2 ± 5.1 8 ± 1.3 52.7 ± 5 36.2 ± 12.9 5.8 ± 1.9 12.4 ± 3 29.4 ± 1.8 8.3 ± 1.4 7.3 ± 0.4
10 ± 3.7 4.5 ± 0.9 45.5 ± 4.8 41.3 ± 10.4 3.3 ± 0.9 27.3 ± 4.8 17.3 ± 3 3.4 ± 1.3 3.5 ± 2.5
Verbindungen ist dieser Effekt genau entgegengesetzt. Bei einigen Verbindungen wird Redoxaktivität in der Zelle als Kriterium für biologische Aktivität diskutiert,[148] daher sollte anhand der ermittelten IC50-Werte untersucht werden, ob die höhere Oxidationsstufe am 86
Biologische Aktivität Metall eine verstärkte Aktivität bedingen würde. Da sich die Ergebnisse jedoch für die unterschiedlichen Gold(III)-Verbindungen widersprechen, kann dies nicht eindeutig bestimmt werden. Anhand der Ergebnisse lässt sich eindeutig feststellen, dass die Verbindung 39a/c durch die
Tabelle 7.2: IC50-Werte auf HepG2-Zellen. Substanz
Resazurin IC50 [µM]
Kristallviolett IC50 [µM]
38a 38c 39a 39c 40a 40c 42 43 Cisplatin
186.9 ± 34.8 > 50 71.3 ± 5.9 > 250 > 50 65.3 ± 6.2 30 ± 2.6 20.4 ± 0.9 0.9 ± 0.1
119.0 ± 17.4 37.9 ± 11.5 61.4 ± 7.4 > 250 4.7 ± 2.5 28.5 ± 5.3 28.1 ± 4.5 15.2 ± 1.7 1.1 ± 0.1
Funktionalisierung mit einer Aminosäure an einem Stickstoffatom und einer Tert-butylgruppe am anderen Stickstoffatom der Imidazoleinheit des Liganden nicht an biologischer Aktivität gewonnen hat. Im Vergleich zu den Verbindungen 38a und 38c, die zwei Tert-butyleinheiten an den Stickstoffatomen aufweisen, ist keine signifikante verbesserte biologische Aktivität nachweisbar, mit Ausnahme auf HepG2-Zellen. Da Verbindung 39a die höchste Zytotoxizität auf allen getesteten Zelllinien aufwies, wurde sie mit Cystein und dem Dipeptid Cystein-Leucinethylester am Gold gekoppelt, um so eine mögliche verbesserte Zellaufnahme zu erhalten.
Tabelle 7.3: IC50-Werte auf HT-29-Zellen. Substanz
Resazurin IC50 [µM]
Kristallviolett IC50 [µM]
38a 38c 39a 39c 40a 40c 42 43 Cisplatin
62.7 ± 10.3 48.5 ± 6.2 58.9 ± 4.3 282.5 ± 41.8 5.2 ± 3 16.2 ± 1.6 34.6 ± 1.8 16.9 ± 1.7 12.3 ± 2.1
37.8 ± 11.4 13.5 ± 5.8 63.8 ± 6.7 125.8 ± 49.7 2.8 ± 1.7 12.7 ± 1.2 26.8 ± 2.1 10.5 ± 1.9 7.9 ± 1.2
87
Biologische Aktivität Vergleicht man die Werte untereinander, so ist die Aktivität für die mit Cystein-gekoppelte Verbindung 43 auf allen Zellen ähnlich der von 39a, auf HeLa-Zellen sogar identisch. Bei der Verbindung 42 sind die IC50-Werte bereits um ca. 10 Einheiten schlechter. Durch die Konjugation mit einem Peptid soll im Allgemeinen eine verbesserte Zellaufnahme und Löslichkeit erreicht werden.[149] Allerdings kann auch die Löslichkeit der Verbindungen so gering sein, dass sie in den Zellen einfach ausfallen und so weniger Substanz zur Zellinhibierung zur Verfügung stand. Die Kopplung mit nur einer Aminosäure verbessert die biologischen Eigenschaften nicht, allerdings ist die Aktivität auch nicht gehemmt.
7.2.4 Zusammenfassung
Die getesteten NHC-Goldverbindungen waren alle zytotoxisch auf den verwendeten humanen Krebszelllinien HeLa, HT-29 und HepG2. Die erhöhte Aktivität der 38c und 39c kann nicht durch die Freisetzung von Brom im Zytoplasma der Zelle, bedingt durch Reduktion der Gold(III)-Verbindung, hervorgerufen worden sein, da die Verbindung 40c ungefähr 3-8× weniger aktiv als Verbindung 40a auf allen getesteten Zelllinien ist. Die
Möglichkeit,
mit
einem
Biokonjugat
aus
Komplex
und
Aminosäure
Aminosäuretransporter zu aktivieren und so in Krebszellen eingeschleust zu werden, war ein weiterer Grund für die Wahl dieses Strukturmotivs der Komplexe 39a-c.[150] Trotzdem wurde keine verbesserte Aktivität beobachtet. Die verringerte Aktivität von 42 gegenüber 43 zeigt, dass das [NHC-Au]+-Fragment alleine nicht verantwortlich für die Zytotoxizität sein kann. Ob unterschiedliche IC50-Werte durch andere Zellaufnahmewege oder verschiedene intrazellulare Wechselwirkungen hervorgerufen werden, muss weiter untersucht werden.
88
Biologische Aktivität
7.3. Test auf antimetastatische Aktivität
Da die Rutheniumcarbene nicht das Wachstum der Krebszellen hemmen, wurden antimetastatische Tests von strukturverwandten Rutheniumcarbenen durchgeführt, um die Eigenschaften besser vergleichen zu können. Es wurde ausgehend von Verbindung 33, die Länge des zweiten Restes am Imidazol-Stickstoff variiert, um den Einfluss der Seitenkettenlänge zu untersuchen.
N N Ru N
N Cl
Ru
Cl
Cl
Cl
O
H N
N H
O
CO2CH3 24a
H N
O N H
O
OH O
29
N Ru
O N
O
N Ru N
Cl
33
N Cl
O Ru
N
Cl
Cl
Cl
HN O
H3CO
Cl
31a
26
Abbildung 7.6: Strukturen der auf antimetastatische Eigenschaften untersuchten Rutheniumcarbene.
Die in Abbildung 7.6 aufgeführten Ruthenium-Verbindungen wurden auf der hoch-invasiven MDA-MB-231 Brustkrebszelllinie getestet. Drei verschiedenen Konzentrationen (1, 10 und 100µM) der Rutheniumverbindungen wurden für 1 h auf den Zellen inkubiert und Substrat-
89
Biologische Aktivität frei gewaschen. Anschließend wurden die Zellen für 30 min mit einer 0.008% TrypsinLösung (w/v) auf einem Schüttler inkubiert und anschließend Trypsin-frei gewaschen. Die Trypsinierung soll die metastatische Aktivität in vivo simulieren. Anschließend wurde der Sulforhodamin B-Assay durchgeführt.
O O S O Na O S O O
N
O
N
Abbildung 7.7: Sulforhodamin B
Sulforhodamin B (SRB) färbt das Gesamtprotein der Zellen in Abhängigkeit des pH-Wertes. Nach der sauren Fixierung der Zellen werden diese mit der SRB-Lösung inkubiert, gewaschen und der gebundene Farbstoff anschließend im Basischen extrahiert. Die Absorption von Sulforhodamin wird bei 570 nm gemessen.[151] Mit der Fixierung der Zellen wird ein eindeutiger Endpunkt definiert. Die fixierten Platten sind bei Raumtemperatur unbegrenzt haltbar, so dass eine Auswertung des Assays auch zu einem späteren Zeitpunkt erfolgen kann. Die Absorption gibt Aussage darüber, wie viele Zellen noch adhärent sind; d.h. ob die Verbindungen Einfluß auf die Resistenz gegenüber Zellablösung bei Behandlung mit Trypsin haben. Dies ist ein erster Hinweis auf antimetastatische Eigenschaften. Der Vergleichswert (Crtl 100%) wurde auf 100% gesetzt. Er gibt die Absorption der Zellen an, die weder mit den Ruthenium-Verbindungen behandelt, noch trypsiniert wurden. Ctrl gibt die Absorption der Zellen an, die vor der Trypsinierung nicht mit den RutheniumVerbindungen inkubiert wurden. Beim Vergleich von Ctrl mit den unterschiedlichen Verbindungen fällt auf, dass 31a, 33 und 26 statistisch signifikante Werte aufweisen (Abb. 7.8). Verbindung 31a und 33 zeigen bereits bei niedrigen Konzentrationen eine hohe optische Dichte, was bedeutet, dass diese die Zellablösung gut hemmen, also antimetastatisch wirken. Diese Verbindungen sind in der 90
Biologische Aktivität Lage, konzentrationsabhängig die Resistenz gegenüber Ablösung zu erhöhen. Verbindung 29 und 24a scheinen gar nicht, oder nur in der höchsten Konzentration (29) aktiv zu sein.
Abbildung 7.8: One-way-Analyse der Varianz (ANOVA) und Dunnett Multiple Comparison Test auf MDA-MB-231 Zellen. ** p> 0.01 vs. Ctrl. (Graph wurde von A. Bergamo zur Verfügung gestellt).
Abbildung 7.9: Vergleich der Rutheniumverbindungen mit NAMI-A (alle 100µM) auf MDA-MB231 Zellen. ** p < 0.01; *** p < 0.001 vs. relevante Kontrollen. One-way-Analyse der Varianz (ANOVA) und Tukey-Kramer post test (Graph wurde von A. Bergamo zur Verfügung gestellt).
91
Biologische Aktivität In Abbildung 7.9 ist ein Vergleich der getesteten Rutheniumverbindungen mit NAMI-A dargestellt. NAMI-A ist ein gut antimetastatisch wirksamer Rutheniumkomplex (vgl. Abschnitt 1).[80, 85] Da die Daten aus unterschiedlichen Experimenten stammen, wurden sie normiert (Kontrollen der jeweiligen Experimente (Ctrl) wurden auf Null gesetzt), um den direkten Einfluß der Substanzen auf Zellablösung zu vergleichen. Positiv festzuhalten ist, dass die Verbindungen 31a und 33 in der verglichenen Konzentration (100µM) die Zellablösung genauso gut (33) und besser unterdrücken (31a) als NAMI-A. Weitere Tests mit diesen Substanzen, u.a. auf verschiedenen Zelllinien mit unterschiedlich stark invasiven Charakteristika, werden derzeit in Trieste (Alberta Bergamo) durchgeführt. Wenn man die Strukturen mit der Aktivität der Substanzen vergleicht, so ist die Aktivität entgegengesetzt der zunehmenden Komplexität und Seitenkettenlänge des NHC-Ligandens. Anscheinend sind kleine Moleküle als biologisch aktive Substanzen besser geeignet. Dies wäre im Sinne der von LIPINSKI aufgestellten Regeln für die Zellaufnahme von Substanzen.[152] Als eines der Kriterien für Zellaufnahme sei hier besonders die obere Grenze des Molekulargewichtes von 500 Dalton erwähnt.
92
Zusammenfassung
8. Zusammenfassung
In dieser Arbeit sollte die Synthese von N-heterozyklischen Carbenkomplexen und den entsprechenden Biokonjugaten etabliert werden. Desweiteren sollten erste Untersuchungen zur Eignung von N-heterozyklischen Carbenkomplexen als biologisch aktive Substanzen durchgeführt werden. Es wurden vor allem Komplexe analoger Phosphanverbindungen hergestellt, um den Einfluss des isolobalen Ligandenaustauschs zu beurteilen.[153] Als Ligandenvorstufe wurden Imidazoliumsalze ausgewählt, die in ihrer Struktur der Aminosäure Histidin ähneln, ebenso wie Thiazolylalanin als Seitenketten-funktionalisierbare Aminosäure. Als Biomolekül-Modellverbindungen wurden entweder einzelnen Aminosäuren oder [Leu]Enkephalin-Tyr gewählt, mit der Sequenz H-Gly-Gly-Phe-Leu-OH. Im ersten Teil dieser Arbeit wurden unterschiedliche Ligandenvorstufen hergestellt, die alle eine funktionelle Gruppe für weitere Kopplungen beinhalten. Des Weiteren wurden Thiazolium-Salze von Thiazolylalanin hergestellt, die direkt an ihrer freien Carboxyl-Gruppe funktionalisiert wurden. Zusätzlich wurden Imidazoliumpeptid-Salze in Lösung und an der festen Phase (SPPS) synthetisiert, so dass eine spätere Funktionalisierung mit einem Biomolekül
unnötig
wird.
Ein
Charakteristikum
ist
der
[M-Halogen]+-Peak
im
Massenspektrum (ESI, pos. Modus), der unabhängig von funktionellen Gruppen oder Heterozyklus (Thiazol, Imidazol) für alle hergestellten Salze gefunden wurde. Die Herstellung funktionalisierter Carbenkomplexe durch in situ Deprotonierung zum freien Carben
war
nur
im Falle
Wolframcarbonylkomplex
ließ
von sich
Verbindung jedoch
22
nicht
erfolgreich. weiter
zu
Der einem
so
erhaltene
Biokonjugat
funktionalisieren. Daher wurden zur Komplexsynthese NHC-Silber-Komplexe aus den Imidazolium- oder Thiazoliumsalzen mittels Ag2O hergestellt. Da die Silber-Carbenkohlenstoffbindung durch ihre Labilität ein ideales Carben-Transferreagenz darstellt, wurden Metallkomplexe von Ruthenium(II), Rhodium(I, III) und Gold(I, III) durch Transmetallierung dargestellt. Der Vorteil dieser Methode ist die Toleranz vieler funktioneller Gruppen (Ausnahme Dreifachbindungen und Carboxylgruppen). 93
Zusammenfassung Die Imidazoliumsalze ohne Aminosäuren als Reste am Imidazolring ließen sich alle zum Silbercarben, bzw. zum gewünschten Metallkomplex umsetzen. Wurden im Falle der Imidazoliumsalze Peptidketten als Seitengruppe am Stickstoffatom eingeführt, so wurde festgestellt, dass ab einer Peptidlänge von drei Aminosäuren keine Umsetzung mehr zum gewünschten Komplex auftrat. Problemlos in Lösung darstellbar war z.B. Verbindung 26, die mit einer Aminosäure an der Seitenkette funktionalisiert ist. Um längerkettige Peptidkomplexe mittels SPPS herzustellen, wurde in NMR-Studien die Toleranz
der
Metall-Carben-Kohlenstoffbindung
gegenüber
verschiedenen
TFA-
Konzentrationen bestimmt (Abspaltreagenz), um das geeignete Harz zu ermitteln. Die Ruthenium-Carbene stellten sich als stabil genug heraus, um an ein Festphasen-gebundenes Peptid gekoppelt zu werden und anschließend unter leicht sauren Bedingungen abgespalten zu werden.
Verbindung
wurde
29
daher
mittels
SPPS
hergestellt
und
vollständig
charakterisiert.[123]
N Ru N O
Cl
N Cl
N
N
Ru Cl Cl
HN
N H N
O H3CO
O
O N H
H N O
O
Rh Cl
N H
Cl
OH
H N
O O
26
29
O N H
OCH3 O
30
Abbildung 8.1: Strukturen der Verbindungen 26, 29 und 30.
Für Rhodium-Carbenbiokonjugate wurde auf Kopplung in Lösung zurückgegriffen und Verbindung 30 als Modellverbindung hergestellt. Von kationischen NHC-Gold-Komplexen ist hinlänglich bekannt, dass sie antimitochondriale Eigenschaften aufweisen, und somit großes Potential als Antitumortherapeutikum besitzen.[90, 92, 95]
Die Eignung als Zytostatika wurde in dieser Arbeit für lineare Gold(I, III)-
Carbenkomplexe untersucht.
94
Zusammenfassung Um den sterischen Anspruch der Imidazolium-Ligandenvorstufen zu erhöhen, wurden Tertbutyl- und Diphenylmethylgruppen eingeführt, wodurch exklusiv lineare NHC-GoldKomplexe hergestellt werden konnten. Alle in dieser Arbeit diskutierten Gold-Carbene sind vollständig analysiert worden und weisen insbesondere im
13
C NMR charakteristische
chemische Verschiebungen für die Metall-Carbenkohlenstoffbindung auf. Je nach ancillaren Ligand (S-R, Cl, Br) und Oxidationsstufe des Goldatoms (I, III) wurden typische Verschiebungen gefunden. Biologische
Eigenschaften
wie
z.B.
die
Membrandurchlässigkeit
sind
wichtige
physikochemische Parameter, die relevant für die Eignung als potentieller Wirkstoff sind. Daher wurde auch die Lipophilie, als ein solcher Parameter, von den Rutheniumverbindungen 29 und 32a untersucht. Allerdings konnte der Wasser/n-Octanol-Verteilungskoeffizient logP nicht bestimmt werden, da die Bildung einer neuen hydrophileren Spezies bei Verwendung der HPLC-Methode beobachtet wurde. Diese wurde mittels HPLC-Untersuchungen und ESIMassenspektren als Hydrat-Komplexe identifiziert. Anstelle der Metall-Chloridbindung konnte ein vollständiger Austausch mit Wassermolekülen als wahrscheinlich bestimmt werden. Dieses Verhalten ist analog bekannter Ruthenium-Aren-Verbindungen (RAPTAKomplexe).[154-156] Der logP-Wert der Gold-Carbene konnte nur anhand des Löslichkeitverhaltens abgeschätzt werden, da bei Zugabe von Wasser zu organischen Lösemitteln, teilweise oder vollständige Präzipitation auftrat (vgl. Abschnitt 6). Die Goldverbindungen werden mit wachsender Größe der Seitenketten am Stickstoffatom des Imidazolrings immer lipophiler. Zytotoxische
Untersuchungen
wurden
von
den
Ruthenium-Carbenen
und
den
Goldverbindungen auf den humanen Zelllinien HeLa, HepG2 und HT-29 durchgeführt. Im Falle der Rutheniumverbindungen wurde keine Wachstumsinhibierung gefunden (IC50 > 500 µM). Daher wurden ihre antimetastatischen Eigenschaften untersucht (s.u.). Im Falle der lipophilen Gold-Verbindungen konnten für alle getesteten Substanzen IC50Werte bestimmt werden. Der Einfluss der Oxidationsstufe auf die zytotoxischen Eigenschaften, z.B. durch Reduktion der Gold(III)-Verbindung zu einer Gold(I)-Verbindung unter Freisetzung von zellschädigendem Brom, konnte nicht gefunden werden.[157] Auffallend war, dass die unfunktionalisierten Verbindungen (40a-40c) die größte Aktivität auf diesen Zelllinien aufwiesen, vergleichbar mit Cisplatin. Es ist bekannt, dass NHC-AuFragmente bevorzugt an Schwefel binden. Um den Einfluss der Biokonjugation am Goldatom 95
Zusammenfassung direkt zu untersuchen, wurden von der Verbindung 40a durch Austausch des ancillaren Chloridligandens Thiol-Peptidkonjugate hergestellt. Da bei dem Dipeptidkonjugat 42 die Aktivität bereits stark nachlässt, kann das [NHC-Au]+-Fragment, das in allen Verbindungen vorhanden ist, nicht alleine ausschlaggebend für die biologische Aktivität sein.
N
Au S
N
N
NHBoc
N AuCl
Au S
HN
N
O O
OH O
O 40a
IC50 :
3.3
NHBoc
N
42
43
17.3
3.4
Abbildung 8.2: IC50- Werte von 40a, 42 und 43 auf HeLa-Zellen (Kristallviolett-Assay).
Die bisher durchgeführten Tests auf antimetastatische Aktivität lassen auf eine dosisabhängige Inhibierung der Zellablösung der untersuchten humanen, hoch-invasiven Brustkrebszelllinie MDA-MB-231 schließen. Die Aktivität ist umgekehrt proportional der Länge des Restes am Imidazolstickstoff und der zunehmenden Komplexität der Seitenkette. Anscheinend sind kleine unfunktionalisierte Ruthenium-Komplexe, oder RutheniumEthylesterkomplexe besonders geeignet. Im Vergleich mit der antimetastatisch wirkenden Verbindung NAMI-A zeigten die Verbindungen 31a und 33 gleich gute Eigenschaften. Um die Eignung der Verbindungen besser zu verstehen, werden aktuell Tests mit anderen Zelllinien mit unterschiedlich starken invasiven Charakteristika durchgeführt. Anhand der erhaltenen Ergebnisse für die Ruthenium- und Goldcarbene scheinen zu große biologische Reste die Aktivität als Zytostatika oder Antimetastatika zu verringern. Dies kann entweder durch zu hohe Lipophilie der Verbindungen hervorgerufen werden, oder durch eine Inaktivierung
des
Organometallfragmentes.
Bei
der
Untersuchung
der
Rutheniumverbindungen konnten ähnliche Eigenschaften in Bezug auf biologische Aktivität und Hydrolyse wie für die Phosphan-Analoga (RAPTA) festgestellt werden. Zukünftig sollten 96
Zusammenfassung weitere Tests durchgeführt werden, um einen möglichen Wirkmechanismus für das antimetastatische Verhalten zu finden. Für weitere Untersuchungen sollte versucht werden, besser wasserlösliche lineare NHC-GoldVerbindungen herzustellen, beispielsweise durch Funktionalisierung am Gold durch gut wasserlösliche Peptide. Des Weiteren wäre es interessant, die Rhodium(III)-Verbindungen ebenfalls auf antimetastatisches Verhalten zu untersuchen. Abschließend bleibt festzuhalten, dass NHC-Komplexe nur bedingt für die Fmoc-SPPS geeignet sind, da die Metall-Carbenkohlenstoffbindung nur Abspaltbedingungen für extrem säurelabile Linker toleriert, was die Auswahl an Peptiden stark einschränkt, da viele Aminosäuren Schutzgruppen tragen, die nur im stark sauren Milieu abgespalten werden können.
97
Experimenteller Teil
9. Experimenteller Teil
9.1 Apparativer Teil
Elementaranalyse
Die Elementaranalyse erfolgte auf einem Analytik Jena multi EA 3100 Analysator im C,H,N,S-Modus.
Massenspektrometrie Die charakteristischen Fragmente sind mit der möglichen Zusammensetzung in Klammern angegeben. FAB Massenspektren wurden auf Finnigan VG Autospec (Glycerol oder 3 Nitrobenzylalkohol (NBA) als Matrix) aufgenommen. ESI Spektren wurden auf Bruker Esquire 6000 (Sprühspannung 4 kV, Nebulizerdruck 10–20 psi, Trockengasfluss: 5–10 L/min, Kapillartemperatur 300°C, Flussrate 240 μL/h) aufgenommen.
NMR Spektroskopie NMR Spektren wurden auf folgenden Geräten aufgenommen: DRX 400 (1H bei 400.13 MHz und 13C bei 100.62 MHz), Bruker DRX 250 (1H bei 250.13 MHz, 19F bei 235 MHz und 13C bei 63 MHz) und Bruker DPX 200 (1H bei 200.13 MHz und 13C bei 50 MHz). Die chemischen Verschiebungen δ sind in ppm relativ zum nicht vollständig deuteriertem Lösemittel angegeben, das gegen TMS als externen Standard gesetzt wurde. Die Nomenklatur der Aminosäuren erfolgt nach Konvention (zu finden z.B. in der Biological Magnetic Resonance Data Bank). Verwendete Abkürzungen: s = Singulett, d = Dublett, t = Triplett, q = Quartett, ps-t = Pseudotriplett, quin = quintett, br. = breit, m = Multiplett.
98
Experimenteller Teil Infrarotspektren Die Schwingungsspektren wurden mit einem Perkin-Elmer 1600 Series FTIR Spektrometer als KBr Pressling aufgenommen.
Röntgenstrukturen
Die Röntgenstrukturen wurden von Herrn Dr. Merz und Frau M. Winter auf einem Oxford Excalibur II und einem Bruker AXS Diffraktometer durchgeführt und mit den Programmen SHELXL-97[158] und Platon–Squeeze ausgewertet.[159]
HPLC Analytik und Aufreinigung Die Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (High Performance Liquid Chromatography, HPLC) wurde auf einem Varian Pro Star Gerät mit Dynastar C-18 Umkehrphasensäulen (250 x 8 mm, analytisch, 250 x 10 mm semipräparativ) durchgeführt. Wasser und Acetonitril (HPLC-Reinheit) jeweils mit 0.1 % TFA wurden als Eluenten verwendet. Analytische HPLCs wurden bei einer Flussrate von 1 mL/min gemessen.
Wasser [%]
Acetonitril [%]
Zeit [min]
95
5
0
10
90
18
95
5
26
95
5
30
Mikrowellenunterstützte Peptidsynthese Die automatische mikrowellenunterstützte Peptidsynthese erfolgte am CEM Peptidsynthesizer Liberty mit folgenden Einstellungen: Fmoc-Entschützen: 20 % Piperidin in DMF, P = 35 Watt, t = 30 s, T = 75°C Koppeln: 0.2 M Aminosäure in DMF (4 äq.), 0.45 M TBTU in DMF (3.9 äq.), 2 M DIPEA in DMF (8 äq.), P = 24 Watt, t = 300 s, T = 75°C
99
Experimenteller Teil Chemikalien Alle Chemikalien für die Synthese waren analytisch rein, wenn nicht anders erwähnt. Alle Harze wurden in der Größe 200 mesh verwendet. DMF für die Peptidsynthese wurde von Roth bezogen. Lösemittel wurden über P4O10 (DMF), CaH2 (Acetonitril), CaCl2 (CH2Cl2, CHCl3) getrocknet oder vom Lösemittel-Trocknungssystem MBraun SPS (THF, Toluol) bezogen.
9.2 Methoden Solid Phase Peptide Synthesis, Festphasenpeptidsynthese (SPPS) Wenn nicht anders beschrieben, wurden alle manuellen Festphasenpeptidsynthesen nach folgendem Schema durchgeführt: Peptidreaktor: Filterspritze auf Schüttler 420 U/min Quellen: Am Anfang jeder Synthese wurde das Harz mit DMF für 1 h auf dem Schüttler leicht bewegt. Wenn die Peptidsynthese unterbrochen werden musste, wurde das Peptidylharz nach sorgfältigem Waschen mit DCM im Kühlschrank gelagert. Entschützen: die N-ständige Fmoc-Schutzgruppe wurde durch zweimaliges Behandeln mit einer Lösung von 20% Piperidin in DMF für 10 min entfernt. Waschen: Nach jedem Entschützen oder Koppeln wurde das Harz gründlich mit DMF gewaschen (3 × 2 min). Kuppeln: die Aminosäuren (4 äq.) wurden mit der äquimolaren Menge von HOBt und etwas weniger TBTU in genug DMF gelöst, dann wurde ein 10 äq. DIPEA dazugegeben und die Lösung für 3-5 min voraktiviert. Die Kopplungsdauer betrug zwischen 30 und 60 min. Abspalten: die verschiedenen Harze erfordern unterschiedliche Abspaltbedingungen, die bei dem jeweiligen Präparat aufgeführt werden. Fällen: Nach Abziehen des Lösemittels in vacuo wird das Rohprodukt mit kaltem Ether oder einer kalten Ether/Hexanmischung ausgefällt.
100
Experimenteller Teil
Zellkultur Zelllinien Die Zellinien HepG2, HT-29, und Hela wurden für Zytotoxizitätstest benutzt (durchgeführt von Annika Groß, Antonio Pinto). Für die antimetastatischen Untersuchungen wurde die Zelllinie MDA-MB-231 verwendet (durchgeführt von Alberta Bergamo, Trieste). HeLa (American Type Culture Collection CCL-2): HeLa-Zellen sind eine epitheliale Zervixkarzinomzelllinie, die aus der Gebärmutter einer 31 jährigen Afroamerikanerin gewonnen wurde. 1951 wurde sie von George Gey als erste permanente menschliche Zelllinie etabliert. HepG2 (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen ACC 180): Die HepG2-Zelllinie wurde 1975 aus dem hepatozellulären Karzinom eines 15 Jahre alten Patienten gewonnen. Aufgrund ihrer Ähnlichkeit mit Leberzellen sind sie als in vitro Testsystem für toxikologische Untersuchungen geeignet. HT-29 (American Type Culture Collection HTB-38): Die HT-29-Zelllinie wurde 1964 aus einem kolorektalen Adenokarzinom einer 44 Jahre alten Patientin gewonnen. HT-29-Zellen zeigen eine hohe Mucin-Expression und damit einhergehend eine ausgedehnte extrazelluläre Matrix, die verantwortlich für die hohe Tumorigenizität der HT-29-Zelllinie ist. MDA-MB-231 (American Type Culture Collection HTB-26): Die MDA-MB-231-Zellen wurden aus einem epithelialen Adenakarzinom (Brustkrebs) einer 51-jährigen Patientin gewonnen. Sie wachsen adhärent und sind hoch-invasiv.
101
Experimenteller Teil
Zellkulturbedingungen Alle Arbeitschritte wurden unter einer Sterilbank (Laminar Air) durchgeführt. Arbeitsflächen und Werkzeuge wurden zur Vorbeugung einer eventuellen Kontamination mit 70% Ethanol desinfiziert. Nur sterilisierte oder autoklavierte Utensilien und Lösungen wurden verwendet. Synthetisierte Substanzen wurden nur im hohen Reinheitsgrad eingesetzt.
Zytotoxizitätsbestimmung Zellkulturmedium (HeLa, HepG2, HT-29): Alle Zelllinien wurden in RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640 Medium mit Phenolrot kultiviert. Das Medium wurde zusätzlich mit 2 mM L-Glutamin sowie 100 U/mL Penicillin und 100 μg/mL Streptomycin und 10% fetalem Kälberserum (FCS) versetzt.
Assaymedium Für die photometrischen Assays wurde ein separates Medium verwendet. Hierbei handelte es sich um farbloses RPMI 1640 ohne Phenolrot, welchem ebenfalls 2mM L-Glutamin, 100 U/mL Penicillin sowie 100 μg/mL Streptomycin zugefügt wurden. So wurde eine geringe Mediumabsorption im Wellenlängenbereich der Assay-Reagenzien gewährleistet.
Aussäen der Zellen Die drei Zelllinien HeLa, HepG2 und HT-29 wurden verwendet. 96-Well Mikrotiterplatten (MTP) wurden mit 0.2% Gelatine beschichtet und anschließend 1 h unter der Sterilbank getrocknet. Da die Zelllinien unterschiedlich schnell wuchsen und eine unterschiedliche Kristallviolettaufnahme zeigten, war es nötig, unterschiedliche Zellzahlen auszusäen. Die Zellen wurden trypsiniert und das Pellet nach der Zentrifugation in Kulturmedium resuspendiert. Die genaue Zellzahl pro mL Medium wurde über eine Neubauerkammer bestimmt. Es wurden 3000 Hela-Zellen, 4000 HT-29-Zellen und 8000 HepG2-Zellen pro Well in 100 μL Medium für eine Substanzinkubation von 48 h ausgesät. Außerdem wurden, zusätzlich zu den für die Testsubstanzen benötigten Wells, weitere Zellen in Wells auf einer 102
Experimenteller Teil separaten Platte ausgesät. Diese wurden zur Bestimmung der Startpopulation für die Auswertung des Kristallviolett-Assays benötigt.
Applikation der Testsubstanzen Nach 24 h Inkubation bei 37°C und 5 % CO2 wurde das Kulturmedium entfernt und die zu testenden Verbindungen wurden in der gewünschten Konzentration in 100 μL frischem Kulturmedium appliziert. Es wurden konzentrierte Lösungen in DMSO von den Verbindungen hergestellt, die dann entsprechend der Endkonzentration auf den Zellen, verdünnt wurden. 1 μL des Konzentrats wurde dann zu 99 μL Kulturmedium im Well hinzugefügt um die gewünschte Konzentration zu erreichen. Als Blindkontrolle wurden 0.5% DMSO in Kulturmedium ebenfalls getestet. Anschließend wurden die Zellen für weitere 48 h bei 37°C und 5% CO2 inkubiert.
Resazurin-Assay Nach Beendigung der 48 h Inkubationsphase wurden der Resazurin- und anschließend der Kristallviolett-Assay durchgeführt. Dazu wurde das Medium mit Testsubstanzen von den Zellen abgesaugt und diese einmal mit Kulturmedium und zweimal mit vorgewärmtem Assaymedium gewaschen. Anschließend wurde ein ausreichendes Volumen Assaymedium und Resazurin im Verhältnis 9:1 gemischt und jeweils 100 μL davon in jedes Well gegeben. Anschließend wurde die MTP 60 s in einem TECAN Saphire2 Elisareader geschüttelt und die Absorption bei 600 nm gegen eine Referenzwellenlänge von 690 nm bestimmt. Nach 120 min Inkubation bei 37°C und 5% CO2 wurde die Absorptionsmessung wiederholt. Aus der Differenz wurde die Abnahme der Absorption als relatives Maß für die Viabilität der Zellen erhalten.
Kristallviolett-Assay Auf den Resazurin-Assay folgte der Kristallviolett-Assay. Dazu wurden die Zellen 10 min lang bei RT mit 4% Paraformaldehyd (PFA) fixiert. Zuerst wurde einmal mit 1×PBS-Puffer (Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung) gewaschen anschließend mit 0.1% Triton x-100 in 1×PBS. Dann wurden die Zellen unter Schütteln mit 0.04% Kristallviolettlösung in 4% Ethanol/H2O gefärbt. Überschüssiges Kristallviolett wurde durch Waschen (4×) entfernt, dann 103
Experimenteller Teil wurden die Wells vollständig mit destilliertem H2O gefüllt und 10 min stehen gelassen. Zum Abschluss wurden die Wells durch vorsichtiges Ausklopfen getrocknet und das Kristallviolett durch Schütteln (3 h) mit 100 μL Ethanol eluiert. Die Absorption wurde durch Auslesen der MTP bei 570 nm Wellenlänge gegen eine Referenzwellenlänge von 655 nm bestimmt. Für die Auswertung musste noch der Kontrollwert nach 24 h subtrahiert werden, der auf die gleich Weise bestimmt wurde.
Berechnung der Zytotoxizität Die Zytotoxizität der einzelnen Substanzkonzentrationen wurde als relative Werte für beide Assays berechnet. Bei Resazurin wurde die Viabilität der Zellen als Maßstab genommen, welche sich an der metabolischen Aktivität orientiert. Der Kristalviolett ermöglicht es, die Zytotoxizität anhand der noch vorhandenen Zellmasse zu quantifizieren. Für Resazurin wurde dafür Gleichung (1) und für den Kristallviolettassay Gleichung (2) benutzt.
Viabilität Re s (%) =
S Abs ⋅ 100 K Abs
(1)
Zellmasse KV (%) =
( S Abs − I Abs ) ⋅ 100 ( K Abs − I Abs )
(2)
SAbs = Absorptionsmittelwert bei einer der eingesetzten Substanzkonzentrationen KAbs= Absorptionsmittelwert der Lösungsmittelkontrolle oder nicht behandelter Zellen, falls kein Lösungsmittel benutzt wurde. IAbs = Absorptionsmittelwert der Ausgangszellmenge zu Beginn der Substanzinkubation
Bestimmung von IC50-Werten Der IC50-Wert (inhibitory concentration) entspricht der Wirkstoffkonzentration bei der das Wachstum einer Zelllinie um 50% gehemmt wird. Dazu wurden die Zellen verschiedenen Konzentrationen im erwarteten Wirkungsbereich ausgesetzt. Anschließend wurden die IC50Werte für den Resazurin-Assay und den Kristallviolett-Assay berechnet. Dazu wurden die sich ergebenden relativen Zytotoxizitäten gegen den Logarithmus der Substanzkonzentration in einem Diagramm aufgetragen, und der IC50-Wert aus einem mit der Boltzmann-Funktion 104
Experimenteller Teil ermittelten sigmoiden Kurvenverlauf der Dosis-Wirkungskurve berechnet (Origin 7.0, Origin Corporatio, Northampton, USA).
Test auf antimetastatische Eigenschaften Zellkulturmedium (MDA-MB-231): Die MDA-MD-231-Zellen wurden in DMEM (Dubecco’s Modified Eagle’s Medium) kultiviert. Das Medium wurde zusätzlich mit 2 mM L-Glutamin, 1% nicht-essentiellen Aminosäuren, 100 U/mL Penicillin, 100 μg/mL Streptomycin sowie 10% FCS versetzt.
Aussäen der Zellen 6×103 Zellen pro Well einer 96 MTP (Corning Costar, Plastik) wurden in 0.2 mL Komplettmedium ausgesät. Nach 48 h bei 37°C wurde das Medium durch serum-freies Medium ersetzt, das 0.1% BSA (Rinderserumalbumin, bovin serum albumin) (w/v) enthielt.
Applikation der Testsubstanzen Nach 24 h wurde das Medium entfernt und die Zellen wurden mit CMF-DPBS (Calcium- und Magnesium-freie Dulbecco's Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung, Dulbecco’s phosphatebuffered
saline)
gewaschen.
Dann
wurden
die
Rutheniumverbindungen
in
drei
Konzentrationen (1, 10 und 100 µM) in DPBS (Dulbecco's Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung) gelöst und zu den Zellen gegeben und für 1 h bei 37°C inkubiert. Die Zellen wurden zweimal mit CMF-DPBS substanz-frei gewaschen. 0.008% Trypsin (w/v) wurde zugegeben und für 30 min bei RT auf einem Schüttler stehen gelassen. Die Zellen wurden mit CMF-DPBS trypsin-frei gewaschen. Zellen, die anschließend noch adhärent waren, wurden durch den Sulforhodamin B-Assay detektiert.
Sulforhodamin B-Assay Die Zellen wurden mit 10% (v/v) kalter Trichloressigsäure (TCA) bei 4°C für 1 h fixiert. Das TCA wurde verworfen und die MTP 5× mit destillierten Wasser gewaschen und an der Luft 105
Experimenteller Teil getrocknet. Sulforhodamin B (SRB)-Lösung (0.4% (w/v) in 1% Essigsäure) wurde zu den Wells gegeben und die Platte wurde für 30 min bei RT damit inkubiert. Nicht gebundendes SRB wurde 3× mit 1% Essigsäure gewaschen. Die Platten wurden an Luft getrocknet und der gebundene Farbstoff wurde mit ungepufferten 10 mM Tris Base (Tris-hydroxymethylaminomethan) bei pH 10.5 gelöst und die optische Dichte wurde bei 570 nm mit einem automatisierten Spektralphotometer gemessen (SpectraCount, Packard, Meriden, CT).
106
Experimenteller Teil
9.3 Synthese und Charakterisierung
Synthese von 4-Brommethylbenzoesäurepentafluorphenylester
F
F F
O O F
Br
F
1
Zu einer gekühlten Lösung (-10°C) von 4-Bromomethylbenzoesäure (2.15 g, 10 mmol) und Pentafluorphenol (1.84 g, 10 mmol) in Ethylacetat/DMF (30 mL/1 mL) wird N,N’Dicyclohexylcarbodiimid (2.06 g, 10 mmol) gegeben. Die Mischung wird für 1 h bei 0°C gerührt und dann langsam auf RT erwärmt. Nach 4 h wird das Nebenprodukt Dicyclohexylharnstoff abfiltriert und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt. Man erhält 1 als einen weißen Feststoff (1.57 g, 41%).
1: C14H6BrF5O2 (381.09 g/mol): EA, ber. C, 44.12; H, 1.59; gef. C, 45.83; H, 2.38. - MS (Fab, NBA): m/z = 383 [M–Br]+. - 1H NMR (DMSO-d6, 250 MHz ): δ = 8.17 (2H, AA’XX’, N = 8.11 Hz, HAr), 7.72 (2H, AA’XX’, N = 8.11 Hz, HAr) , 4.82 (2H, s, Br-CH2-Ar). - 13C NMR (DMSO-d6, 63 MHz): δ = 145.7 (Cq,Ar), 130.8 (CAr), 125.4 (CAr), 32.6 (Br-CH2-Ar). -
19
F
NMR (DMSO-d6, 235 MHz): δ = -153.5 (2F, d, 3JF,F =19.10 Hz, ArF), -157.5 (1F, 3JF,F = 23.17, Hz, ArF), -163.2 (2F, dd, 3JF,F = 19.10, 23.17 Hz, ArF).
107
Experimenteller Teil Synthese von Isopropylimidazol
N N
2
Zu wasserfreiem Toluol (100 mL) in einem Dreihalskolben mit Rückflußkühler gibt man portionsweise Kalium (3.91 g, 0.1mol), gegebenenfalls unter Kühlung. Es wird solange refluxiert, bis sich das Kalium in kleine Stückchen aufgelöst hat. Dann gibt man portionsweise Imidazol (7.49 g, 0.11 mol) unter Gegenstrom zu. Das Toluol wird solange unter Reflux gehalten, bis sich das Kalium vollständig umgesetzt hat und das Kaliumimidazolat als weißes Pulver ausgefallen ist.Kaliumimidazolat wird auf einer Argonfritte filtriert, mit wasserfreiem Toluol gewaschen (100 mL) und die Suspension in einen Schlenkrohr mit Teflonverschluß überführt, in dem 2-Brompropan (8.63 mL, 0.1mol) vorgelegt sind. Das Gemisch wird über Nacht bei 120°C im abgeschlossenen Schlenkrohr gerührt. Man lässt auf RT abkühlen und der Niederschlag wird abfiltriert und mit CHCl3 (50 mL) gewaschen. Die organische Phase wird dreimal mit H2O extrahiert, über Na2SO4 getrocknet und das Lösemittel im Ölpumpenvakuum abgezogen. Man erhält als Produkt ein gelbliches Öl (5 g, 45%).
2: C6H10N2 (110.16 g/mol): GC-MS (EI,70 eV, 290°C): m/z = 110 [M+] (76%), 95 (21), 68 (100), 41 (53), 27 (13). - 1H NMR (C6D6, 200 MHz): δ = 7.31 (1H, 2, N=CH-N), 7.22 (1H, s, N-CH=CH-N), 6.56 (1H, s, N-CH=CH-N), 3.52 (1H, dd, 3J =6.7 Hz, 2JH,H = 13.4 Hz, NCH(CH3)2), 0.85 (6H, d, 3J =6.7 Hz, 6 H, CH(CH3)2). -13C NMR (C6D6, 50 MHz): δ = 128.5 (N=CH-N), 116.4 (N-CH=CH-N), 116.36 (N-CH=CH-N), 48.6 (N-CH(CH3)2), 24.0 (NCH(CH3)2).
108
Experimenteller Teil Synthese von Tertbutylimidazol
N N 3 Glyoxal (30% wässrige Lösung, 5.71 mL, 50 mmol) und Tert-butylamin (5.25 mL, 50 mmol) werden in Methanol (100 mL) und Wasser (25 mL) gelöst und auf 70°C erhitzt. Formaldehyd (37% wässrige Lösung, 3.44 mL, 50 mmol) wird zugeben, danach tropfenweise Ammoniak (25% wässrige Lösung, 3.7 mL, 50 mmol). Man lässt für 6 h bei 70°C rühren und anschließend auf RT abkühlen. Flüchtige Substanzen werden unter vermindertem Druck entfernt. Der ölige braune Rückstand wird in Dichlormethan (75 mL) gelöst und es wird mit Wasser (3 × 50 mL) extrahiert. Die organische Phase wird über Na2SO4 getrocknet und das Lösemittel am Rotationsverdampfer entfernt. Das braune Öl wird mit dem Kugelrohr destilliert. Man erhält als Produkt ein gelbliches Öl (Sdp. 50-70°C, 0.2-0.4 mbar, 1.89 g, 30%, Reinheit > 90%).
3: C7H13N2 (124.1 g/mol): GC-MS (EI, 70 eV, 290°C): m/z = 124 [M]+. - 1H NMR (CDCl3, 250 MHz ): δ = 7.53 (1H, s, N-CH=N), 6.96 (2H, s, N-CH=CH-N), 1.48 (9H, s, NCH(CH3)2). - 13C NMR (CDCl3, 63 ΜΗz): δ = 134.5 (N-CH=N), 128.6 (N-CH=CH-N), 54.6 (N-C(CH3)3), 27.6 (N-C(CH3)3).
109
Experimenteller Teil Synthese von 1-(Diphenylmethyl)-imidazol
N N
4 Zu einer Lösung von Imidazol (4 g, 58.79 mmol) in H2O gibt man AgNO3 (10 g, 58.79 mmol) und rührt für 5 min. Anschließend lässt man ü.N. bei 8°C auskristallisieren. Die Kristalle werden abgenutscht und mit H2O, EtOH und Et2O gewaschen und am Ölpumpenvakuum getrocknet. Man erhält das Silberimidazolat als durchsichtige Nadeln. (6 g, 59%). Silberimidazolat (5.66 g, 23 mmol) und Bromdiphenylmethan (4 g, 23 mmol) werden in Acetonitril gelöst (30 mL) und für 5 Tage bei RT gerührt. Anschließend wird durch Celite filtriert und das Lösemittel unter vermindertem Druck entfernt. Das Produkt wird säulenchromatographisch aufgereinigt (SiO2, CH2Cl2/MeOH (2.5-10%), Rf (CH2Cl2/MeOH 9:1) = 0.5). Man erhält 4 als ein weiß-gelbes Pulver (3.31 g, 61%).
4: C16H14N2 (234.12 g/mol): GC-MS (EI,70 eV, 290°C): m/z = 234 [M+]. - 13C NMR (CDCl3, 63 MHz): δ = 138.3 (N=CH-N), 136.4 (Cq,Ar), 129.6 (CAr), 129.5 (CAr), 128.4 (CAr), 121.7 (NCH=CH-N), 67.3 (N-CH(PH)2).
110
Experimenteller Teil Synthese von 1-(4-Bromophenyl)-imidazol
Br
N N
5a
Imidazol (3.06 g, 45 mmol) und 4-Bromfluorbenzol (3.3 mL, 30 mmol) werden in wasserfreiem DMF (50 mL) im Zweihalskolben vorgelegt. Danach wird NaH (1.08 g, 60% mash, 45 mmol) zugegeben. Danach wird für 4 h auf 100°C erhitzt und auf RT abgekühlt und ü.N. gerührt, wobei die Lösung sich gelb verfärbt und ein weißer Niederschlag ausfällt. Man gießt die organische Phase auf Wasser und extrahiert mit CH2Cl2 (3 × 50 mL). Die vereinigten organischen Phasen werden über Na2SO4 getrocknet und das Lösemittel unter vermindertem Druck entfernt. Das Rohprodukt wird säulenchromatographisch aufgereinigt (SiO2, CH2Cl2/5% MeOH, Rf (CH2Cl2/5% MeOH) = 0.2). Man erhält 5a als ein weißes Pulver (3.48 g, 26%).
5a: C9H7BrN2 (221.98 g/mol): EA, ber. C, 48.46; H, 3.16; N, 12.56; gef. C, 48.80; H, 3.22; N, 12.55. MS (Fab, NBA): m/z = 221.9, 223.9 [M79,81Br]+. - 1H NMR (200 MHz, CD2Cl2): δ = 7.79 (1H, br.s, N=CH-N), 7.61-7.53 (2H, m, HAr), 7.27-7.18 (4H, m, HAr, N-CH=CH-N). 13
C NMR (CDCl3, 50 MHz): δ = 138.0 (Cq,Ar), 137.1 (N=CH-N), 134.6 (CAr), 132.4 (N-
CH=CH-N), 124.6 (CAr), 122.5 (N-CH=CH-N), 119.7 (Cq,Ar).
111
Experimenteller Teil Synthese von 1-(4-Iodophenyl)-imidazol
I
N N
5b
Imidazol (1.02 g, 15 mmol) und 4-Iodfluorbenzol (1.15 mL, 10 mmol) werden in wasserfreiem DMF (20 mL) im Zweihalskolben vorgelegt. Danach wird NaH (0.6 g, 60% mash, 15 mmol) zugegeben. Es wird für 5 h auf 100°C erhitzt und auf RT abgekühlt und ü.N. gerührt, wobei die Lösung sich gelb verfärbt und ein weißer Niederschlag ausfällt. Man gießt die organische Phase auf Wasser und extrahiert mit CH2Cl2 (3 × 50 mL). Die vereinigten organischen Phasen werden über Na2SO4 getrocknet und das Lösemittel unter vermindertem Druck entfernt. Das Rohprodukt wird säulenchromatographisch aufgereinigt (SiO2, CH2Cl2/ 5% MeOH, Rf (CH2Cl2/ 5% MeOH) = 0.57). Man erhält 5b als ein weißes Pulver (343 mg, 13%).
112
Experimenteller Teil Synthese von 1-(4-Methylbenzoesäure)-3-methylimidazoliumbromid
CO2H N Br N
6a
Methylimidazol (1.67 mL, 21 mmol, 2.1 äq.) wird in wasserfreiem THF (20 mL) in einem Zweihalskolben mit Rückflusskühler vorgelegt. Dazu tropft man langsam eine Suspension von α-Brom-p-Toluolsäure (2.15 g, 10 mmol) in THF (15 mL). Das Gemisch wird über Nacht bei 78°C refluxiert. Man lässt auf RT abkühlen und dekantiert das THF vom weißen Niederschlag. Der Niederschlag wird mit THF (3 × 20 mL) gewaschen und danach am Ölpumpenvakuum getrocknet. Man erhält als Produkt ein weißes Pulver (1.96 g, 66%).
6a: C12H13BrN2O2 (296.02 g/mol): EA, ber. C, 48.50; H, 4.41; N, 9.43; gef. C, 48.02; H, 4.92; N, 10.85.- MS (Fab, NBA): m/z = 517 [2M-Br+H]+, 515 [2M-79Br+H]+, 239 [M-Br+Na]+, 221.7 [M-Br]+. - 1H NMR (DMSO-d6, 200 MHz): δ = 9.39 (1H, s, N=CH-N), 7.87 (1H, t, 3J = 1.70 Hz, N-CH=CH-N), 7.79 (1H, t, N-CH=CH-N), 7.96 (1H, AA’XX’, N = 8.22 Hz, HAr), 7.54 (1H, AA’XX’, N =8.25 Hz, HAr), 5.58 (2H, N-CH2-Ar), 3.88 (3H, s, N-CH3). - 13C NMR (DMSO-d6, 50 MHz): δ = 166.8 (COO), 139.4 (Cq,Ar), 136.9 (N=CH-N), 131.1 (Cq,Ar), 129.7 (CAr), 128.3 (CAr), 124.0 (N-CH=CH-N), 122.7 (N-CH=CH-N), 51.2 (N-CH2-Ar), 35.9 (NCH3).
113
Experimenteller Teil Synthese von 1-(4-Methylbenzoesäuremethylester)-3-methylimidazoliumbromid
N
Br
N
CO2CH3
6b
Methylimidazol (0.75 mL, 10 mmol) wird in wasserfreiem THF (10 mL) in einem Zweihalskolben mit Rückflusskühler vorgelegt. Dazu tropft man langsam eine Lösung von 4Brommethylbenzoesäuremethylester (2.29 g, 10 mmol) in THF (10 mL). Das Gemisch wird über Nacht bei 78°C unter Rückfluß gehalten. Man lässt auf RT abkühlen und dekantiert das THF vom weißen Niederschlag. Der Niederschlag wird THF gewaschen (2 × 10 mL) und danach am Ölpumpenvakuum getrocknet. Man erhält 6b als weißen Feststoff (2.42 g, 78%).
6b: C13H15BrN2O2 (311.17 g/mol): EA, ber. C, 50.18; H, 4.86; N, 9.00; gef. C, 49.29; H, 5.86; N, 8.86. – MS (Fab, NBA): m/z = 231 [M-Br]+. - 1H NMR (DMSO-d6, 200 MHz): δ = 9.31 (1H, s, N=CH-N), 7.99 (2H, AA’XX’, N= 8.33 Hz, HAr), 7.84 (1H, t, 3J = 1.62 Hz, NCH=CH-N), 7.91 (1H, t, 3J = 1.62 Hz, N-CH=CH-N), 7.55 (2H, AA’XX’, N = 8.33 Hz, HAr), 5.56 (2 H, s, N-CH2-Ar), 3.88 (3H, s, CO2CH3), 3.85 (3H, s N-CH3). – 13C NMR (DMSO-d6, 50 MHz): δ = 165.7 (COCH3), 140.0 (Cq,Ar), 136.9 (N=CH-N),129.7 (Cq,Ar), 129.6 (CAr), 128.4 (CAr), 124.0 (N-CH=CH-N), 122.4 (N-CH=CH-N), 52.2 (N-CH2-Ar), 51.2 (CO2CH3), 35.9 (N-CH3).
114
Experimenteller Teil Synthese von 1-(4-Methylbenzoesäurepentafluorphenylester)-3-methylimidazoliumbromid
N
Br
F
N
O
F
F
O
F F
6c Methylimidazol (0.25 g, 3 mmol) wird in wasserfreiem THF (10 mL) in einem Zweihalskolben mit Rückflusskühler vorgelegt. Dazu tropft man langsam eine Lösung von 1 (1.14 g, 3 mmol) in THF (10 mL). Das Gemisch wird über Nacht bei 78°C unter Reflux gehalten. an lässt auf RT abkühlen und dekantiert das THF vom weißen Niederschlag. Der Niederschlag wird mit THF (3 × 10 mL) gewaschen und danach am Ölpumpenvakuum getrocknet. Man erhält als Produkt einen weißen hygroskopischen Feststoff (1.09 g, 78%).
6c: C18H12BrF5N2O2 (463.2 g/mol): EA, ber. C, 46.67; H, 2.61; N, 6.05; gef. C, 46.22; H, 3.78; N, 6.08. - MS (Fab, NBA): m/z = 847 [2M-Br]+, 383[M–Br]+. - 1H NMR (DMSOd6, 250 MHz): δ = 9.31 (1H, s, N-CH-N), 8.23 (2H, AA’XX’, N = 8.54 Hz HAr), 7.85 (1H, s, N-CH=CH-N), 7.79 (1H, s, N-CH=CH-N), 7.69 (2H, AA’XX’, N = 8.54 Hz, HAr), 5.64 (2H, s, N-CH2-Ar), 3.89 (3H, s, N-CH3). - 13C NMR (DMSO-d6, 63 ΜΗz): δ = 142.3 (Cq,Ar), 137.0 (N=CH-N), 130.9 (CAr), 129.1 (CAr), 125.9 (CqAr), 124.1 (N-CH=CH-N), 122.4 (N-CH=CHN), 51.2 (N-CH2-Ar), 35.9 (N-CH3). -
19
F NMR (CD2Cl2, 235 MHz): δ = -153.6 (2F, d, 3J
=19.12 Hz, ArF), -157.3 (1F, t, 3J = 23.19, Hz, ArF), -162.2 (2F, dd, 3J = 19.12, 23.19 Hz, ArF).
115
Experimenteller Teil Synthese von 1-(4-Methylbenzoesäuremethylester)-3-isopropylimidazoliumbromid
N N Br CO2CH3
7a 2 (1.1 g, 10 mmol) wird in wasserfreiem THF (50 mL) in einem Zweihalskolben mit Rückflusskühler
vorgelegt.
Dazu
tropft
man
langsam
eine
Lösung
von
4-
Brombenzylbenzoesäuremethylester (2.29 g, 50 mmol) in THF (20 mL). Das Gemisch wird über Nacht bei 78°C unter Rückfluß gehalten. Man lässt auf RT abkühlen und dekantiert das THF vom weißen Niederschlag. Der Niederschlag wird mit THF (2 × 20 mL) gewaschen und danach am Ölpumpenvakuum getrocknet. Man erhält als Produkt einen weißen hygroskopischen Feststoff (2.5 g, 74%).
7a: C15H19BrN2O2 (338.06 g/mol): EA, ber. C, 53.11; H, 5.65; N, 8.26; gef. C, 55.71; H, 6.26; N, 8.63. – MS (Fab, NBA): m/z = 256 [M-Br]+. - 1H NMR (DMSO-d6, 200 MHz): δ = 9.61 (1H, s, N=CH-N), 8.01 (1H, t, 3J = 1.8 Hz, 1 H, N-CH=CH-N), 7.98 (2H, AA’XX’, N= 8.37 Hz, HAr), 7.90 (1 H, t, 3J = 1.8 Hz, N-CH=CH-N), 7.59 (2H, AA’XX’, N = 8.37 Hz, HAr), 5.58 (2 H, s, N-CH2-Ar), 3.85 (3H, s, CO2CH3), 4.68 (1H, td, 3J = 6.7 Hz, 2J = 13.3 Hz, NCH(CH3)2), 1.49 (6H, d, 3J =6.7 Hz, CH(CH3)2). – 13C NMR (DMSO-d6, 50 MHz): δ = 165.7 (COCH3), 139.9 (Cq,Ar), 135.2 (N=CH-N), 129.7 (Cq,Ar), 129.6 (Cq,Ar), 128.5 (CAr), 122.6 (NCH=CH-N), 121.1 (N-CH=CH-N), 52.4 (N-CH2-Ar), 52.2 (CO2CH3), 51.2 (N-CH(CH3)2), 22.2 (N-CH(CH3)2).
116
Experimenteller Teil Synthese von 1-(4-Methylbenzoesäurepentafluorphenylester)-3isopropylimidazoliumbromid
N
Br
N F
F
O O
F F
F
7b Zu einer Lösung von 2 (0.55 g, 5 mmol) in wasserfreiem THF (15 mL) tropft man eine Lösung von 7 (1.9 g, 10 mmol) in THF (10 mL). Nach beendeter Zugabe refluxiert man ü. N. und lässt anschliessend auf RT abkühlen. Das Lösungsmittel wird dekantiert und der Rückstand wird mit THF (3 × 10 mL) gewaschen und am Ölpumpenvakuum getrocknet. Man erhält ein weißes Pulver (2.12 g, 87%).
7b: C20H16BrF5N2O2 (490.03 g/mol): EA, ber. C, 48.90; H, 3.28; N, 5.70; gef. C, 48.43; H, 3.46; N, 5.53. – MS (ESI+, Acetonitril): m/z = 411.08 [M-Br]+. - 1H NMR (250 MHz, DMSOd6): δ = 9.50 (1H, br.s, N=CH-N), 8.24 (2H, AA’XX’, N = 8.27 Hz, HAr), 8.00 (1H, t, 3J = 1.64 Hz, N-CH=CH-N), 7.90 (1H, br.s, N-CH=CH-N), 7.70 (2H, AA’XX’, N = 8.27 Hz, HAr), 5.61 (2H, s, N-CH2-Ar), 4.67 (quin, 3J = 6.59 Hz, 2J = 13.14 Hz, N-CH(CH3)2), 1.50 (6H, d, 3J = 6.59 Hz, N-CH(CH3)2). – 13C NMR (63 MHz, DMSO-d6): δ = 142.2 (Cq,Ar), 135.4 (N=CH-N), 131.0 (CAr), 129.2 (CAr), 126.0 (Cq,Ar), 122.7 (N-CH=CH-N), 121.1 (N-CH=CHN), 52.4 (N-CH(CH3)2), 51.3 (N-CH2-Ar), 22.2 (N-CH(CH3)2). -
19
F NMR (235 MHz,
DMSO-d6): δ = -153.57 (2F, d, 3JF,F = 19.37 Hz), -157.34 (1F, t, 3JF,F = 23.19 Hz), -162.23 (2H, dd, 3JF,F = 23.19, 19.37 Hz).
117
Experimenteller Teil Synthese von 1-(4-Bromphenyl)-3-methylimidazoliumiodid
N
I
N
Br
8a
5a (1 g, 4.5 mmol) wird in wasserfreiem THF (20 mL) in einem Schlenkkolben vorgelegt und Methyliodid (1.4 mL, 22.41 mmol) wird dazugeben. Man schwenkt kurz und lässt für 48 h stehen, wobei das Produkt als weiße Nadeln ausfällt. THF wird dekantiert und der Rückstand wird mit Ethanol aufgeschlämmt und solange gewaschen, bis der Rückstand nahezu farblos ist. Nach Filtration erhält man 8a als weiß-glitzernde Nadeln (1.21 g, 74%).
8a: C10H10BrIN2 (363.91 g/mol): EA, ber. C, 32.91; H, 2.76; N, 7.67; gef. C, 32.86; H, 2.87; N, 7.57. – MS (Fab, NBA): m/z = 602.8 [M+Ligand]+, 236.9 [M-I]+. - 1H NMR (200 MHz, DMSO-d6): δ = 9.86 (1H, br.s, N=CH-N), 8.36 (1H, t, 3J = 1.85 Hz, N-CH=CH-N), 8.03 (1H, t, 3J = 1.85 Hz, N-CH=CH-N). 7.94 (2H, AA’XX’, N = 8.97 Hz, HAr), 7.82 (2H, AA’XX’, N = 8.97 Hz, HAr), 4.01 (3H, s, N-CH3). - 13C NMR (DMSO-d6, 50 MHz) : δ = 136.1 (Cq,Ar), 134.0 (N=CH-N), 133.0 (CAr), 124.5 (N-CH=CH-N), 123.9 (CAr), 122.6 (Cq,Ar-Br), 120.9 (NCH=CH-N), 36.2 (N-CH3).
118
Experimenteller Teil Synthese von 1-(4-Iodphenyl)-3-methylimidazoliumiodid
N
I
N
I
8b 5a (343 mg, 1.27 mmol) wird in wasserfreiem THF (20 mL) in einem Schlenkkolben vorgelegt und Methyliodid (400 µL, 6.34 mmol) wird dazugeben. Man schwenkt kurz und lässt für 48h stehen, wobei das Produkt als weiße Nadeln ausfällt. THF wird dekantiert und der Rückstand wird mit Ethanol aufgeschlämmt und solange gewaschen, bis der Rückstand nahezu farblos ist. Nach Filtration erhält man 8b als weiß-glitzernde Nadeln (450 mg, 74%).
8b: C10H10I2N2 (411.89 g/mol): EA, ber. C, 29.15; H, 2.45; N, 6.80; gef. C, 31.70; H, 3.28; N, 6.14. – MS (Fab, NBA): m/z = 284.9 [M-I]+. - 1H NMR (200 MHz, DMSO-d6): δ = 9.79 (1H, br.s, N=CH-N), 8.28 (1H, t, 3J = 1.77 Hz, N-CH=CH-N), 8.04 (2H, AA’XX’, N = 8.80 Hz, HAr), 8.03 (1H, t, 3J = 1.77 Hz, N-CH=CH-N). 7.58 (2H, AA’XX’, N = 8.80 Hz, HAr), 3.94 (3H, s, N-CH3). -
13
C NMR (DMSO-d6, 50 MHz) : δ = 138.7 (CAr), 135.9 (Cq,Ar), 134.4
(N=CH-N), 124.4 (N-CH=CH-N), 123.7 (CAr), 120.7 (N-CH=CH-N), 96.0 (Cq,Ar-Br), 36.2 (NCH3).
119
Experimenteller Teil Synthese von 1-(4-Iodbenzyl)-3-isopropylimidazoliumbromid
N Br N
I
9a
Zu einer Lösung von 2 (1.1 g, 10 mmol) in wasserfreiem THF (15 mL) tropft man eine Lösung von 4-Iodbenzylbromid (2.97 g, 10 mmol) in THF (10 mL). Nach beendeter Zugabe refluxiert man ü. N. und lässt anschliessend auf RT abkühlen. Das Lösungsmittel wird dekantiert und der Rückstand wird mit THF (3 × 10 mL) gewaschen und am Ölpumpenvakuum getrocknet. Man erhält ein weißes Pulver (2.8 mg, 69%).
9a: C13H16BrIN2 (405.95 g/mol): EA, ber. C, 38.36; H, 3.96; N, 6.88; gef. C, 38.12; H, 4.05; N, 6.85. – MS (Fab, NBA): m/z = 732.9 [M+Ligand]+, 327.0 [M-Br]+. - 1H NMR (200 MHz, DMSO-d6): δ = 9.58 (1H, t, 3J = 1.5 Hz, N=CH-N), 7.98 (1H, t, 3J = 1.78 Hz, N-CH=CH-N), 7.88 (1H, t, 3J = 1.78 Hz, N-CH=CH-N), 7.78 (2H, AA’XX’, N = 8.37 Hz, HAr), 7.30 (2H, AA’XX’, N = 8.37 Hz, HAr), 5.43 (2H, s, N-CH2-Ar), 4.66 (1H, quin, 3J = 6.66 Hz, 2J = 13.32 Hz, N-CH(CH3)2), 1.47 (6H, d, 3J = 6.66 Hz, N-CH(CH3)2). -
13
C NMR (DMSO-d6, 50
MHz) : δ = 137.6 (CAr), 135.0 (N=CH-N), 134.4 (Cq,Ar), 130.6 (CAr), 122.4 (N-CH=CH-N), 120.9 (N-CH=CH-N), 95.5 (Cq,Ar-I), 52.3 (N-CH2-Ar), 51.1 (N-CH(CH3)2), 22.2 (NCH(CH3)2).
120
Experimenteller Teil Synthese von 1-(4-Brombenzyl)-3-methylimidazoliumbromid
N N Br Br
9b N-Methylimidazol (2 mL, 25 mmol) wird in wasserfreiem THF (20 mL) in einem Schlenkkolben vorgelegt und eine Lösung von 4-Brombenzylbromid (6.25 g, 250 mmol) in THF (20 mL) wird dazugeben. Man refluxiert ü.N. Nachdem auf RT abgekühlt wurde, wird das Lösungsmittel dekantiert und der Rückstand wird mit THF gewaschen. Nach Filtration erhält man 9b als weißen Feststoff (7.41 g, 89%).
9b: C11H12Br2N2 (329.94 g/mol): EA, ber. C, 39.79; H, 3.64; N, 8.44; gef. C, 39.93; H, 3.61; N, 8.41. ). - MS (Fab, NBA): m/z = 251.1 [M-Br]+, 583.1 [2M-Br]+. - 1H NMR (DMSO-d6, 250 MHz): δ = 9.49 (1H, br. s, N=CH-N), 7.92 (1H, t, 3J = 1.57 Hz, N-CH=CH-N), 7.81 (1H, t, 3J = 1.57 Hz, N-CH=CH-N), 7.58 (d, AA’XX’, N = 8.46 Hz, HAr), 7.47 (d, AA’XX’, N = 8.46 Hz, HAr), 5.53 (2H, s, N-CH2-Ar), 3.88 (3H, s, N-CH3). -
13
C NMR (DMSO-d6, 63
MHz): δ = 136.6 (Cq,Ar), 134.2 (N=CH-N), 131.6 (CAr), 130.6 (CAr), 123.8 (N-CH=CH-N), 122.1 (N-CH=CH-N), 121.9 (CqAr-Br), 50.7 (N-CH2-Ar), 35.8 (N-CH3).
121
Experimenteller Teil Synthese von 1-Ethinyl-3-methylimidazoliumbromid
CH3 N Br N
10 Zu einer Lösung von Methylimidazol (2 mL, 25 mmol) in wasserfreiem THF (30 mL) wird eine Lösung von Propargylbromid (80% Lösung in Toluol, 2.8 mL, 25 mmol) in THF (10 mL) langsam zugetropft. Die Mischung wird über Nacht bei 30°C gerührt. Das THF wird vom öligen Rückstand dekantiert und der Rückstand mit THF gewaschen (3 × 10 mL) und am Ölpumpenvakuum getrocknet. Man erhält 10 als hygroskopisches, orange-braunes Pulver (3.80 g, 72%).
10: C7H9BrN2 (199.99 g/mol): EA ber. C, 41.82; H, 4.51; N, 13.93; gef. C; 40.79; H, 4.64; N, 13.56. – MS (Fab, NBA): m/z = 121.0 [M-Br]+ (100%). - 1H NMR (DMSO-d6, 200 MHz): δ = 9.28 (1H, s, N=CH-N), 7.82 (1H, t, 3J = 1.75 Hz, N-CH=CH-N), 7.78 (1H, t, 3J = 1.75 Hz, N-CH=CH-N), 5.24 (2H, d, 4J = 2.6 Hz, N-CH2-C), 3.89 (3H, s, N-CH3), 3.86 (1H, t, 4J = 2.6 Hz, N-CH2-C≡CH). -
13
H NMR (DMSO-d6, 50 MHz): δ = 136.6 (N=CH-N), 124.1 (N-
CH=CH-N), 122.1 (N-CH=CH-N), 78.9 (Cq,Alkin), 76.1 (CH2C≡CH). N-CH3 und N-CH2-C von Lösemittelsignal unterdrückt.
122
Experimenteller Teil Synthese von 1-Acetylethylester-3-methylimidazoliumbromid
O
O Br N
N
11a Zu einer Lösung von Methylimidazol (4 mL, 50 mmol) in wasserfreiem THF (25 mL) wird eine Lösung von Bromsäureethylester (5.55 mL, 50 mmol) in THF (25 mL) zugetropft. Danach wird ü.N. refluxiert. Das Lösemittel wird unter vermindertem Druck abgezogen und der Rückstand zweimal mit Diethylether gewaschen und im Ölpumpenvakuum getrocknet. Man erhält 11a als ein gelbliches Öl (7.44 g, 60%).
11a: C8H13BrN2O2 (248.02 g/mol) : EA, ber. C, 38.57; H, 5.26; N, 11.25; gef. C, 32.37; H, 4.64; N, 9.64. - (ESI+, H2O/ 0.1% FA): m/z = 169.07 [M-Br]+. - 1H NMR (D2O, 250 MHz ): δ = 8.86 (1H, s, N=CH-N), 7.55 (2H, s, N-CH=CH-N), 5.21 (2H, s, N-CH2-CO), 4.33 (2H, q, 3J = 7.2 Hz, COO-CH2-CH3), 3.98 (3H, s, N-CH3), 1.32 (3H, t, 3J = 7.2 Hz, COO-CH2-CH3). 13
C NMR (D2O 63 ΜΗz): δ = 171.1 (CΟΟ), 140.3 (Ν=CH-N), 126.4 (N-CH=CH-N), 66.4
(N-CH2-COO), 52.9 (COO-CH2-CH3), 38.9 (N-CH3), 16.1 (COO-CH2-CH3).
123
Experimenteller Teil Synthese von 1-Acetylethylester-3-isopropylimidazoliumbromid
O
O Br N
N
11b Zu einer Lösung von 2 (1.1 g, 10 mmol) in wasserfreiem THF (15 mL) tropft man eine Lösung von Bromessigsäurethylester (1.11 mL, 10 mmol) in THF (15 mL). Nach beendeter Zugabe refluxiert man ü. N. und lässt anschliessend auf RT abkühlen. Das Lösungsmittel wird dekantiert und der Rückstand wird mit THF (3 × 10 mL) gewaschen und am Ölpumpenvakuum getrocknet. Man erhält ein gelbes Öl (2.52 g, 91%).
11b: C10H17BrN2O2 (276.05 g/mol): EA, ber. C, 43.34; H, 6.18; N, 10.11; gef. C, 41.91; H, 6.44; N, 10.18. - (ESI+, H2O/ 0.1% FA): m/z = 197.07 [M-Br]+. - 1H NMR (D2O, 250 MHz): δ = 8.89 (1H, t, N=CH-N), 7.52 (1H, t, 3J = 1.78 Hz, N-CH=CH-N), 7.40 (1H, t, 3J = 1.78 Hz, N-CH=CH-N), 5.03 (2H, s, N-CH2-CO), 4.56 (1H, quin, 3J = 6.71 Hz, 2J = 13.41 Hz, N-CH(CH3)2), 4.17 (2H, q, 3J = 7.15 Hz, COO-CH2-CH3), 1.43 (6H, d, 3J = 6.71 Hz, NCH(CH3)2),
1.16
(3H,
t,
3
J
=7.15
Hz,
COO-CH2-CH3).
-
13
C
NMR
(D2O,
63 ΜΗz): δ = 171.1 (CΟΟ), 138.3 (Ν=CH-N), 126.3 (N-CH=CH-N),123.4 (N-CH=CH-N), 66.5 (N-CH2-COO), 56.3 (N-CH(CH3)2), 52.9 (COO-CH2-CH3), 24.8 (N-CH(CH3)2), 16.1 (COO-CH2-CH3).
124
Experimenteller Teil Synthese von 1-3-Dimethylimidazoliumiodid
N
I
N
12
N-Methylimidazol (800 µL, 10 mmol) wird in wasserfreiem THF (20 mL) in einem Schlenkkolben vorgelegt und Methyliodid (3.1 mL, 50 mmol) wird dazugeben. Man schwenkt kurz und lässt für 1 Woche stehen, wobei das Produkt als weiße Nadeln ausfällt. THF wird dekantiert und der Rückstand wird mit THF gewaschen. Nach Filtration erhält man 12 als weißen Feststoff (2.56 g, 11%).
125
Experimenteller Teil Synthese von 1-(Diphenylmethyl)-3-methylimidazoliumbromid
N N Br
13 Methylimidazol (1.59 mL, 20 mmol) und Diphenylbrommethan (4.29 g, 20 mmol) werden in wasserfreiem Toluol (30 mL) gelöst und ü.N. refluxiert. Man lässt anschliessend auf RT abkühlen und dekantiert das überschüssige Toluol. Der Rückstand wird in Aceton gelöst (Ultraschallbad) und mit Diethylether ausgefällt. Nach Filtration erhält man ein gelblichweißes Pulver (5.31 g, 82%).
13: C17H17N2Br2 (328.06 g/mol) : EA, ber. C, 62.02; H, 5.20; N, 8.51; gef. C, 61.39; H, 5.11; N, 8.60. - MS (ESI+, Acetonitril): m/z = 249.07 [M-Br]+. – 1H NMR (CDCl3, 250 MHz): δ = 9.95 (1H, br.s, N=CH-N), 7.78 (1H, t, 3J = 1.62 Hz, N-CH=CH-N), 7.39 (1H, s, NCHPh2), 7.32-7.21 (6H, m, HAr), 7.18-7.12 (4H, m, HAr), 7.07 (1H, t, 3J = 1.62 Hz, NCH=CH-N), 3.98 (3H, s, N-CH3). –
13
C NMR (CDCl3, 63 MHz): δ = 137.3 (Cq,Ar), 136.3
(N=CH-N), 129.3 (CAr), 128.2 (CAr), 124.3 (N-CH=CH-N), 121.4 (N-CH=CH-N), 66.6 (NCHPh2), 37.1 (N-CH3).
126
Experimenteller Teil
N
N Ag
N
N
Br AgBr
13a
Zu einer Lösung von 13 (400 mg, 1.22 mmol) in wasserfreiem Dichlormethan (20 mL) über 4 Å Molekularsieb gibt man Ag2O (148 mg, 0.61 mmol) und lässt ü.N. im Dunkeln schwenken. Man filtriert durch Celite und kristallisiert aus einer Mischung Dichlormethan / Hexan bei 4°C um. Nach Filtration erhält man 13a als ein weiß-glitzerndes, lichtempfindliches Pulver (426 mg, 41%).
13a: C34H32N4Ag2Br2 (867.91 g/mol): EA, ber. C, 46.71; H, 3.92; N, 6.41; gef. C, 46.89; H, 3.55; N, 6.25. - MS (Fab, NBA): m/z = 249.1 [M-Br]+. - 1H NMR (CD2Cl2, 250 MHz): δ = 7.43-7.31 (12H, m, HAr), 7.19-7.11 (8H, m, HAr), 7.01 (2H, d, 3J = 1.9 Hz, NCH=CH-N), 6.96 (2H, s, N-CHPh2), 6.86 (2H, d, 3J = 1.9 Hz, N-CH=CH-N), 3.83 (6H, s, NCH3). – 13C NMR (CD2Cl2, 63 MHz): δ = 139.3 (Cq,Ar), 129.5 (CAr), 129.1 (CAr), 128.9 (CAr), 122.7 (N-CH=CH-N), 121.1 (N-CH=CH-N), 69.4 (N-CHPh2), 39.61 (N-CH3).
127
Experimenteller Teil Synthese von Bromacetamidophenylalaninmethylester
O Br
O
OCH3
N H
14
Zu einer Lösung von Bromessigsäure (1.40 g, 10 mmol) in THF (30 mL) gibt man NMM (1.02 g, 10mmol), gefolgt von IBCF (1.36 g,10 mmol). Ein weißer Niederschlag bildet sich. In einem zweiten Kolben suspendiert man Phenylalaninmethylester Hydrochlorid (2.16 g, 10 mmol) in THF (50 mL) mit NEt3 (1.02 g, 10mmol). Man vereinigt beide Kolben und lässt das Gemisch 2 h rühren. Der Niederschlag wird abfiltriert und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt. Das resultierende Öl wird in CHCl3 (100 mL) gelöst und mit H2O (100 mL) gewaschen. Die wässrige Phase wird mit CHCl3 (3 × 50 mL) zurückextrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden über Na2SO4 getrocknet und das Lösemittel unter vermindertem Druck entfernt. 14 wird aus THF/Pentan umkristallisiert und man erhält ein weißes Pulver (2.51 g, 84%).
14: C12H14BrNO3 (299.02 g/mol): EA, ber. C, 48.02; H, 4.70; N, 4.67; gef. C, 50.44; H, 5.12; N, 4.74. - MS (Fab, NBA): m/z = 300.0, 302.0 [M+]. - 1H NMR (DMSO-d6, 200 MHz): δ = 7.34-7.16 (3Η, m, HAr,Phe), 7.09-7.05 (2H, m, HAr,Phe), 6.83 (1H, d, 3J = 7.1 Hz, NH), 4.87-4.72 (1H, m, Cα,PheH ) 3.79 (d, 2J = 1.4 Hz, 2H, Br-CH2-CO), 3.68 (3H, s, CO2CH3), 3.10 (2H, dd, 3J = 5.8 Hz, 3.5 Hz, Cβ,PheH). – 13C NMR (DMSO-d6, 50 MHz): δ = 171.3 (CO2CH3), 165.1 (CO), 135.3 (Cq,Phe), 129.2 (CAr,Phe), 128.6 (CAr,Phe), 127.3 (CAr,Phe), 53.7 (Cα,Phe), 52.5 (CO2CH3), 37.6 (Cβ,Phe), 28.6 (Br-CH2-CO).
128
Experimenteller Teil Synthese von 1-Acetamidophenylalaninmethylester-3-methylimidazoliumbromid
CH3 N Br N
O HN OCH3 O
15a
Methylimidazol (0.4 mL, 5 mmol) wird in wasserfreiem THF (20 mL) in einem Zweihalskolben mit Rückflusskühler vorgelegt. Dazu tropft man langsam eine Lösung von 14 (1.50 g, 5 mmol) in THF (10 mL). Das Gemisch wird über Nacht bei 78°C refluxiert. Man lässt auf RT abkühlen und dekantiert das THF vom weißen Niederschlag. Der Niederschlag wird mit THF (2 × 10 mL) gewaschen und am Ölpumpenvakuum getrocknet. Man erhält als Produkt einen weißen hygroskopischen Feststoff (0.90 g, 47%).
15a: C16H20BrN3O3 (381.07 g/mol): EA, ber. C, 50.27; H, 5.27; N, 10.99; gef. C, 47.43; H, 5.73; N, 11.03. - MS (ESI+, CH3CN): m/z = 302.1 [M-Br]+. - 1H NMR (DMSO- d6, 200 MHz): δ = 9.22 (1H, d, 3J = 7.48 Hz, NHPhe), 9.15 (1H, s, N=CH-N), 7.72 (1H, s, N-CH=CHN), 7.63 (1H, s, N-CH=CH-N), 7.23-7.33 (5H, m, HAr,Phe), 5.07 (2H, s, N-CH2-CO), 4.51 (1H, dd, 3J= 7.48 Hz , 2J = 14.04 Hz, Hα,Phe), 3.95 (3H, s, CO2CH3), 3.88 (3H,s, N-CH3), 3.02 (2H, m, Hβ,Phe). -
13
C NMR (DMSO-d6, 50 MHz): δ = 171.7 (CO2CH3), 165.4 (COPhe), 138.0
(Cq,Ar), 137.0 (N=CH-N), 129.4 (CAr,Phe), 128.6 (128.6 (CAr,Phe), 127.0 (CAr,Phe), 123.9 (NCH=CH-N), 123.3 (N-CH=CH-N), 54.4 (N-CH2-CO), 52.3 (Cα,Phe), 50.6 (CO2CH3), 37.0 (NCH3), 36.1 (Cβ,Phe).
129
Experimenteller Teil Synthese von 1-Acetamidophenylalaninmethylester-3-tertbutylimidazoliumbromid
N Br N
O HN OCH3 O
15b Zu einer Lösung von 3 (372 mg, 3 mmol) in wasserfreiem THF (10 mL) tropft man eine Lösung von 14 (897 mg, 3 mmol). Nach beendeter Zugabe refluxiert man ü. N. und lässt anschliessend auf RT abkühlen. Das Lösungsmittel wird unter vermindertem Druck entfernt und der Rückstand wird mit Pentan gewaschen und am Ölpumpenvakuum getrocknet. Man erhält ein weiß-oranges Pulver (580 mg, 46%).
15b: C19H26BrN3O3 (423.12 g/mol) : EA, ber. C, 53.78; H, 6.18; N, 9.90; gef. C, 54.39; H, 5.85; N, 9.56. – MS (ESI+, H2O/ 0.1% FA): m/z = 344.16 [M – Br]+. - 1H NMR (DMSO-d6, 250 MHz): δ = 9.4 (1H, m, N-CH=N), 9.16 (1H, d, 3J = 7.57 Hz, CO-NH), 8.03 (1H, t, 3J =1.78 Hz, N-CH=CH-N), 7.67 (1H, t, 3J = 1.78 Hz, 1H, N-CH=CH-N), 7.3-7.2 (5H, m, HAr,Phe), 5.02 (2H, s, N-CH2-CO), 4.52 (1H, dt, 3J = 6.14 Hz, 8.08 Hz, Hα,Phe), 3.61 (3H, s, CO2CH3), 3.01 (2Hddd, 3J = 8.5 Hz, 5.9 Hz, 2J = 13.74 Hz, Hβ,Phe), 1.58 (9H, s, N-C(CH3)3). 13
C NMR (DMSO-d6, 63 MHz): δ = 171.4 (COO), 165.2 (CO-NH), 136.7 (Cq,Ar), 135.8
(NCH=N), 129.2 (CAr), 128.3 (CAr), 126.4 (CAr), 123.9 (N-CH=CH-N), 119.6 (N-CH=CHN),59.6 (N-CH2-Ar), 54.2 (N-C(CH3)3), 51.8 (Cα,Phe), 50.2 (CO2CH3), 36.8 (Cβ,Phe), 29.0 (NC(CH3)3).
130
Experimenteller Teil
O O
Br NH
O
AgBr
N
N Ag N O
N
HN O
O
15c Zu einer Lösung von 15c (258 mg, 0.61 mmol) in wasserfreiem Dichlormethan (20 mL) über 4 Å Molekularsieb gibt man Ag2O (74 mg, 0.32 mmol) und lässt ü.N. im Dunkeln schwenken. Man filtriert durch Celite und kristallisiert aus einer Mischung THF/Hexan bei 4°C um. Nach Filtration erhält man 15c als ein weißes, lichtempfindliches Pulver (173 mg, 54%).
15c: C38H50Ag2Br2N6O6 (1058.03 g/mol): EA, ber. C, 42.96; H 4.74; N, 7.91; gef. C, 44.45; H 5.19; N, 8.40. - MS (Fab, NBA): m/z = 794.4 [M-AgBr2]+. - 1H NMR (Acetonitril-d3, 250 MHz): δ = 7.32 (2Η, d, 3J = 1.7 Hz, N-CH=CH-N), 7.27-7.19 (12H, m, CAr,PheH, NHPhe), 7.14 (2H, d, 3J = 1.7 Hz, N-CH=CH-N), 4.87 (4H, s, N-CH2-CO), 4.71- 4.58 (2H, m, Cα,PheH ), 3.62 (6H, s, CO2CH3), 3.05 (4H, ddd, 2J = 13.80 Hz, 3J = 6.87 Hz, Cβ,PheH), 1.68 (18H, s, NC(CH3)3). –
13
C NMR (Acetonitril-d3, 63 MHz): δ = 180.1 (NCN), 167.8 (CO2CH3), 156.4
(CONH), 38.1 (Cq,Phe), 129.9 (CAr,Phe), 129.5 (CAr,Phe), 127.8 (CAr,Phe), 122.5 (N-CH=CH-N), 120.3 (N-CH=CH-N), 58.8 (N-CH2-CO), 55.3 (N-C(CH3)3), 54.4 (Cα,Phe), 52.9 (CO2CH3), 38.2 (Cβ,Phe), 29.8 (N-C(CH3)3.
131
Experimenteller Teil
Boc
N H
H N
O OCH3
O
16a Zu einer Lösung von Boc-Leucin Monohydrat (2.49 g, 10 mmol) in THF (30 mL) gibt man NMM (1.02 g, 10mmol), gefolgt von IBCF (1.36 g, 10 mmol). Ein weißer Niederschlag bildet sich. In einem zweiten Kolben suspendiert man Phenylalaninmethylester Hydrochlorid (2.16 g, 10 mmol) in THF (50 mL) mit NEt3 (1.02 g, 10mmol). Man vereinigt beide Kolben und lässt das Gemisch 2 h rühren. Der Niederschlag wird abfiltriert und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt. Das resultierende Öl wird in CHCl3 (100 mL) gelöst und mit H2O (100 mL) gewaschen. Die wässrige Phase wird mit CHCl3 (3 × 50 mL) zurückextrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden über Na2SO4 getrocknet und das Lösemittel unter vermindertem Druck entfernt. 16a wird aus THF/Pentan umkristallisiert und man erhält ein weißes Pulver (3.76 g, 96%).
16a: C21H32N2O5 (392.3 g/mol): EA, ber. C, 64.26; H, 8.22; N, 7.14; gef. C, 63.43; H, 8.46; N, 6.76. - 1H NMR (CDCl3, 250 MHz,): δ = 7.29−7.07 (6H, m, CAr,PheH, NHLeu), 6.47 (1H, d, 3
J = 7.6 Hz, NHPhe), 4.84-4.67 (1H, m, Cα,PheH), 4.12- 3.90 (1H, m, Cα,LeuH), 3.63 (3H, s,
CO2CH3), 3.19–3.00 (2H, m, Cβ,PheH), 2.17-1.93 (1H, m, Cγ,LeuH), 1.60-1.47 (2H, m, Cβ,LeuH), 1.41 (9H, s, NH-CO2(CH3)3), 0.89 (6H, dd, 3J = 6.1 Hz, 4J = 2.4Hz, Cδ,LeuH).
132
Experimenteller Teil
H N
H3N TFA
O OCH3
O
16b Zu einer Lösung von 16a (3.6 g, 9.18 mmol) in CH2Cl2 (30 mL) wird konzentrierte TFA (20 mL) bei 0°C zugegeben. Die Lösung wird für 1 h gerührt. Das Lösungsmittel wird unter vermindertem Druck entfernt und der Rückstand wird in Diethylether aufgenommen und für 30 min gerührt, wobei ein Niederschlag entsteht. Nach Filtration und Trocknung am Ölpumpenvakuum erhält man 16b als weißes Pulver (2.98 g, 80%).
16b: C18H25F3N2O5 (406.17 g/mol): EA, ber. C, 53.20; H, 6.20; N, 6.89; gef. C, 53.02; H, 6.50; N, 6.72. - MS (ESI+, Acetonitril): m/z = 293.15 [M-TFA]+. - 1H NMR (CDCl3, 250 MHz): δ = 7.34 (1H, d, 3J = 7.2 Hz, NHLeu), 7.29-7.00 (6H, m, CAr,PheH, NHPhe), 4.78-4.62 (1H, m, Cα,PheH), 4.10- 3.95 (1H, m, Cα,LeuH), 3.69 (3H, s, CO2CH3), 3.07 (2H, d, 3J = 6.7 Hz, Cβ,PheH), 1.72-1.46 (3H, m, Cβ,LeuH, Cγ,LeuH), 0.94-0.76 (6H, m, Cδ,LeuH).
133
Experimenteller Teil
O Br
N H
H N
O OCH3
O
16c Zu einer Lösung von Bromessigsäure (0.28 g, 2 mmol) in THF (20 mL) gibt man NMM (0.22 mL, 10mmol), gefolgt von IBCF (0.26 mL, 2 mmol). Ein weißer Niederschlag bildet sich. In einem zweiten Kolben suspendiert man 16b (0.81 g, 2 mmol) in THF (20 mL) mit NEt3 (0.28 g, 2 mmol). Man vereinigt beide Kolben und lässt das Gemisch 2 h rühren. Der Niederschlag wird abfiltriert und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt. Das resultierende Öl wird in CHCl3 (50 mL) gelöst und mit H2O (50 mL) gewaschen. Die wässrige Phase wird mit CHCl3 (3 × 20 mL) zurückextrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden über Na2SO4 getrocknet und das Lösemittel unter vermindertem Druck entfernt. 16c wird aus THF/Pentan umkristallisiert und man erhält ein weißes Pulver (668 mg, 81%).
16c: C18H25BrN2O4 (384.1 g/mol): EA, ber. C, 52.31; H, 6.10; N, 6.78; gef. C, 56.54; H, 7.35; N, 7.01. - MS (ESI+, Aceton): m/z = 391.11 [M-Br+Aceton]+. - 1H NMR (CDCl3, 250 MHz): δ = 7.30-7.10 (3H, m, CAr,PheH), 6.94-6.91 (2H, m, CAr,PheH), 6.93 (1H, d, 3J = 7.4 Hz, 1H, NHLeu), 6.64 (1H, br.s, NHPhe), 4.84 (1H, dd, 2J = 13.6 Hz, 3J = 6.18 Hz, Cα,PheH), 4.48 (1H, dd, 2J = 13.8 Hz, 3J = 8.0 Hz, Cα,LeuH), 3.96 (2H, q, 2J = 15.13 Hz, Br-CH2-CO), 3.71 (3H, s, CO2CH3), 3.11 (2H, ddd, 2J = 13.92 Hz, 3J = 6.18 Hz, Cβ,PheH), 1.71-1.42 (3H, m, Cβ,LeuH, Cγ,LeuH), 0.9 (6H, ps-tr.,
3
J = 5 Hz, Cδ,LeuH). -
13
C NMR (CDCl3, 63
MHz): δ = 171.8 (CO2CH3), 171.2 (Br-CH2-CO), 166.2 (CONH), 135.8 (Cq,Phe), 129.4 (CAr,Phe), 128.8 (CAr,Phe), 122.4 (CAr,Phe), 53.4 (Cα,Phe), 52.6 (CO2CH3), 52.0 (Cα,Leu), 41.0 (Cβ,Leu), 37.9 (Cβ,Phe), 24.9 (Br-CH2-CO), 22.6 (Cδ,Leu), 22.3 (Cγ,Leu).
134
Experimenteller Teil
N Br O N
N H
H N
O OCH3
O
17
3 (372 mg, 3 mmol) wird in wasserfreiem THF (10 mL) in einem Zweihalskolben mit Rückflusskühler vorgelegt. Dazu tropft man langsam eine Lösung von 16c (897 mg, 3 mmol) in THF (10 mL). Das Gemisch wird über Nacht bei 78°C unter Reflux gehalten. Man lässt auf RT abkühlen und das Lösungsmittel wird unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wird mit Diethylether (2 ×20 mL) gewaschen und danach am Ölpumpenvakuum getrocknet. Man erhält als Produkt ein gelblich, glitzerndes Pulver (580 mg, 36%).
17: C25H37BrN4O4 (536.2 g/mol): EA, ber. C, 55.86; H, 6.94; N, 10.42; gef. C, 57.8; H, 7.41; N, 10.36. - MS (ESI+, Acetonitril): m/z = 457.26 [M-Br]+. - 1H NMR (CDCl3, 250 MHz): δ = 9.44 (1H, t, 4J = 1.58Hz, N-CH=N), 8.83 (1H, d, 3J = 8.26 Hz, NHLeu), 8.65 (1H, d, 3J = 7.80 Hz, NHPhe), 8.05 (1H, t, 3J = 1.90 Hz, N-CH=CH-N), 7.75-7.73 (1H, m, CH=CHN), 7.31-7.18 (3H, m, CAr,PheH), 5.03 (2H, s, N-CH2-CO), 4.45 (1H, dt, 2J = 5.93 Hz, 3J = 7.80 Hz, Cα,PheH), 4.37-4.29 (1H, m, Cα,LeuH), 3.56 (3H, s, CO2CH3), 3.06-2.96 (2H, m, Cβ,PheH), 1.60 (10H, s, N-(C(CH3)3, Cγ,LeuH), 1.43 (2H, t, 3J = 7.16 Hz, Cβ,LeuH), 0.85 (6H, dd, 2JH,H = 18.41 Hz, 3J = 6.63 Hz, Cδ,LeuH). -
13
C NMR (CDCl3, 63 MHz): δ = 171.6 (CO2CH3), 171.6
(N-CH2-CO), 164.4 (CONH), 137.1 (Cq,Phe), 135.5 (N-CH=N), 129.0 (CAr,Phe), 128.0 (CAr,Phe), 126.4 (CAr,Phe), 124.8 (CAr,Phe), 123.9 (N-CH=CH-N), 119.5 (N-CH=CH-N), 59.5 (NC(CH3)3), 53.5 (Cα,Phe), 51.6 (CO2CH3), 51.3 (Cα,Leu), 50.4 (N-CH2-CO), 40.1 (Cβ,Leu), 36.3 (Cβ,Phe), 30.0 (N-C(CH3)3), 23.9 (Cγ,Leu), 22.8, 21.6 (Cδ,Leu).
135
Experimenteller Teil
N Br N H N
O
O
H N
N H
O
O
N H
OH O
18
Harz H-Leu-2-Cl-Trt
Beladung
Einsatz
ASS
(mmol/g)
(g)
Überschuss
0.86
0.116
4
Abspalten
Abspalt-
Ausbeute
zeit 2%TFA
4h
120 mg (70%)
Abspalten: Nach dem Koppeln von 6a (24 h) wird das Harz mit DMF, DCM und MeOH gewaschen und am Vakuum getrocknet. In einem Rundkolben wird 3 mL einer Lösung von 2% TFA, 5% Triisopropylsilan (TIS) in Dichlormethan gegeben und für 4 h leicht bewegt.Das Harz wird mit DCM gespült und das Produkt mit kaltem Diethylether/Hexan gefällt. Man erhält ein weißes Pulver.
18: C31H39BrN6O6 (670.21 g/mol): MS (ESI+, CH3CN): m/z = 591.22 [M – Br]+. - 1H NMR (CD3CN, 400 MHz): δ = 8.66 (1H, s, N=CH-N), 8.29 (1H, t, 3J = 5.12 Hz, NHArC=O), 7.92 (2H, AA’XX’, N = 8.27 Hz, HAr), 7.70 (1H, t, 3J = 5.55 Hz, NHGly), 7.53 (1H, d, 3J= 8.36 Hz, NHPhe), 7.43 (2H, AA’XX’, N = 8.27 Hz, HAr), 7.39 (1H, t, 3J = 1.73 Hz, N-CH=CH-N), 7.35 (1H, t, 3J = 1.73 Hz, N-CH=CH-N), 7.31 (1H, d, 3J = 7.76 Hz, NHLeu), 7.26–7.14 (5H, m, HAr, Phe),
5.37 (2H, s, N-CH2-Ar), 4.51 (1H, m, Hα,Phe), 4.25 (1H, m, Hα,Leu), 3.94 (1H, dq, 3J = 5.60
Hz, 2J = 16.35 Hz, ArCO-NHCα,GlyH), 3.81 (3H, s, N-CH3), 3.65 (1H, d, 3J = 5.90 Hz, Hα,Gly), 3.20 (1H, dd, 3J = 4.34 Hz, 2J = 14.02 Hz, Hβ,Phe), 2.97 (1H, dd, 3J = 10.06 Hz, 2J = 14.02 Hz, Hβ,Phe), 1.63-1.48 (3H, m, Hγ,Leu, Hβ,Leu), 0.80 (6H, dd, 3J = 6.18 Hz, 2J = 15.95 Hz, Hδ,Leu). 13
C NMR (CD3CN, 100 MHz): δ = 174.5, 172.4, 171.6, 170.3, (CPhe,Gly,Gly,ArON), 168.4 136
Experimenteller Teil (COO), 138.9 (Cq,p-Ar), 138.4 (Cq,p-Ar), 137.5 (N-CH-N), 135.2 (Cq,Ar,Phe), 130.2 (CAr), 129.53 (CAr), 129.2 (CAr,Phe), 127.4 (CAr,Phe), 125.0 (N-CH=CH-N), 123.4 (N-CH=CH-N), 55.9 (Cα,Phe), 53.2 (N-CH2-Ar), 52.2 (Cα,Leu), 44.8 (ArCO=NHCα,Gly), 43.8 (Cα,Gly), 40.9 (Cβ,Leu), 38.0 (Cβ,Phe), 36.9 (N-CH3), 25.4 (Cγ,Leu), 23.2, 21.7 (Cδ,Leu). - RP-HPLC: tR = 13.47 min.
137
Experimenteller Teil
N Br N H N
O
O
H N
N H
O
O
N H
NH2 O
19
Harz Sieber Amid
Beladung
Einsatz
ASS
(mmol/g)
(g)
Überschuss
0.86
0.116
4
Abspalten
Abspalt-
Ausbeute
zeit 1%TFA
4h
64 mg (61%)
Abspalten: Nach dem Koppeln von 6c (24 h) wird das Harz mit DMF, DCM und MeOH gewaschen und am Vakuum getrocknet. In einem Rundkolben wird 3 mL einer Lösung von 2% TFA, 5% TIS in Dichlormethan gegeben und für 4 h leicht bewegt.Das Harz wird mit DCM gespült und das Produkt mit kaltem Diethylether/Hexan gefällt. Man erhält ein weißes Pulver.
19: C31H40BrN7O5 (669.23 g/mol): MS (ESI+, CH3CN): m/z = 590.27 [M – Br]+. - 1H NMR (CD3CN, 400 MHz): δ = 8.92 (1H, s, N=CH-N), 8.71 (1H, t, 3J = 5.36 Hz, NHArC=O),8.17 (1H, t, 3J = 5.55 Hz, NHGly), 8.01 (2H, AA’XX’, N = 8.36 Hz, HAr), 7.78 (1H, t, 3J = 5.55 Hz, NHPhe), 7.48-7.46 (4H, m, N-CH=CH-N,, HAr, NHLeu),7.42 (1H, t, 3J = 1.76 Hz, N-CH=CHN), 7.32-7.17 (5H, m, HAr, Phe), 6.61 81H, br.s, NH2), 6.10 (1H, br.s, NH2), 5.42 (2H, s, NCH2-Ar), 4.45-4.40 (1H, m, Hα,Phe), 4.16-4.10 (1H, m, Hα,Leu), 3.95 (1H, dq, 3J = 5.5 Hz, 2J = 16.16 Hz, ArCO-NHCα,GlyH), 3.67 (2H, d, 3J = 5.68 Hz, Hα,Gly), 3.81 (3H, s, N-CH3), 3.67 (1H, d, 3J = 5.68 Hz, Hα,Gly), 3.22-3.06 (2H, m, Hβ,Phe), 1.60-1.45 (3H, m, Hγ,Leu, Hβ,Leu), 0.74 (6H, dd, 3J = 6.05 Hz, 2J = 21.21 Hz, Hδ,Leu). -
13
C NMR (CD3CN, 100 MHz): δ = 176.31
(CONH2), 172.9, 172.7, 171.8, 168.7 (CPhe,Gly,Gly,ArON),139.7 (Cq,p-Ar), 139.2 (Cq,p-Ar), 138.4 (N-CH-N), 135.9 (Cq,Ar,Phe), 130.7 (CAr), 130.1 (CAr), 130.0 (CAr,Phe), 129.9 (CAr,Phe), 128.1 138
Experimenteller Teil (CAr,Phe), 125.7 (N-CH=CH-N), 124.0 (N-CH=CH-N), 57.5 (Cα,Phe), 53.7 (N-CH2-Ar), 53.5 (Cα,Leu), 45.3 (ArCO=NHCα,Gly), 44.8 (Cα,Gly), 40.9 (Cβ,Leu), 38.2 (Cβ,Phe), 37.6 (N-CH3), 26.0 (Cγ,Leu), 24.1, 22.1 (Cδ,Leu). - RP-HPLC: tR = 12.96 min.
139
Experimenteller Teil
S
O N Boc NH
NH CO2CH3
20a Zu einer Lösung von Boc-thiazolylalanin (0.2 g, 0.74 mmol) in THF (10 mL) gibt man NMethylmorpholin (83 µL, 0.74 mmol), gefolgt von Isobutylchlorformiat (98 µL, 0.74 mmol). Ein weißer Niederschlag bildet sich. In einem zweiten Kolben suspendiert man Leucin Hydrochlorid (134 mg, 0.74 mmol) in THF (10 mL) mit NEt3 (102 µL, 0.74 mmol). Man vereinigt beide Kolben und lässt das Gemisch 2 h rühren. Der Niederschlag wird abfiltriert und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt. Das resultierende Öl wird in CHCl3 (50 mL) gelöst und mit H2O (50 mL) gewaschen. Die wässrige Phase wird mit CHCl3 (3 × 20 mL) zurückextrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden über Na2SO4 getrocknet und das Lösemittel unter vermindertem Druck entfernt. 20a wird aus einer Acetonitil-Wasser-Mischung lyophilisiert. Man erhält ein weiß-gelbes Pulver (228 mg, 77%).
20a: C18H29N3O5S (546.25 g/mol): EA, ber. C, 54.12; H, 7.32; N, 10.52; S, 8.03; gef. C, 51.61; H, 7.25; N, 10.02; S, 7.2. - MS (ESI+): m/z = 400.17 [M+H]+, 422.18 [M+Na]+. - 1H NMR (CDCl3, 250 MHz): δ = 8.69 (1H, d, 3J = 2.0 Hz, N=CH-S), 7.04 (1H, d, 3J = 2.0 Hz, C=CH-S), 6.69 (1H, br.s, NHLeu), 6.12 (d, 3J = 6.5 Hz, NHThia), 4.51- 4.31 (2H, m, Cα,LeuH, Cα,ThiaH), 3.59 (3H, s, CO2CH3), 3.21 (2H, dq, 3J = 5.7 Hz, 2J = 14.7 Hz, Cβ,ThiaH), 1.45- 1.34 (3H, m, Cβ,LeuH, Cγ,LeuH), 1.36 (9H, s, Boc), 0.75 (6H, dd, 3J = 6.3 Hz, 2J = 2.4 Hz, Cδ,LeuH). 13
C NMR (CDCl3, 63 MHz): δ = 173.0 (COThiala), 171.1 (CO2CH3), 155.6 (Cq,Thia), 153.1
(COBoc), 153.0 (N=CH-S), 115.5 (N-C=CH-S), 80.1 (Cq,Boc), 54.2 (Cα,Thia), 52.2 (CO2CH3), 50.6 (Cα,Leu), 41.4 (Cβ,Leu), 33.2 (Cβ,Thia), 28.3 (CBoc), 24.5, 23.0 (Cδ,Leu), 21.8 (Cγ,Leu).
140
Experimenteller Teil
S
O N Boc NH
NH O
HN H3CO2C
20b Zu einer Lösung von Boc-thiazolylalanin (0.2 g, 0.74 mmol) in THF (10 mL) gibt man NMethylmorpholin (83 µL, 0.74 mmol), gefolgt von Isobutylchlorformiat (98 µL, 0.74 mmol). Ein weißer Niederschlag bildet sich. In einem zweiten Kolben suspendiert man 16b (0.3 g, 0.74 mmol) in THF (10 mL) mit NEt3 (102 µL, 0.74 mmol). Man vereinigt beide Kolben und lässt das Gemisch 2h rühren. Der Niederschlag wird abfiltriert und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt. Das resultierende Öl wird in CHCl3 (50 mL) gelöst und mit H2O (50 mL) gewaschen. Die wässrige Phase wird mit CHCl3 (3 × 20 mL) zurückextrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden über Na2SO4 getrocknet und das Lösemittel unter vermindertem Druck entfernt. 20b wird aus THF/Hexan bei 4°C umkristallisiert und man erhält ein weiß-gelbes Pulver (245 mg, 61%).
20b: C27H38N4O6S (546.25 g/mol): EA, ber. C, 59.32; H, 7.01; N, 10.25; S, 5.87; gef. C, 57.6; H, 7.14; N, 9.7; S, 5.44. - MS (ESI+): m/z = 547.28 [M+H]+, 569.29 [M+Na]+. - 1H NMR (CDCl3, 250 MHz): δ = 8.72 (1H, d, 3J = 1.9 Hz, N=CH-S), 7.32- 6.99 (8H, m, CAr,PheH, NHPhe, NHLeu, C=CH-S), 6.16 (d, 3J = 7.4 Hz, NHThia), 4.80 (1H, dd, 3J = 6.5 Hz, 14.0 Hz, Cα,PheH), 4.63- 4.39 (2H, m, Cα,LeuH, Cα,ThiaH), 3.68 (3H, s, CO2CH3), 3.40-3.18 (2H, d, m, Cβ,ThiaH), 3.15- 2.99 (2H, m, Cβ,PheH), 1.64-1.43 (3H, m, Cβ,LeuH, Cγ,LeuH), 1.43 (9H, s, Boc), 0.82 (6H, dd,
3
J = 6.2 Hz,
2
J = 9.3 Hz, Cδ,LeuH). -
13
C NMR (CDCl3, 63
MHz): δ = 171.9 (COThiala), 171.6 (CO2CH3), 171.2 (COLeu), 155.6 (Cq,Thia), 153.2 (COBoc), 152.8 (N=CH-S), 136.1 (Cq,Ar,Phe), 129.3 (CAr,Phe), 128.6 (CAr,Phe), 127.1 (CAr,Phe), 125.5 (NC=CH-S), 80.1 (Cq,Boc), 54.3 (Cα,Thia), 53.5 (Cα,Phe), 52.3 (CO2CH3), 51.6 (Cα,Leu), 40.8 (Cβ,Leu), 37.7 (Cβ,Phe), 33.2 (Cβ,Thia), 28.3 (CBoc), 24.5, 23.0 (Cδ,Leu), 21.8 (Cγ,Leu). 141
Experimenteller Teil
Br S
N
O Boc NH
NH CO2CH3
21a
Zu einem Schlenkrohr gibt man 20a (228 mg, 0.57 mmol) in wasserfreiem Acetonitril (2 mL) und einen Überschuß Ethylbromid (4 mL). Das Rohr wird verschlossen und die Mischung wird für 60 h bei 90°C gerührt. Es wird auf RT abgekühlt und das Gemisch direkt auf säulenchromatographisch aufgereinigt (SiO2, EtOAc/ Pentan 1:1 Æ Ethylbromid, CH2Cl2/MeOH 9:1 Æ Edukt and Product; Rf (CH2Cl2/MeOH, 9:1) = 0.10). Man lyophilisiert 21a aus einer Acetonitil-Wasser-Mischung und erhält einen gelb-weißen Feststoff (97 mg, 33%).
21a: C20H34BrN3O5S (507.14 g/mol): EA, ber. C, 47.24; H, 6.74; N, 8.26; S, 6.31; gef. C, 45.99; H, 6.55; N, 7.94; S, 6.07. ).- MS (ESI+): m/z = 428.21 [M-Br]+. - 1H NMR (CDCl3, 250 MHz): δ = 10.61 (1H, d, 3J = 2.3 Hz, N=CH-S), 8.84 (1H, d, 3J = 6.6 Hz, NHLeu), 8.16 (1H, d, 3
J = 2.3 Hz, C=CH-S) 5.91 (d, 3J = 6.7 Hz, NHThia), 4.90- 4.72 (3H, m, Cα,LeuH, N-CH2-CH3),
4.48- 4.28 (Cα,ThiaH), 3.68 (3H, s, CO2CH3), 3.39-3.25 (2H, m, Cβ,ThiaH), 1.83-1.45 (6 H, m, Cβ,LeuH, Cγ,LeuH, N-CH2-CH3), 1.35 (9H, s, Boc), 0.75 (6H, ps-tr, 3J = 5.9 Hz, Cδ,LeuH). - 13C NMR (CDCl3, 63 MHz): δ = 173.6 (COThiala), 170.1 (CO2CH3), 159.0 (Cq,Thia), 155.3 (COBoc), 145.7 (N=CH-S), 124.2 (C=CH-S), 80.4 (Cq,Boc), 52.4 (Cα,Thia), 51.9 (N-CH2-CH3), 50.7 (CO2CH3), 49.5 (Cα,Leu), 39.8 (Cβ,Leu), 31.2 (Cβ,Thia), 28.5 (CBoc), 25.0, 22.9 (Cδ,Leu), 21.5 (Cγ,Leu), 15.8 (N-CH2-CH3
142
Experimenteller Teil
Br N
S O
Boc NH
NH O HN
H3CO2C
21b
Zu einem Schlenkrohr gibt man 20b (245 mg, 0.45 mmol) in wasserfreiem Acetonitril (2 mL) und einen Überschuß Ethylbromid (4 mL). Das Rohr wird verschlossen und die Mischung wird für 60 h bei 90°C gerührt. Es wird auf RT abgekühlt und das Gemisch direkt auf säulenchromatographisch
aufgereinigt
(SiO2,
EtOAc/Pentan
1:1
Æ
Ethylbromid,
CH2Cl2/MeOH 9:1 Æ Edukt and Product; Rf (CH2Cl2/MeOH, 9:1) = 0.13). Man lyophilisiert 21b aus einer Acetonitil- Wasser- Mischung und erhält einen gelb-weißen Feststoff (95 mg, 31%).
21b: C29H43BrN4O6S (645.21 g/mol): EA, ber. C, 53.12; H, 6.61; N, 8.5; S, 4.89; gef. C, 50.21; H, 6.74; N, 7.83; S, 4.56. – MS (ESI+): m/z = 575.29 [M-Br]+. - 1H NMR (CDCl3, 250 MHz): δ = 10.20 (1H, d, 3J = 2.5 Hz, N=CH-S), 8.66 (1H, d, 3J = 7.7 Hz, NHPhe), 8.00 (1H, d, 3
J = 2.5 Hz, C=CH-S) 7.77 (1H, 3J = 7.7 Hz, NHLeu,), 7.31- 7.09 (5H, m, HAr,Phe), 6.14 (d, 3J =
7.7 Hz, NHThia), 4.85- 4.64 (4H, m, Cα,PheH, Cα,LeuH, N-CH2-CH3), 4.37- 4.26 (1H, m, Cα,ThiaH), 3.39 (3H, s, CO2CH3), 3.34-3.26 (2H, m, Cβ,PheH), 3.12 (2H, d, 3J = 7.2 Hz, Cβ,ThiaH), 1.60 (3H, t, 3J = 7.2 Hz, N-CH2-CH3), 1.49-1.34 (3H, m, Cβ,LeuH, Cγ,LeuH), 1.30 (9H, s, Boc), 0.78 (6H, dd, 3J = 5.7 Hz, 2J = 16.3 Hz, Cδ,LeuH). -
13
C NMR (CDCl3, 63
MHz): δ = 173.1 (COThiala), 172.8 (CO2CH3), 170.0 (COLeu), 157.8 (Cq,Thia), 155.5 (COBoc), 146.1 (N=CH-S), 136.8 (Cq,Ar,Phe), 129.6 (CAr,Phe), 128.6 (CAr,Phe), 127.0 (CAr,Phe), 124.4 (NC=CH-S), 80.3 (Cq,Boc), 54.1 (Cα,Thia, N-CH2-CH3), 52.4 (Cα,Phe), 50.6 (CO2CH3), 49.5 (Cα,Leu), 40.8 (Cβ,Leu), 37.6 (Cβ,Phe), 31.0 (Cβ,Thia), 28.4 (CBoc), 24.8, 22.7 (Cδ,Leu), 22.0 Cγ,Leu), 15.7 (N-CH2-CH3). 143
Experimenteller Teil
Br
N OC CO W CO N OC CO CH3
22
W(CO)6 (352 mg, 1mmol) wird in wasserfreiem THF (30 mL) gelöst und für 3 h mit UVLicht, unter gelegentlicher Kühlung, bestrahlt. Dabei färbt sich die anfänglich farblose Lösung gelb-orange. In einem Schlenkkolben, der auf -40°C vorgekühlt wurde, werden 8a (248 mg, 680 µmol) und KOtBu (76 mg, 672 µmol) gegeben und mit vorgekühltem THF (20 mL, - 30°C) versetzt. Man lässt für 30 min rühren, wobei sich die Lösung leicht gelblich verfärbt. Anschließend wird durch eine Argonfritte mit Celite (vorgekühlt) filtriert, um von KI abzutrennen. Die Carben- THF- Lösung wird in einen gekühlten Schlenkkolben mit W(CO)5(THF) kanüliert. Man lässt langsam auf RT kommen und rührt ü.N., wobei die Lösung orange wird. Das THF wird unter vermindertem Druck entfernt und der Überschuss W(CO)6 durch Sublimation (10-3mbar, 35°C) entfernt. Der Rückstand wird in THF (10 mL) gelöst, durch Celite filtriert und mit Hexan (30 mL) bei 4°C ü.N. gefällt. Man erhält 22 als einen hellgelben Feststoff (165 mg, 44%).
22: C15H14BrN2O5W (564.96 g/mol): 1H NMR (CDCl3 /CD2Cl2, 200 MHz): δ = 7.62-7.55 (2H, M, HAr), 7.26-7.23 (HAr), 7.30 (1H, d, 3J = 1.9 Hz, N-CH=CH-N), 7.721(1H, d, 3J = 1.9 Hz, N-CH=CH-N), 3.56 (3H,s, N-CH3).- IR (cm-1) in KBr : 1914 (CO), 1882 (CO).
144
Experimenteller Teil
N Rh N
Cl
CO2CH3
23a
6b (190 mg, 0.61 mmol) und Ag2O (74 mg, 0.32 mmol) werden mit 4 Å Molekularsieb (MS) in wasserfreiem CH2Cl2 (30 mL) für 4 h im Dunkeln geschwenkt. Anschließend wird eine Lösung von Chloro(1,5-cyclooctadiene) Rhodium(I)-Dimer (150 mg, 0.31 mmol) zugegeben und ü.N. im Dunkeln geschwenkt. Danach wird durch Celite filtriert und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wird aus CH2Cl2/Pentan bei 4°C gefällt. Man erhält einen gelben Feststoff (130 mg, 45%).
23a: C21H26ClN2O2Rh (476.80 g/mol): EA, ber. C, 52.9; H, 5.5; N, 5.9; gef. C, 48.73; H, 5.14; N, 5.42. – MS (Fab, NBA): m/z = 476 [M]+, 441 [M–Cl]+. - 1H NMR (CD2Cl2, 400.13 MHz): δ = 8.01 (2H, AA’XX’, N = 8.24 Hz, HAr), 7.47(2H, AA’XX’, N = 8.24 Hz, 2 H, HAr), 6.9 (1H, br.s, N-CH=CH-N), 6.72 (1H, d, 3J = 1.91 Hz, N-CH=CH-N), 5.04 (2H, br.s, N-CH2Ar), 4.09 (3H, s, CO2CH3), 3.89 (3H, s, N-CH3), 3.44-3.20 (2H, m, COD), 2.49-1.82 (8H, m, COD).- 13C NMR (CD2Cl2, 100 MHz): δ = 166.6 (COCH3), 142.1 (Cq,Ar), 129.9 (CAr), 128.7 (Cq,Ar), 128.1 (CAr), 122.9 (N-CH=CH-N), 120.5 (NCH=CH-N), 98.7 (N-CH2-Ar), 69.4 (d, JRh,C = 15.6 Hz, COD), 69.1 (d, JRh,C = 14.1 Hz, COD), 68.3 (d, JRh,C = 14.8 Hz, COD), 68.1 (d, JRh,C = 14.7 Hz, COD),), 52.1 (CO2CH3), 37.7 (N-CH3), 33.1 (d, JRh,C = 13.4 Hz, COD),), 32.6 (d, JRh,C = 28.6 Hz, COD), 29.2 (d, JRh,C = 27.7 Hz, COD), 28.8 (d, JRh,C = 14.1 Hz, COD).
145
Experimenteller Teil
N N
Rh Cl
F F
F F
O O
F
23b
6c (283 mg, 0.61 mmol) und Ag2O (74 mg, 0.32 mmol) werden mit 4 Å MS in wasserfreiem CH2Cl2 (30 mL) für 4 h im Dunkeln geschwenkt. Anschließend wird eine Lösung von Chloro(1,5-cyclooctadiene) Rhodium(I)-Dimer (150 mg, 0.31 mmol) zugegeben und ü.N. im Dunkeln geschwenkt. Danach wird durch Celite filtriert und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wird aus CH2Cl2/Pentan bei 4°C gefällt. Man erhält 23b als einen gelben Feststoff (350 mg, 93%).
23b: C26H23ClF5N2O2Rh (612.82 g/mol): EA, ber. C, 49.66; H, 3.69; N, 4.45; gef. C, 50.13; H, 4.42; N, 5.11. - MS (ESI+, CH3CN): m/z = 593.04 [M–Cl]+. - 1H NMR (CD2Cl2, 250 MHz ): δ = 8.19 (2H, AA’XX’, N = 8.36 Hz, HAr), 7.60 (2H, AA’XX’, N = 8.36 Hz, HAr), 6.92 (1H, d, 3J = 1.85 Hz, N-CH=CH-N), 6.73 (1H, d, 3J = 1.85 Hz, N-CH=CH-N), 4.96 (2H, s, NCH2-Ar), 4.11 (3H, s, N-CH3), 3.43–3.43 (2H, m, COD), 2.54–2.23 (4H, m, COD), 1.96–1.80 (6H, m, COD). -
13
C NMR (CD2Cl2, 63 ΜΗz): δ = 162.3 (COO), 144.2 (Cq,Ar), 131.1 (CAr),
128.6 (CAr), 126.6 (Cq,Ar), 123.1 (N-CH=CH-N), 120.4 (N-CH=CH-N), 98.8 (N-CH2-Ar), 68.47(COD), 68.24 (COD), 37.71 (N-CH3), 33.11 (COD), 32.71 (COD), 29.01 (COD), 28.69 (COD), - 19F NMR (CD2Cl2, 235 MHz): δ = -153.1 (2F, d, 3J =16.99 Hz, ArF), -158.9 (1F, t, 3
J = 21.63, Hz, ArF), 163.2 (2F, dd, 3J= 16.99, 21.63 Hz, ArF).
146
Experimenteller Teil
N Ru N
Cl
Cl
H3CO2C
24a
6b (95 mg, 0.31 mmol) und Ag2O (37 mg, 0.16mol) werden mit 4 Å MS in wasserfreiem CH2Cl2 (30 mL) für 4 h im Dunkeln geschwenkt. Anschließend wird eine Lösung von Dchloro(p-cymene) Ruthenium(II)-Dimer (95 mg, 0.16 mmol) zugegeben und ü.N. im Dunkeln geschwenkt. Danach wird durch Celite filtriert und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wird aus CH2Cl2/Pentan bei 4°C gefällt. Man erhält einen orangen Feststoff (70 mg, 42%).
24a: C23H28Cl2N2O2Ru (536.06 g/mol): EA, ber. C, 51.49; H, 5.26; N; 5.22; gef. C, 50.22; H, 6.19; N, 5.11. - MS (ESI+, CH3CN): m/z = 501.01 [M–Cl]+. - 1H NMR (CD2Cl2, 250 MHz): δ = 8.10 (2H, AA’XX’, N = 8.46 Hz, HAr), 7.36 (2H, AA’XX’, N = 8.46 Hz, HAr), 7.08 (1H, d, 3
J = 2.00 Hz, NCH=CH-N), 6.86 (1H, d, 3JH,H = 2.00 Hz, N-CH=CH-N), 5.35 (2H, br. s, Hp-
cym,Ar),
4.97 (2H, br. s, Hp-cym,Ar), 4.03 (3H, s, CO2CH3), 3.88 (3H, s, NCH3), 2.91 (1H, quin, 3J
= 6.90 Hz, CH(CH3)2), 1.99 (3H, s, Ar-CH3), 1.24 (6H, d, 3J = 6.93 Hz, CH(CH3)2. -
13
C
NMR (CD2Cl2, 63 MHz): δ = 175.5 (NCN), 166.5 (CO2CH3), 143.0 (CqAr), 130.0 (CAr), 127.6 (CAr), 124.4 (N-CH=CH-N), 122.8 (N-CH=CH-N), 109.2 (Cp-cymAr), 98.6 (CpcymAr), 81.8 (NCH2-Ar), 54.5 (CO2CH3), 52.06 (N-CH3), 39.68 (CH3-Ar), 30.79 (CH(CH3)2), 18.52 (CH(CH3)2).
147
Experimenteller Teil
N Ru N
Cl
F Cl
O
F
F
O
F F
24b 6c (293 mg, 0.61 mmol) und Ag2O (74 mg, 0.32 mol) werden mit 4 Å MS in wasserfreiem CH2Cl2 (30 mL) für 4 h im Dunkeln geschwenkt. Anschließend wird eine Lösung von Dichloro(p-cymene) Ruthenium(II)-Dimer (190 mg, 0.16 mmol) zugegeben und ü.N. im Dunkeln geschwenkt. Danach wird durch Celite filtriert und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wird aus CH2Cl2/Pentan bei 4°C gefällt. Man erhält einen orangen Feststoff (256 mg, 61%).
24b: C28H25Cl2F5N2O2Ru (688.48 g/mol): EA, ber. C, 48.85; H, 3.66; N, 4.07; gef. C, 49.24; H, 4.76;N,4.29. - MS (ESI+, CH3CN): m/z = 653.02 [M–Cl]+. - 1H NMR (CD2Cl2, 250 MHz ): δ = 8.18 (2H, AA’XX’, N = 8.51 Hz, HAr), 7.48 (2H, AA’XX’, N = 8.51 Hz, HAr), 7.01 (1H, d, 3J = 2.01 Hz, N-CH=CH-N), 6.86 (1H, d, 3J = 2.01 Hz, N-CH=CH-N), 5.39 (2H, AA’XX’, N= 4.40 Hz, Hp-cymAr), 5.03 (2H, AA’XX’, N = 4.40 Hz, Hp-cymAr), 4.04 (2H, s, NCH2-Ar), 2.93 (1H, quin, 3J = 6.92 Hz, CH(CH3)2), 2.02 (3H, s, Ar-CH3), 1.26 (6H, d, 3J = 6.93 Hz, CH(CH3)2). -
13
C NMR (CD2Cl2, 63 ΜΗz): δ = 175.8 (NCN), 162.3 (COO), 145.1
(CqAr), 131.0 (CAr), 128.5 (CAr), 126.5 (CqAr), 124.6 (N-CH=CH-N), 122.6 (N-CH=CH-N), 109.7 (Cp-cymAr), 98.8 (Cp-cymAr), 82.0 (N-CH2-Ar), 54.5 (N-CH3), 39.7 (CH3-Ar), 30.9 (CH(CH3)2), 18.6 (CH(CH3)2). -
19
F NMR (CD2Cl2, 235 MHz): δ = -153.1 (2F, d, 3JF,F =
16.72 Hz, ArF), -158.9 (1F, t, 3JF,F = 21.67, Hz, ArF), -163.2 (2F, dd, 3JF,F= 16.72, 21.67 Hz, ArF).
148
Experimenteller Teil
N Ru N
Cl Cl
F
F
O O
F F
F
24c Zu einer Lösung von 7b (196 mg, 0.4 mmol) in wasserfreiem Dichlormethan (20 mL) über 4 Å MS gibt man Ag2O (48 mg, 0.21 mmol) und lässt ü.N. im Dunkeln schwenken. Dann gibt man Dichloro(p-Cymene) Ruthenium(II)-Dimer (129 mg, 0.21 mmol) dazu und schwenkt das Gemisch im Dunkeln ü.N.. Die orange Lösung wird durch Celite filtriert, um vom AgBr abzutrennen, und das Lösungsmittel wird unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wird anschließend aus CH2Cl2/Pentan (10 mL/30 mL) bei 4°C umkristalllisiert. Nach Filtration erhält man 24c als ein oranges Pulver (98 mg, 65%).
24c: C30H29Cl2F5N2O2Ru (716.06 g/mol): EA, ber. C, 50.29; H, 4.08; N, 3.91; gef. C, 50.28; H, 4.22; N, 4.00. - MS (ESI+, Acetonitril): m/z = 680.97 [M-Cl]+.- 1H NMR (400.13 MHz, CD2Cl2): δ = 8.18 (2H, AA’XX’, N = 8.31 Hz, HAr), 7.48 (2H, AA’XX’, N = 8.31 Hz, HAr), 7.18 (1H, d, 3J = 2.02 Hz, N-CH=CH-N), 6.87 (1H, d, 3J = 2.02 Hz, N-CH=CH-N), 5.45 (2H, AA’XX’, N = 5.59 Hz, Hp-cymene,Ar), 5.39 (quin, 3J = 6.49 Hz, 2J = 13.30 Hz, N-CH(CH3)2), 5.09 (2H, AA’XX’, N = 5.59 Hz, Hp-cymene,Ar), 2.93 (1H, quin, 3J = 6.85 Hz, 2J = 13.82 Hz, ArCH(CH3)2,) 2.03 (3H, s, CH3-Ar), 1.48 (6H, d, 3J = 6.49 Hz, N-CH(CH3)2), 1.28 (6H, d, 3J = 6.85 Hz, Ar-CH(CH3)2). –
13
C NMR (100 MHz, CD2Cl2): δ = 175.0 (NCN), 162.3 (COO),
145.1 (Cq,Ar), 131.0 (CAr), 128.7 (CAr), 126.5 (Cq,Ar), 123.1 (N-CH=CH-N), 119.5 (NCH=CH-N), 108.2 (Cp-cymene,q,Ar), 98.6 (Cp-cymene,q,Ar), 86.2 (Cp-cymene,Ar), 82.6 (Cp-cymene,Ar), 54.6 (N-CH(CH3)2), 52.7 (N-CH2-Ar), 30.9 (Ar-CH(CH3)2), 24.8 (N-CH(CH3)2), 22.9 (ArCH(CH3)2), 18.8 (CH3-Ar). -
19
F NMR (235 MHz, DMSO-d6): δ = -153.09 (2F, d, 3JF,F =
17.9 Hz), -158.88 (1F, t, 3JF,F = 21.43 Hz), -163.16 (2H, dd, 3JF,F = 21.43, 17.9 Hz).
149
Experimenteller Teil
N Ru N
Cl
Cl
I
24d Zu einer Lösung von 9a (248 mg, 0.61 mmol) in wasserfreiem Dichlormethan (20 mL) über 4 Å MS gibt man Ag2O (74 mg, 0.31 mmol) und lässt ü.N. im Dunkeln schwenken. Dann gibt man Dichloro(p-Cymene) Ruthenium(II)-Dimer (190 mg, 0.31 mmol) dazu und schwenkt das Gemisch im Dunkeln ü.N.. Die orange Lösung wird durch Celite filtriert, um vom AgBr abzutrennen, und das Lösungsmittel wird unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wird aus CH2Cl2/Pentan (10 mL/30 mL) bei -20°C umkristallisiert. Nach Filtration erhält man 24d als ein oranges Pulver (322 mg, 81%).
24d: C23H29Cl2IN2Ru (631.89 g/mol): EA, ber. C, 43.68; H, 4.62; N, 4.43; gef. C, 42.21; H, 5.25; N, 4.16. MS (ESI+, Acetonitril): m/z = 596.97 [M-Cl]+.
150
Experimenteller Teil
N N
Rh
F
Cl F Cl
F
O
F
O
F
25
Zu einer Lösung von 6c (225 mg, 0.49 mmol) in wasserfreiem Dichlormethan (20 mL) über 4 Å MS gibt man Ag2O (56 mg, 0.24 mmol) und lässt für 4 h im Dunkeln schwenken. Dann gibt man Dichloro(Cp*) Rhodium(III)-Dimer (150 mg, 0.24 mmol) dazu und schwenkt das Gemisch im Dunkeln ü.N.. Die orange Lösung wird durch Celite filtriert, um vom AgBr abzutrennen, und das Lösungsmittel wird unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wird aus Dichlormethan/Pentan (1:3, -20°C) umkristallisiert. Nach Filtration erhält man ein oranges Pulver als Produkt (210 mg, 63%).
25: C28H26Cl2F5N2O2Rh (690.03 g/mol): EA, ber. C, 48.65; H, 3.79; N, 4.05; gef. C, 47.37; H, 3.9; N, 3.66. - MS (ESI+, Acetonitril): m/z = 655.06 [M-Cl]+.- 1H NMR (CD2Cl2, 250 MHz): δ = 8.34 (2H, AA’XX’, N = 8.5 Hz, HAr), 8.7.54 (2H, AA’XX’, N = 8.5 Hz, HAr), 7.11 (1H, d, 3J = 2.0 Hz, N-CH=CH-N), 6.82 (1H, d, 3J = 2.0 Hz, N-CH=CH-N), 4.04 (3H, s, NCH3), 1.57 (15H, s, CH3-Cp*). - 13C NMR (CD2Cl2, 63 MHz): δ = 171.7 (d, JRh,C = 56.9 Hz, NCN), 162.8 (CO), 145.2 (Cq,Ar), 131.4 (CAr), 129.4 (CAr), 126.9 (Cq,Ar), 125.6 (N-CH=CHN), 123.3 (N-CH=CH-N), 96.9 (d, JRh,C = 7.0 Hz, Cq,Cp*), 54.6 (N-CH2-Ar), 39.6 (N-CH3), 9.71 (CH3-Cp*).-
19
F NMR (CD2Cl2, 235 MHz): δ = -133.0 (2F, d, 3JF,F = 17.29 Hz, ArF), -
151.2 (1F, t, 3JF,F = 21.63, Hz, ArF), -164.6 (2F, dd, 3JF,F = 17.29 Hz, 21.63 Hz, ArF).
151
Experimenteller Teil
N Ru N O
Cl
Cl
HN O
H3CO
26
Zu einer Lösung von 15a (175 mg, 0.52 mmol) in wasserfreiem Dichlormethan (20 mL) über 4 Å MS gibt man Ag2O (60 mg, 0.26 mmol) und lässt ü.N. im Dunkeln schwenken. Dann gibt man Dichloro(p-Cymene) Ruthenium(II)-Dimer (160 mg, 0.26 mmol) dazu und schwenkt das Gemisch im Dunkeln ü.N.. Die orange Lösung wird durch Celite filtriert, um vom AgBr abzutrennen, und das Lösungsmittel wird unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wird
säulenchromatographisch
aufgereinigt
(SiO2,
CH2Cl2/MeOH
(1-10%),
Rf
(CH2Cl2/MeOH, 9:1) = 0.17) und anschließend aus CH2Cl2/Pentan bei RT umkristallisiert. Man erhält 26 als ein oranges Pulver (100 mg, 32%).
26: C26H33Cl2N3O3Ru (607.09 g/mol): EA, ber. C, 51.40; H, 5.47; N, 6.92; gef. C, 51.5; H, 6.43; N, 4.43. - MS (ESI+, Acetonitril): m/z = 572.10 [M – Cl]+. - 1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz): δ = 7.46-7.02 (7H, m, HAr,Phe, N-CH=CH-N, NH), 5.80 (1H, d, 3J = 5.1 Hz, N-CH2CO), 5.83-5.73 (2H, m, HAr,p-cymene), 5.32 (2H, dd, N = 19.5 Hz, 5.9 Hz, HAr,p-cymene), 4.32-4.18 (2H, m, N-CH2-CO, Hα,Phe), 3.92 (CO2CH3), 3.55 (N-CH3), 2.83 (1H, quin, 3J = 14.3 Hz, 7.2 Hz, Ar-CH(CH3)2), 2.74-2.59 (2H, m, Hβ,Phe), 1.96 (3H, s, Ar-CH3), 1.20-1.11 (6H, ps-d, ArCH(CH3)2). -
13
C NMR (DMSO-d6, 63 MHz): δ = 175.3 (NCN), 173.8 (CO2CH3), 168.5
(COPhe), 141.8 (Cq,Ar,Phe), 129.6 (CAr,Phe), 128.8 (CAr,Phe), 127.3 (CAr,Phe),, 126.23 (N-CH=CHN), 125.06 (N-CH=CH-N), 108.9, 106.4, 100.2, 98.4 (CAr,p-cymene), 72.9 (N-CH2-CO), 53.7 (Cα,Phe), 50.8 (CO2CH3), 37.20 (N-CH3), 30.62 (Cβ,Phe), 30.07 (Ar-CH(CH3)2), 24.17, 24.00 (Ar-CH(CH3)2), 19.86 (Ar-CH3).
152
Experimenteller Teil Boc HN N
H3CO O
N H
O
Rh S Cl Cl
27a
Zu einer Lösung von 21a (62 mg, 0.12 mmol) in wasserfreiem Dichlormethan (20 mL) über 4 Å MS gibt man Ag2O (14 mg, 0.06 mmol) und lässt ü.N. im Dunkeln schwenken. Dann gibt man
Dichloro(Cp*) Rhodium(III)-Dimer (37.2 mg, 0.06 mmol) dazu und schwenkt das
Gemisch im Dunkeln ü.N.. Die orange Lösung wird durch Celite filtriert, um vom AgBr abzutrennen, und das Lösungsmittel wird unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wird säulenchromatographisch aufgereinigt (SiO2, CH2Cl2/MeOH, 9:1) und anschließend aus CH2Cl2/Pentan (10 mL/30 mL) bei -20°C umkristalllisiert. Nach Filtration erhält man 27a als ein oranges Pulver (25 mg, 28%).
27a: C30H48Cl2N3O5RhS (735.17 g/mol): EA, ber. C, 48.92; H, 6.57; N, 5.70; S, 4.35; gef. C, 46.3; H, 6.53; N, 5.63; S, 4.66. - MS (ESI+, Acetonitril): m/z = 700.21 [M-Cl]+, 744.0, 746.10 [M-Et-H+K]+. - 1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz, 25°C) δ = 8.36 (1H, d, 3J = 7.9 Hz, NHLeu), 7.63 (1H, s, C=CH-S), 4.6-4.57 (1H, m, Cα,LeuH), 7.20 (d, 3J = 8.7 Hz, NHThia), 4.52-4.43 (2H, Cα,LeuH , N-CH2-CH3), 4.40-4.28 (1H, m, N-CH2-CH3, Cα,ThiaH), 3.61 (3H, s, CO2CH3), 3.172.99 (2H, m, Cβ,ThiaH), 1.71-1.44 (21, m, Cβ,LeuH, Cγ,LeuH, N-CH2-CH3, Cp(CH3)5), 1.35 (9H, s, Boc), 0.88 (6H, dd, 3J = 6.4 Hz, 2JH,H = 20.7 Hz, Cδ,LeuH). -
13
C NMR (DMSO-d6, 100
MHz): δ = 172.7 (COThiala), 171.0 (CO2CH3), 170.7 (NCS), 155.2 (Cq,Thia), 147.7 (COBoc), 124.2 (C=CH-S), 96.3 (“d”, JRh,H = 6.8 Hz, Cq,Cp*), 78.3 (Cq,Boc), 52.8 (Cα,Thia), 51.9 (CO2CH3), 51.8 (N-CH2-CH3), 50.2 (Cα,Leu), omitted by solvent (Cβ,Leu), 29.8 (Cβ,Thia), 28.0 (CBoc), 24.1 (Cγ,Leu), 22.7, 21.1 (Cδ,Leu), 17.0 (N-CH2-CH3), 8.3 (CCp,Me).
153
Experimenteller Teil
Boc HN
N
H3CO O
N H
Ru S
O
Cl
Cl
27b
Zu einer Lösung von 21a (97 mg, 0.19 mmol) in wasserfreiem Dichlormethan (20 mL) über 4 Å MS gibt man Ag2O (22 mg, 0.10 mmol) und lässt ü.N. im Dunkeln schwenken. Dann gibt man Dichloro(p-Cymene) Ruthenium(II)-Dimer (59 mg, 0.10 mmol) dazu und schwenkt das Gemisch im Dunkeln ü.N.. Die orange Lösung wird durch Celite filtriert, um vom AgBr abzutrennen, und das Lösungsmittel wird unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wird säulenchromatographisch aufgereinigt (SiO2, CH2Cl2/MeOH, 9:1) und anschließend aus CH2Cl2/Pentan (10 mL/30 mL) bei -20°C umkristalllisiert. Nach Filtration erhält man 27b als ein oranges Pulver (40 mg, 28%).
27b: C30H47Cl2N3O5RuS (733.17 g/mol): EA, ber. C, 49.11; H, 6.46; N, 5.73; S, 4.37; gef. C, 46.43; H, 5.84; N, 5.65; S, 3.90. - MS (ESI+, Acetonitril): m/z = 698.14 [M-Cl]+. - 1H NMR (Acetonitril-d3, 250 MHz) δ = 7.38 (1H, s, C=CH-S), 6.00 (1H, d, 3J = 8.1 Hz, NHLeu), 5.665.45 (1H, m, NHThia), 5.42 (2H, dd, AA’XX’, N = 8.0 Hz, 6.0 Hz, HAr,p-cymene), 5.23 (2H, dd, AA’XX’, N = 13.1 Hz, 5.9 Hz, HAr,p-cymene), 4.83-4.64 (2H, m, Cα,LeuH, N-CH2-CH3), 4.504.31 (2H, m, Cα,ThiaH, N-CH2-CH3), 3.66 (3H, s, CO2CH3), 3.51-3.30 (1H, m, Cβ,ThiaH), 3.263.06 (1H, m, Cβ,ThiaH), 2.82-2.63 (1H, m, CH(CH3)2-Arp-cymene), 1.98 (3H, s, CH3-Arp-cymene), 1.76-1.46 (6H, m, Cβ,LeuH, Cγ,LeuH, N-CH2-CH3), 1.39 (9H, s, Boc), 1.21 (6H, dd, 3J = 6.9 Hz, 2
J = 2.7 Hz, CH(CH3)2-Arp-cymene), 0.92 (6H, dd, 3JH,H = 8.0 Hz, 2J = 6.4 Hz, Cδ,LeuH). –
13
C
NMR (Acetonitril-d3, 63 MHz): δ = 174.2 (COThiala), 171.9 (CO2CH3), 171.9 (NCS), 156.8 (Cq,Thia), 147.2 (COBoc), 124.3 (C=CH-S), 107.6, 101.5 (Cq,Ar,p-cymene), 87.9, 87.5, 86.7, 85.7 (CAr,p-cymene), 80.8 (Cq,Boc), 54.7 (Cα,Thia), 53.2 (N-CH2-CH3), 52.2 (CO2CH3), 50.8 (Cα,Leu), 41.4 (Cβ,Leu), 31.8 (Cβ,Thia), 28.7 (CBoc), 25.5 (CH3-Arp-cymene), 22.8, 22.0 (Cδ,Leu), 21.8 (Cγ,Leu), 18.9, 18.7 (CH(CH3)2-Arp-cymene), 17.1 (CH(CH3)2-Arp-cymene), 15.8 (N-CH2-CH3). 154
Experimenteller Teil
O H3CO
H N O
Boc HN N N H
Rh O
S Cl
Cl
28a
Zu einer Lösung von 21b (83 mg, 0.13 mmol) in wasserfreiem Dichlormethan (20 mL) über 4 Å MS gibt man Ag2O (15 mg, 0.06 mmol) und lässt ü.N. im Dunkeln schwenken. Dann gibt man Dichloro(Cp*) Rhodium(III)-Dimer (38.7 mg, 0.06 mmol) dazu und schwenkt das Gemisch im Dunkeln ü.N.. Die orange Lösung wird durch Celite filtriert, um vom AgBr abzutrennen, und das Lösungsmittel wird unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wird säulenchromatographisch aufgereinigt (SiO2, CH2Cl2/MeOH, 9:1, Rf(CH2Cl2/MeOH, 9:1) = 0.48) und anschließend aus CH2Cl2/Pentan (10 mL/30 mL) bei -20°C umkristalllisiert. Nach Filtration erhält man 28a als ein oranges Pulver (30 mg, 27%).
28a: C39H57Cl2N4O6RhS (887.28 g/mol): EA, ber. C, 53.00; H, 6.50; N, 6.34; S, 3.63; gef. C, 53.64; H, 7.31; N, 7.31; S, 3.97. - MS (ESI+, Acetonitril): m/z = 847.29 [M-Cl]+, 891.20, 893.17 [M-Et-H+K]+. - 1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ = 8.40 (1H, d, 3J = 7.6 Hz, NHLeu), 7.94 (d, 3J = 8.4 Hz, NHPhe), 7.58 (1H, s, C=CH-S), 7.28- 7.16 (6H, m, HAr,Phe, NHThia), 4.64.57 (1H, m, Cα,LeuH), 4.52-4.43 (3H, m, Cα,PheH, N-CH2-CH3), 4.40- 4.28 (1H, m, Cα,ThiaH), 3.58 (3H, s, CO2CH3), 3.13-2.88 (4H, m, Cβ,ThiaH, Cβ,PheH), 1.76- 1.42 (21H, m, Cβ,LeuH, Cγ,LeuH, N-CH2-CH3, Cp(CH3)5), 1.34 (9H, s, Boc), 0.86 (6H, dd, 3J = 6.5 Hz, 2J = 14.0 Hz, Cδ,LeuH). -
13
C NMR (DMSO-d6, 100 MHz): δ = 171.9 (COThiala), 171.8 (CO2CH3), 171.7
(COLeu), 170.0 (NCS), 155.4 (Cq,Thia), 146.5 (COBoc), 137.0 (Cq,Ar,Phe), 129.0 (CAr,Phe), 128.1 (CAr,Phe), 126.5 (C=CH-S), 96.8, 96.5, 96.3 (“td”, JRh,H = 6.4 Hz, Cq,Cp*), 78.4 (Cq,Boc), 53.5 (Cα,Thia), 51.8 (CO2CH3, N-CH2-CH3), 53.2 (Cα,Phe), 50.8 (Cα,Leu), 41.2 (Cβ,Leu), 36.5 (Cβ,Phe), 29.7 (Cβ,Thia), 28.0 (CBoc), 23.9 (Cγ,Leu), 22.9, 21.6 (Cδ,Leu), 17.0 (N-CH2-CH3), 8.5 (“t”, JRh,C = 22.6 Hz, CCp,Me).
155
Experimenteller Teil
O H3CO
H N O
Boc HN N N H
Ru O
S Cl
Cl
28b Zu einer Lösung von 21b (95 mg, 0.14 mmol) in wasserfreiem Dichlormethan (20 mL) über 4 Å MS gibt man Ag2O (17 mg, 0.07 mmol) und lässt ü.N. im Dunkeln schwenken. Dann gibt man Dichloro(p-Cymene) Ruthenium(II)-Dimer (44.4 mg, 0.07 mmol) dazu und schwenkt das Gemisch im Dunkeln ü.N.. Die orange Lösung wird durch Celite filtriert, um vom AgBr abzutrennen, und das Lösungsmittel wird unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wird säulenchromatographisch aufgereinigt (SiO2, CH2Cl2/MeOH, 9:1, Rf(CH2Cl2/MeOH, 9:1) = 0.59) und anschließend aus CH2Cl2/ Pentan (10 mL/30 mL) bei -20°C umkristalllisiert. Nach Filtration erhält man 28b als ein oranges Pulver (30 mg, 24%).
28b: C39H56Cl2N4O6RuS (880.23 g/mol): EA, ber. C, 53.17; H, 6.41; N, 6.36; S, 3.64; gef. C, 50.33; H, 5.94; N, 6.33; S, 3.25. - MS (ESI+): m/z = 845.17 [M-Cl]+. - 1H NMR (Acetonitrild3, 250 MHz) δ = 7.53 (1H, s, C=CH-S), 7.43 (1H, d, 3J = 7.1 Hz, NHLeu), 7.41-7.16 (6H, m, HAr,Phe, NHPhe), 5.96- 5.87 (1H, m, NHThia), 5.42 (2H, ps-tr, AA’XX’, N = 6.5 Hz, HAr,p-cymene), 5.23 (2H, AA’XX’, N = 11.7 Hz, 6.0 Hz, HAr,p-cymene), 4.86-4.53 (4H, m, Cα,LeuH, Cα,PheH, NCH2-CH3), 4.34-4.24 (1H, m, Cα,ThiaH), 3.64 (3H, s, CO2CH3), 3.24-2.94 (4H, m, Cβ,ThiaH, Cβ,PheH), 2.83-2.61 (1H, m, CH(CH3)2-Arp-cymene), 1.98 (3H, s, CH3-Arp-cymene), 1.76-1.40 (6H, m, Cβ,LeuH, Cγ,LeuH, N-CH2-CH3), 1.39 (9H, s, Boc), 1.26- 1.19 (6H, m, CH(CH3)2-Arp-cymene), 0.88 (6H, dd, 3J = 6.4 Hz, 2J = 10.8 Hz, Cδ,LeuH). -
13
C NMR (Acetonitril-d3, 63
MHz): δ = 173.6 (COThiala), 173.3 (CO2CH3), 171.9 (COLeu), 171.7 (NCS), 156.9 (Cq,Thia), 148.4 (COBoc), 138.7 (Cq,Ar,Phe), 130.7 (CAr,Phe), 129.7 (CAr,Phe), 128.0 (CAr,Phe), 124.2 (C=CHS), 107.6, 101.5 (Cq,Ar,p-cymene), 90.0, 87.8, 87.3, 85.9 (C,Ar,p-cymene), 80.9 (Cq,Boc), 55.2 (Cα,Thia), 55.0 (N-CH2-CH3), 53.4 (CO2CH3), 53.2 (Cα,Phe), 50.9 (Cα,Leu), 42.2 (Cβ,Leu), 38.4 (Cβ,Phe), 32.2 (Cβ,Thia), 28.9 (CBoc), 25.7 (CH3-Arp-cymene), 23.6, 22.8 (Cδ,Leu), 22.3 (Cγ,Leu), 18.9, 18.7 (CH(CH3)2-Arp-cymene), 18.2 (CH(CH3)2-Arp-cymene), 17.8 (N-CH2-CH3).
156
Experimenteller Teil
N N
Ru Cl
Cl H N O
O
H N
N H
O
O N H
OH O
29
Harz H-Leu-2-
Beladung
Einsatz
ASS
(mmol/g)
(g)
Überschuss
0.86
0.116
4
Cl-Trt
Abspalten
Abspalt-
Ausbeute
zeit 2%TFA
4h
40 mg (roh) 8 mg (9%) (HPLC)
Abspalten: Nach dem Koppeln von 24b (2.5 äq. mit HOBt*H2O) wird das Harz mit DMF, DCM und MeOH gewaschen und am Vakuum getrocknet. In einem Rundkolben wird 3 mL einer Lösung von 2% TFA, 5% TIS in DCM gegeben und für 3h leicht bewegt. Der Abspaltzyklus wird ein zweites Mal mit 20% TFA in MeOH wiederholt. Das Harz wird mit DCM gespült und das Produkt mit kaltem Diethylether/Hexan gefällt. Man erhält ein oranges Pulver (8 mg nach HPLC).
29: C41H52Cl2N6O6Ru (896,86 g/mol): MS (ESI+, CH3CN): m/z = 861.17 [M–Cl]+, 825.21 [M–2Cl–H]+. - 1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz): δ = 12.52 (1H, 1br. s, COOH), 8.76 (1H, t, 3
J = 5.74 Hz, NHArC=O), 8.16 (1H, d, 3J= 7.81 Hz, NHPhe), 8.12 (1H, t, 3J = 5.62 Hz, NHGly),
7.99 (1H, d, 3J = 8.50 Hz, NHLeu), 7.86 (2H, AA’XX’, N = 8.35 Hz, HAr), 7.66 (1H, t, 3J = 2.00 Hz, N-CH=CH-N), 7.33 (1H, t, 3J = 2.00 Hz, N-CH=CH-N), 7.28 – 7.14 (7H, m, HAr, HAr, Phe), 6.23 (1H, AA’XX’, N = 5.72 Hz, HAr,p-cymene), 6.10 (1H, AA’XX’, N = 10.17 Hz, HAr,p-cymene), 6.10 + 5.87 (2H, 2 × s, N-CH2-Ar), 5.84 (1H, ps-d, N = 9.48 Hz, HAr,p-cymene), 5.45 (1H, ps-d, N= 9.48 Hz, 1H, HAr,p-cymene), 4.51 (1H, m, Hα,Phe), 4.23 - 4.17 (1H, m, Hα,Leu), 157
Experimenteller Teil 3.91 (3H, s, N-CH3), 3.88 (2H, m, Hα,Gly), 3.66 (2H, dq, 3J = 5.65 Hz, 2J = 16.78 Hz, ArCONHCα,GlyH2), 3.06 (1H, dd, 3J = 4.34 Hz, 2J = 14.02 Hz, Hβ,Phe), 2.81-2.66 (2H, m, Hβ,Phe, CH(CH3)2), 2.06 (3H, s, Ar-CH3), 1.67 - 1.50 (3H, m, Hγ,Leu, Hβ,Leu), 1.13 (6H, dd, 3J = 6.90 Hz, 2J = 10.56 Hz, CH(CH3)2), 0.84 (6H, dd, 3J = 6.45 Hz, 2J = 22.06 Hz, Hδ,Leu). - 13C NMR (DMSO-d6, 100 MHz): δ = 174.5 (NCN), 172.4, 171.6, 170.3, 168.3 (CPhe,Gly,Gly,ArON), 165.6 (COO), 138.9 (Cq,p-Ar), 138.4 (Cq,p-Ar), 135.2 (Cq,Ar,Phe), 130.2 (CAr), 129.5 (CAr), 129.2 (CAr,Phe), 127.4 (CAr,Phe), 125.0 (N-CH=CH-N), 123.4 (N-CH=CH-N), 55.9 (Cα,Phe), 53.2 (NCH2-Ar), 52.2 (Cα,Leu), 44.8 (ArCO=NHCα,Gly), 43.8 (Cα,Gly), 40.9 (Cβ,Leu), 38.0 (Cβ,Phe), 36.9 (N-CH3), 25.4 (Cγ,Leu), 23.2, 21.7 (Cδ,Leu), 21.4 (Ar-CH3), 21.2 (CH(CH3)2), 17.3 (CH(CH3)2). - RP-HPLC: tR = 15.97 min.
158
Experimenteller Teil
N N
Rh Cl
Cl O
H N
N H
O
OCH3 O
30 Zu einer Lösung von 25 (60 mg, 0.087 mmol) in Acetonitril (2 mL) gibt man HOBt*H2O (13.22 mg, 0.087 mmol) und rührt für 5 min. Anschließend fügt man 16b (36 mg, 0.087 mmol) in Acetonitril (1 mL), das NEt3 (12 µL, 0.087 mmol) enthält, hinzu und lässt ü.N. rühren. Man filtriert durch Celite und entfernt das Lösungsmittel unter vermindertem Druck. Anschließend
wird
der
Rückstand
säulenchromatographisch
aufgereinigt
(SiO2,
EtOAc/Pentan Æ CH2Cl2 Æ Edukt, CH2Cl2/MeOH (1-20%) Produkt, Rf(CH2Cl2/MeOH 9:1) = 0.5). Man kristallisiert aus CH2Cl2/ Pentan bei -20°C um und erhält 30 als gelbes Pulver (20 mg, 29%).
30: C38H49Cl2N4O4Rh (798.22 g/mol): EA, ber. C, 57.08; H, 6.18; N, 7.01; gef. C, 53.88; H, 5.86; N, 9.43. - (ESI+): m/z = 763.28 [M-Cl]+. - 1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz): δ = 8.37 (1H, d, 3J = 9.4 Hz, NHPhe), 8.33-8.29 (1H, m, NHLeu),7.85 (2H, AA’XX’, N = 7.8 Hz, HAr), 7.47 (1H, d, 3J = 1.7 Hz, N-CH=CH-N), 7.41 (2H, AA’XX’, N = 7.8 Hz, HAr), 7.24-7.13 (5H, m, HAr,Phe), 7.03 (1H, d, 3J = 1.7 Hz, N-CH=CH-N), 6.24-6.12 (1H, m, N-CH2-Ar), 5.33-5.19 (1H, m, N-CH2-Ar), 4.56-4.50 (1H, m, Cα,LeuH), 4.49-4.45 (1H, m, Cα,PheH), 4.37- 4.26 (1H, m, Cα,ThiaH), 3.95 (3H, s, N-CH3),3.56 (3H, s, CO2CH3), 3.01 (2H, qt, 3J = 6.8 Hz, 2J = 13.8 Hz, Cβ,PheH), 3.12 (2H, d, 3J = 7.2 Hz, Cβ,ThiaH), 1.60 (3H, t, 3JH,H = 7.2H, N-CH2-CH3), 1.65 + 1.49 (18H, 2 br. s, Cβ,LeuH, Cγ,LeuH, CH3-Cp*), 0.87 (6H, dd, 3J = 6.1 Hz, 2J = 15.7 Hz, Cδ,LeuH). -
13
C NMR (DMSO-d6, 63 MHz): δ = 173.1 (COLeu,Phe), 172.6 (CO2CH3), 166.7
(NCN), 142.0, 137.5, 134.0 (Cq,Ar) 129.0, 128.9 (CAr,Phe), 128.3, 127.3 (CAr), 126.3 (NCH=CH-N), 123.8 (N-CH=CH-N), 96.7 (dd, JRh,C = 6.81 Hz, Cq,Cp*), 54.1 (Cα,Phe), 53.3 (NCH2-Ar), 52.5 (CO2CH3), 52.3 (Cα,Leu), 40.2 (Cβ,Leu), 39.1 (N-CH3), 37.4 (Cβ,Phe), 3 24.8 (Cγ,Leu), 23.6, 22.4 (Cδ,Leu), 9.64 (CCp*,Me). 159
Experimenteller Teil
O O N Rh N
Cl
31a Zu einer Lösung von 11a (151 mg, 0.61 mmol) in wasserfreiem Dichlormethan (20 mL) über 4 Å MS gibt man Ag2O (74 mg, 0.32 mmol) und lässt für 4 h im Dunkeln schwenken. Dann gibt man Chloro(1,5-cyclooctadiene) Rhodium(I)-Dimer (150 mg, 0.32 mmol) dazu und schwenkt das Gemisch im Dunkeln ü.N.. Die gelbe Lösung wird durch Celite filtriert, um vom AgBr abzutrennen, und das Lösungsmittel wird unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wird aus Dichlormethan/ Pentan (1:3, -20°C) umkristallisiert. Nach Filtration erhält man ein gelbes Pulver als Produkt (104 mg, 41%).
31a: C16H24ClN2O2Rh (414.06 g/mol): EA, ber. C, 46.34; H, 5.83; N, 6.75; gef. C, 45.54; H, 5.84; N, 6.75. - MS(ESI+, CH3CN): m/z = 379.04 [M-Cl]+. - 1H NMR (CD2Cl2, 250 MHz): δ = 6.96 (1H, d, 3J = 1.9 Hz, N-CH=CH-N), 6.91 (1H, d, 3J = 1.9 Hz, N-CH=CH-N), 6.00 (1H, d, 2J = 17.7 Hz, N-CH2-COO), 4.93 (2H, br.s, COD), 4.86 (1H, d, 2J = 17.7 Hz, N-CH2COO), 4.41 – 4.14 (2H, m, COO-CH2-CH3), 4.03 (3H, s, N-CH3), 3.44-3.29 (1H, m, COD), 3.29-3.13 (1H, m, COD), 2.53-2.21 (4H, m, COD), 2.08-1.79 (4H, m, COD), 1.33 (3H, t, 3J = 7.1 Hz, COO-CH2-CH3). -
13
C NMR (CD2Cl2, 63 ΜΗz): δ = 171.7 (COO), 145.1 (NCN),
125.4 (N-CH=CH-N), 124.8 (N-CH=CH-N), 101.8 (“d”, JRh,C = 6.9 Hz, COD), 101.5 (“d”, JRh,C = 7.0 Hz, COD), 101.8 (“d”, JRh,C = 6.9Hz, COD), 71.1 (“d”, JRh,C = 6.2 Hz, COD), 70.9 (“d”, JRh,C = 6.0 Hz, COD, 64.7 (N-CH2-COO), 54.53 (COO-CH2-CH3), 40.4 (N-CH3), 35.7 (“d”, JRh,C = 18.3 Hz, COD), 31.6 (“d”, JRh,C =9.1 Hz, COD) 16.9 (COO-CH2-CH3).
160
Experimenteller Teil
O O N N
Rh Cl
31b
Zu einer Lösung von 11b (84 mg, 0.31 mmol) in wasserfreiem Dichlormethan (20 mL) über 4 Å MS gibt man Ag2O (37 mg, 0.16 mmol) und lässt ü.N. im Dunkeln schwenken. Dann gibt man Chloro(COD) Rhodium(I)-Dimer (75 mg, 0.16 mmol) dazu und schwenkt das Gemisch im Dunkeln ü.N.. Die gelbe Lösung wird durch Celite filtriert, um vom AgBr abzutrennen, und das Lösungsmittel wird unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wird anschließend aus CH2Cl2/Pentan (10 mL/30 mL) bei -20°C umkristalllisiert. Nach Filtration erhält man 32b als ein gelbes Pulver (82 mg, 60%).
31b: C18H28ClN2O2Rh (442.09 g/mol): EA, ber. C, 48.8; H, 6.4; N, 6.3; gef. C, 45.8; H, 5.65; N, 6.56. - (ESI+, Acetonitril): m/z = 407.07 [M-Cl]+. - 1H NMR (CD2Cl2, 250 MHz): δ = 7.00 (1H, d, 3J = 2.02 Hz, N-CH=CH-N), 6.95 (1H, d, 3J = 2.02 Hz, N-CH=CH-N), 6.95 (1H, d, 2J = 17.69 Hz, N-CH2-CO), 5.65 (1H, quin, 3J = 6.77 Hz, 2J = 13.55 Hz, N-CH(CH3)2), 5.034.94 (1H, m, COD), 4.91-4.84 (1H, m, COD), 4.82 (1H,d 2J = 17.69 Hz, N-CH2-CO), 4.384.18 (2H, m, COO-CH2-CH3), 3.36-3.30 (1H, m, COD), 3.25-3.17 (1H, m, COD), 2.50-2.23 (4H, m, COD), 2.02-1.86 (4H, m, COD), 1.46-1.17 (6H, d, 3J = 6.77 Hz, 2J = 18.05 Hz, NCH(CH3)2), 1.34 (3H, t,
3
J = 7.14 Hz, COO-CH2-CH3). -
13
C NMR (CD2Cl2,
63 ΜΗz): δ = 169.9 (CΟΟ), 122.9 (N-CH=CH-N), 117.4 (N-CH=CH-N), 99.52 (d, JRh,C= 7.0 Hz, COD), 98.7 (d, JRh,C= 7.0 Hz, COD), 71.1 (d, JRh,C= 11.0 Hz, COD), 70.85 (d, JRh,C= 11.0 Hz, COD), 62.4 (N-CH2-COO), 52.5 (N-CH(CH3)2), 52.5 (COO-CH2-CH3), 35.8 (d, JRh,C= 5.2 Hz, COD), 31.7 (d, JRh,C= 5.2 Hz, COD), 24.4 (N-CH(CH3)2), 14.7 (COO-CH2-CH3).
161
Experimenteller Teil O O N Ru N
Cl
Cl
32a Zu einer Lösung von 11a (151 mg, 0.61 mmol) in wasserfreiem Dichlormethan (20 mL) über 4 Å MS gibt man Ag2O (74 mg, 0.32 mmol) und lässt fü 4 im Dunkeln schwenken. Dann gibt man Dichloro(p-cymene) Ruthenium(II)-Dimer (190 mg, 0.32 mmol) dazu und schwenkt das Gemisch im Dunkeln ü.N.. Die orange Lösung wird durch Celite filtriert um vom AgBr abzutrennen und das Lösungsmittel wird unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wird aus Dichlormethan/Pentan (1:3, -20°C) umkristallisiert. Nach Filtration erhält man ein oranges Pulver als Produkt (151 g, 52%).
32a: C18H26Cl2N2O2Ru (474.04 g/mol) : EA, ber. C, 45.57; H, 5.52; N, 5.91; gef. C, 45.98; H, 5.95; N, 5.27. - MS(ESI+, CH3CN): m/z = 439.02 [M-Cl]+.- 1H NMR (CD2Cl2, 250 MHz ): δ = 7.08 (2H, m, N-CH=CH-N), 5.41 (2H, AA’XX’, N = 5.85 Hz, Hp-cymene,Ar), 5.03 (2H, AA’XX’, N = 5.85 Hz, Hp-cymene,Ar), 4.28 (2H, dd, 3J = 7.14 Hz, 2J = 14.28 Hz,, COO-CH2CH3), 4.00 (3H, s, N-CH3), 2.95 (1H, quin, 3J = 6.87 Hz, 2J = 13.74 Hz, CH(CH3)2), 1.97 (3H, s, CH3-Ar), 1.35-1.2 (9H, m, COO-CH2-CH3, CH(CH3)2). -
13
C NMR (CD2Cl2, 63
MHz): δ = 176.8 (NCN), 170.0 (CΟΟ), 124.6 (Ν−CH=CH-N), 124.4 (Ν−CH=CH-N), 109.6 (Cp-cymene,Ar), 99.4 (Cp-cymene,Ar), 81.7 (N-CH2-COO), 62.3 (COO-CH2-CH3), 40.1(N-CH3), 31.3 (Ar-CH(CH3)2), 22.8 (Ar-CH(CH3)2), 18.74 (CH3-Ar), 14.5 (COO-CH2-CH3).
162
Experimenteller Teil
O O N Ru N
Cl
Cl
32b
Zu einer Lösung von 11b (84 mg, 0.31 mmol) in wasserfreiem Dichlormethan (20 mL) über 4 Å MS gibt man Ag2O (37 mg, 0.16 mmol) und lässt ü.N. im Dunkeln schwenken. Dann gibt man Dichloro(p-Cymene) Ruthenium(II)-Dimer (95 mg, 0.16 mmol) dazu und schwenkt das Gemisch im Dunkeln ü.N.. Die orange Lösung wird durch Celite filtriert, um vom AgBr abzutrennen, und das Lösungsmittel wird unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wird anschließend aus CH2Cl2/Pentan (10 mL/30 mL) bei -20°C umkristalllisiert. Nach Filtration erhält man 32b als ein oranges Pulver (78 mg, 50%).
32b: C20H30Cl2N2O2Ru (502.07 g/mol) : EA, ber. C, 47.81; H, 6.02; N, 5.58; gef. C, 45.91; H, 6.15; N, 4.92. - (ESI+, Acetonitril): m/z = 467.06 [M-Cl]+. - 1H NMR (CD2Cl2, 250 MHz): δ = 7.17 (1H, d, 3J = 2.07 Hz, N-CH=CH-N), 7.13 (1H, d, 3J = 2.07 Hz, N-CH=CH-N), 5.46 (2H, AA’XX’, N = 4.57 Hz, HAr,p-cymene), 5.33-5.22 (1H, m, N-CH(CH3)2), 5.05 (2H, AA’XX’, N = 4.57 Hz, HAr,p-cymene), 4.24 (2H, q, 3J = 7.12 Hz, COO-CH2-CH3), 2.89 (1H, quin, 3J = 6.88 Hz, 2J = 13.80 Hz, Ar-CH(CH3)2), 1.97 (3H, s, Ar-CH3), 1.46-1.17 (15H, m, N-CH(CH3)2, Ar-CH(CH3)2,
COO-CH2-CH3).
-
13
C
NMR
(CD2Cl2,
63 ΜΗz): δ = 175.5 (NCN),
169.9 (CΟΟ), 124.6 (N-CH=CH-N),119.6 (N-CH=CH-N), 108.1 (Cp-cymene,q-Ar), 98.9 (Cpcymene,q-Ar),
87.4, 86.9 (Cp-cymene,Ar), 82.4, 81.9 (Cp-cymene,Ar), 62.5 (N-CH2-COO), 53.4 (N-
CH(CH3)2), 53.0 (COO-CH2-CH3), 31.2 (N-CH(CH3)2), 25.1 (Ar-CH(CH3)2), 22.5 (Ar-CH3), 19.0 (Ar-CH(CH3)2), 14.7 (COO-CH2-CH3).
163
Experimenteller Teil
N Ru N
Cl
Cl
33
Zu einer Lösung von 12 (45 mg, 0.2 mmol) in wasserfreiem Dichlormethan (20 mL) über 4 Å MS gibt man Ag2O (23 mg, 0.1 mmol) und lässt ü.N. im Dunkeln schwenken. Dann gibt man Dichloro(p-Cymene) Ruthenium(II)-Dimer (61.2 mg, 0.1 mmol) dazu und schwenkt das Gemisch im Dunkeln ü.N.. Die orange Lösung wird durch Celite filtriert, um vom AgBr abzutrennen, und das Lösungsmittel wird unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wird anschließend aus CH2Cl2/Pentan (10 mL/30 mL) bei -20°C umkristalllisiert. Nach Filtration erhält man 33 als ein bronzenes Pulver (40 mg, 50%).
33: C15H22Cl2N2Ru (402.02 g/mol): MS (ESI+, Acetonitril): m/z = 367.01 [M-Cl]+. - 1H NMR (250 MHz, CD2Cl2): δ = 7.02 (2H, s, N-CH=CH-N), 5.37 (2H, AA’XX’, N = 6.0 Hz, Hpcymene,Ar),
5.05 (2H, AA’XX’, N = 6.0 Hz, Hp-cymene,Ar), 3.94 (6H, s, N-CH3), 2.91 (1H, quin, 3J
= 6.9 Hz, 2J = 2.02 13.8 Hz, Ar-CH(CH3)2), 1.23 (6H, d, 3J = 6.9 Hz, Ar-CH(CH3)2). –
13
C
NMR (63 MHz, CD2Cl2): δ = 123.9 (N-CH=CH-N), 109.5 (Cq,Ar), 98.9 (Cq,Ar), 85.8 (CAr), 81.9 (CAr), 39.5 (N-CH3), 30.9 (Ar-CH(CH3)2), 22.2 (Ar-CH(CH3)2), 18.5 (CH3-Ar). N
164
Experimenteller Teil
N Ru N
Cl Cl
34a
Zu einer Lösung von 13 (200 mg, 0.61 mmol) in wasserfreiem Dichlormethan (20 mL) über 4 Å MS gibt man Ag2O (74 mg, 0.32 mmol) und lässt ü.N. im Dunkeln schwenken. Dann gibt man Dichloro(p-Cymene) Ruthenium(II)-Dimer (190 mg, 0.32 mmol) dazu und schwenkt das Gemisch im Dunkeln ü.N.. Die orange Lösung wird durch Celite filtriert, um vom AgBr abzutrennen, und das Lösungsmittel wird unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wird anschließend aus CH2Cl2/Pentan (10 mL/30 mL) bei -20°C umkristalllisiert. Nach Filtration erhält man ein oranges Pulver (205 mg, 61%).
34a: C27H30Cl2N2Ru (554.08 g/mol): EA, ber. C, 58.48; H, 5.45; N, 5.05; gef. C, 56.66; H, 5.47; N, 4.94. - MS (ESI+, Acetonitril): m/z = 519.02 [M-Cl]+.- 1H NMR (CD2Cl2, 250 MHz): δ = 8.23 (1H, s, N-CH(Ph)2), 7.51-7.11 (10H, m, Ph), 7.06 (1H, 3J = 1.9 Hz, N-CH=CH-N), 6.88 (1H, 3J = 1.9 Hz, N-CH=CH-N), 5.28-4.82 (4H, m, Hp-cymene,Ar), 4.06 (3H, s, N-CH3). 2.89 (1H, quin, 3J = 6.8 Hz, 2J = 13.6 Hz, Ar-CH(CH3)2), 1.84 (3H, s, Ar-CH3), 1.19 (6H, d, 3J = 6.8 Hz, Ar-CH(CH3)2). –
13
C NMR (CD2Cl2, 63 MHz): δ = 176.1 (NCN), 154.5 (Cq,Ar),
130.5 (CAr), 129.6 (CAr), 129.1 (CAr), 128.9 (CAr), 128.5 (CAr), 127.4 (CAr), 123.9 (N-CH=CHN), 123.4 (N-CH=CH-N), 109.9, 99.4 (Cp-cymene,q,Ar), 88.2, 84.8, 82.2, 80.8 (Cp-cymene,Ar), 65.6 (N-CH(Ph)2), 40.7 (N-CH3), 31.2 (Ar-CH(CH3)2), 24.6, 20.7 (Ar-CH(CH3)2), 18.9 (Ar-CH3).
165
Experimenteller Teil
N N
Rh Cl
34b Zu einer Lösung von 13 (200 mg, 0.61 mmol) in wasserfreiem Dichlormethan (20 mL) über 4 Å MS gibt man Ag2O (74 mg, 0.32 mmol) und lässt ü.N. im Dunkeln schwenken. Dann gibt man Chloro(COD) Rhodium(I)- Dimer (150 mg, 0.32 mmol) dazu und schwenkt das Gemisch im Dunkeln ü.N.. Die gelbe Lösung wird durch Celite filtriert, um vom AgBr abzutrennen, und das Lösungsmittel wird unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wird anschließend aus CH2Cl2/ Pentan (10 mL /30 mL) bei -20°C umkristalllisiert. Nach Filtration erhält man 34b als ein gelbes Pulver (196 mg, 65%).
34b: C25H28ClN2Rh (494.1 g/mol): EA, ber. C, 60.7; H, 5.7; N, 5.7; gef. C, 59.01; H, 5.45; N, 5.42. - MS (ESI+, Acetonitril): m/z = 459.05 [M-Cl]+. - 1H NMR (CD2Cl2, 250 MHz): δ = 8.21 (1H, s, N-CH(Ph)2), 7.46-7.28 (10H, m, Ph), 6.88 (1H, 3J = 2.0 Hz, N-CH=CH-N), 6.71 (1H, 3J = 2.0 Hz, N-CH=CH-N), 5.08-4.84 (2H, m, COD), 4.09 (3H, s, N-CH3), 3.37-3.28 (1H, m, COD), 2.74-2.63 (1H, m, COD), 2.52-2.19 (4H, m, COD), 1.99-1.69 (4H, m, COD). – 13C NMR (CD2Cl2, 63 MHz): δ = 140.9, 140.8 (Cq,Ar), 130.1 (CAr), 129.3 (CAr), 129.1 (CAr), 128.7 (CAr), 128.2 (CAr), 127.9 (CAr), 122.7 (N-CH=CH-N), 120.6 (N-CH=CH-N), 99.2 (d, JRh,C= 6.8 Hz, COD), 98.3 (d, JRh,C= 7.1 Hz, COD), 69.4 (d, JRh,C= 14.1 Hz, COD), 68.7 (d, JRh,C= 14.4 Hz, COD), 67.6 (N-CH(Ph)2), 38.3 (N-CH3), 33.2 (d, JRh,C= 91.2 Hz, COD), 29.31 d, JRh,C= 61.7 Hz, COD).
166
Experimenteller Teil
Br
N
N Ag
N
Br
N AgBr
Br
35
9b (203 mg, 0.61 mmol) und Ag2O (74 g, 0.32 mmol) werden mit 4 Å MS in wasserfreiem CH2Cl2 (30 mL) für 5 h im Dunkeln geschwenkt. Danach wird durch Celite filtriert und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt. Das Produkt fällt als weißer Feststoff an (153 mg, 36%).
35: C22H22Ag2Br4N4 (871.67 g/mol): EA, ber. C, 30.10; H, 2.53; N, 6.38; gef. C, 30.17; H, 2.61; N, 6.2. - MS (ESI+, Acetonitril): m/z = 610.92, 608.90 [M-AgBr2]+.- 1H NMR (CDCl3, 250 MHz): δ = 7.48 (2H, AA’XX’, N = 8.53 Hz, HAr), 7.13 (2H, AA’XX’, N = 8.53 Hz, HAr), 6.98 (1H, d, 3J =1.79 Hz, N-CH=CH-N), 6.90 (1H, d, 3J = 1.79 Hz, N-CH=CH-N), 5.26 (2H, s, N-CH2-Ar), 3.86 (3H, s, N-CH3). -
13
C NMR (CDCl3, 63 MHz): δ = 134.4 (Cq,Ar), 132.3
(CAr), 128.5 (CAr), 122.7 (N-CH=CH-N), 121.0 (N-CH=CH-N), 55.0 (N-CH2-Ar), 38.9 (NCH3).
167
Experimenteller Teil
Br
N
N Au
N
Cl
N
Br
36
35 (50 mg, 0.072 mmol) wird mit DMS-AuCl (27 mg, 0.144 mmol) in wasserfreiem CH2Cl2 (15 mL) für 7 h gerührt. Nach Filtration durch Celite wird das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt. Man erhält 36 als weiß-gelblichen, hygroskopischen Feststoff (50 mg, 47%).
36: C22H24AuBr2ClN4 ( 733.97 g/mol): MS (ESI, Acetonitril): m/z = 698.96 [M-Cl]+. - 1H NMR (CDCl3, 250 MHz): δ = 7.49 (2H, AA’XX’, N = 8.32 Hz, HAr), 7.20 (2H, AA’XX’, N = 8.32 Hz, HAr), 6.95 (1H, d, 3J =1.92 Hz, N-CH=CH-N), 6.87 (1H, d, 3J = 1.92 Hz, NCH=CH-N), 5.22 (2H, s, N-CH2-Ar), 3.85 (3H, s, N-CH3). – 13C NMR (CDCl3, 63 MHz): δ = 133.7 (Cq,Ar), 132.0 (CAr), 129.4 (CAr), 122.1 (N-CH=CH-N), 120.0 (N-CH=CH-N), 54.2 (NCH2-Ar), 38.0 (N-CH3).
168
Experimenteller Teil Synthese von 1-3-Di-tertbutylimidazoliumchlorid
N
Cl
N
37
Formaldehyd (2.3 mL, 30 mmol) wird in Toluol (30 mL) gelöst und es wird tert-Butylamin (3.15 mL, 30 mmol) zugetropft. Man erhizt anschließend so lange, bis man eine klare Lösung erhält (50°C). Anschließend wird auf 0°C abgekühlt und eine zweite Portion tert-Butylamin (3.15 mL, 30 mmol) wird zugetropft, gefolgt von tropfenweiser Zugabe von HCl (9.99 mL, 3 M HCl, 30 mmol). Danach wird Glyoxal (3.45 mL, 30 mmol) ebenfalls tropfenweise zugegeben. Man lässt für 15 h bei 40°C rühren. Danach wird das Gemisch mit gesättigter NaHCO3-Lösung verdünnt (30 mL). Das Lösemittel wird unter vermindertem Druck entfernt (Koevaporation von Wasser auch mit Wasserabscheider möglich). Der Rückstand wird in Dichlormethan gelöst, über Na2SO4 getrocknet und das Lösemittel ebenfalls unter vermindertem Druck entfernt. Es wird aus Acetonitril mit kaltem Toluol gefällt, wobei ein Öl ausfällt. Bei erneuter Entfernung des Lösemittels unter vermindertem Druck erhält man ein braunes, stark hygrospkopisches Pulver (4.48 g, 69%).
37: C11H12N2Cl (216.14 g/mol): EA, ber. C, 60.95; H, 9.77; N, 12.92; gef. C, 58.08; H, 9.85; N, 12.1. ).- MS (ESI+, Acetonitrile): m/z = 181.03 [M-Cl]+. - 1H NMR (CDCl3, 250 MHz): δ = 10.37 (1H, s, N=CH-N), 7.60 (2H,s N-CH=CH-N), 1.69 (18H, s, N-C(CH3)3), – 13
C NMR (CDCl3, 63 MHz): δ = 137.5 (N=CH-N), 119.8 (N-CH=CH-N), 60.8 (N-C(CH3)3),
38.9 (N-C(CH3)3
169
Experimenteller Teil
N AuCl N
38a 37 (114.5 mg, 0.53 mmol) wird in wasserfreiem DMF (5 mL) gelöst. Dazu gibt man tropfenweise Li[N(SiMe3)2] (110 µL, 0.56 µmol). Man lässt 15 min bei RT rühren. Anschließend tropft man eine Lösung von DMS-AuCl (125 mg, 424 µmol) in DMF (10 mL) hinzu und rührt ü.N., wobei sich die Lösung schwarz-lila verfärbt. Das DMF wird am Ölpumpenvakuum entfernt. Der Rückstand wird in CH2Cl2 aufgenommen und durch Celite filtriert. Das Lösemittel wird unter vermindertem Druck entfernt. Es wird aus Aceton/Pentan bei 4°C umkristallisiert. Man erhält 38a als ein weißes Pulver (73 mg, 42%).
38a: C11H11AuCl ( 412.1 g/mol): EA, ber. C, 32.01; H, 4.88; N, 6.79; gef. C, 30.34; H, 5.72; N, 6.59. ). - MS (Fab, NBA): m/z = 181.03 [M-AuCl]+ (100%), 377.1 [M-Cl]+ (35), [NHCAu-NHC]+, (45). - 1H NMR (CD2Cl2, 250 MHz): δ = 7.13 (2H, s, N-CH=CH-N), 1.85 (18H, s, N-C(CH3)3), – 13C NMR (CD2Cl2, 63 MHz): δ = 168.5 (NCN), 117.0 (N-CH=CH-N), 59.3 (N-C(CH3)3), 32.0 (N-C(CH3)3.
170
Experimenteller Teil
N AuBr N
38b 38a (70 mg, 0.17 mmol) wird in Acetone (1 mL) gelöst und LiBr (124 mg, 1.44 mmol) wird dazugegeben. Man lässt für 24 h im Dunkeln rühren. Danach wird das Lösemittel unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wird in CH2Cl2 (2 mL) gelöst und über MgSO4 getrocknet. Die Salze werden duch eine kurze Kieslgelfiltration entfernt und das Lösemittel unter vermindertem Druck entfernt (Substanz nicht ausfällbar). Man erhält ein weißliches Öl (20 mg, 26%).
38b: C11H11AuBr (456.05 g/mol): 1H NMR (CD2Cl2, 250 MHz): δ = 7.14 (2H, s, N-CH=CHN), 1.86 (18H, s, N-C(CH3)3). –
13
C NMR (CD2Cl2, 63 MHz): δ = 172.3 (NCN), 116.9 (N-
CH=CH-N), 59.4 (N-C(CH3)3), 32.0 (N-C(CH3)3).
171
Experimenteller Teil
N AuBr3 N
38c
Zu einer Lösung von 38b (20 mg, 43.85 mol) in CH2Cl2 (2 mL) wird Brom dazugegeben (4 mg, 34.4 µmol). Man lässt die Reaktion für 3 h rühren und entfernt das Lösemittel zusammen mit dem überschüssigen Brom unter vermindertem Druck. Der Rückstand wird aus CH2Cl2/Pentan (1:5) bei -20°C umkristallisiert. Man erhält ein oranges Pulver (13 mg, 48%).
38c: C11H11AuBr3 ( 613.88 g/mol): EA, ber. C, 21.41; H, 3.27; N, 4.54; gef. C, 21.95; H, 3.64; N, 4.29. - 1H NMR (CD2Cl2, 250 MHz): δ = 7.50 (2H, s, N-CH=CH-N), 1.91 (18H, s, N-C(CH3)3). –
13
C NMR (CD2Cl2, 63 MHz): δ = 133.8 (NCN), 123.2 (N-CH=CH-N), 63.0
(N-C(CH3)3), 32.3 (N-C(CH3)3).
172
Experimenteller Teil
N AuCl N O
HN O
H3CO
39a In einem Schlenkkolben legt man 15c (258 mg, 0.09 mmol) und DMS-Au-Cl (54 mg, 0.18 mmol) vor und fügt wasserfreies Dichlormethan (20 mL) hinzu und rührt ü.N. im Dunkeln, wobei sich das Gemisch grau-violett verfärbt. Man filtriert durch Celite und entfernt das Lösemittel unter vermindertem Druck. Den weiß-grauen Rückstand kristallisiert man aus einer Mischung von Dichlormethan/Hexan bei - 20°C um. Nach Filtration erhält man 39a als ein weißes, lichtempfindliches Pulver (215 mg, 54%).
39a: C19H25AuClN3O3 (575.12 g/mol): EA, ber. C, 39.63; H, 4.38; N 7.30; gef. C, 39.9; H, 4.21; N, 7.34. - MS (Fab, NBA): m/z = 540.1 [M-Cl]+ (95%), 484.1 [M-Cl-tert-Butyl]+ (20%), 344.2 [M-AuCl]+ (100%) - 1H NMR (CD2Cl2, 250 MHz): δ = 7.36−7.08 (6Η, m, N-CH=CHN, CAr,PheH), 7.01 (1Η, d, 3J = 2.0 Hz, N-CH=CH-N), 6.44 (1H, d, 3J = 7.0 Hz, NHPhe), 4.95 (1H, d, 3J = 6.1 Hz, N-CH2-CO), 4.87-4.79 (1H, m, Cα,PheH), 3.72 (3H, s, CO2CH3), 3.12 (2H, ddd, 2J = 13.80 Hz, 3J = 5.8 Hz, Cβ,PheH), 1.82 (9H, s, N-C(CH3)3). – 13C NMR (CD2Cl2, 63 MHz): δ = 172.0 (CO2CH3), 171.4 (NCN), 165.8 (CONH), 136.3 (Cq,Phe), 129.9 (CAr,Phe), 129.2 (CAr,Phe), 127.6 (CAr,Phe), 122.7 (N-CH=CH-N), 119.5 (N-CH=CH-N), 59.7 (N-CH2CO), 55.4 N-C(CH3)3, 54.1 (Cα,Phe), 53.0 (CO2CH3), 38.2 (Cβ,Phe), 31.8 (N-C(CH3)3).
173
Experimenteller Teil
N AuBr N O
HN O
H3CO
39b
39a (215 mg, 0.37 mmol) wird in Acetone (1 mL) gelöst und LiBr (273 mg, 3.18 mmol) wird dazugegeben. Man lässt für 24 h im Dunkeln rühren. Danach wird das Lösemittel unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wird in CH2Cl2 (2 mL) gelöst und über MgSO4 getrocknet. Die Salze werden duch eine kurze Kieselgelfiltration entfernt und das Lösemittel unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wird aus CH2Cl2/Pentan bei - 20°C umkristallisiert. Man erhält 39b als ein weißes Pulver (70 mg, 30%).
39b: C19H25AuBrN3O3 (620.08 g/mol): EA, ber. C, 36.79; H, 4.06; N 6.77; gef. C, 36.11; H, 4.24; N 6.98. - MS (Fab, NBA): m/z = 540.0 [M-Br]+ (100%), 344.2 [M-AuBr]+ (30). - 1H NMR (CD2Cl2, 250 MHz): δ = 7.36−7.12 (6H, m, N-CH=CH-N, CAr,PheH), 7.05 (1Η, d, 3J = 2.1 Hz, N-CH=CH-N), 6.55 (1H, d, 3J = 7.0 Hz, NHPhe), 4.99 (1H, d, 3J = 1.9 Hz, N-CH2-CO), 4.88-4.81 (1H, m, Cα,PheH), 3.72 (3H, s, CO2CH3), 3.21-3.01 (2H, m, Cβ,PheH), 1.81 (9H, s, NC(CH3)3). –
13
C NMR (CD2Cl2, 63 MHz): δ = 175.1 (NCN), 172.0
(CO2CH3), 166.2
(CONH), 136.2 (Cq,Phe), 129.9 (CAr,Phe), 129.2 (CAr,Phe), 127.6 (CAr,Phe), 120.7 (N-CH=CH-N), 119.5 (N-CH=CH-N), 59.8 (N-CH2-CO), 55.3 (N-C(CH3)3), 54.1 (Cα,Phe), 53.1 (CO2CH3), 38.1 (Cβ,Phe), 31.9 (N-C(CH3)3).
174
Experimenteller Teil
N AuBr3 N O
HN O
H3CO
39c Zu einer Lösung von 39b (36 mg, 58 µmol) in CH2Cl2 (2 mL) wird Brom dazugegeben (11.2 mg, 69.7 µmol). Man lässt die Reaktion für 3 h rühren und entfernt das Lösemittel zusammen mit dem überschüssigen Brom unter vermindertem Druck. Der Rückstand wird aus CH2Cl2/Pentan (1:5) bei -20°C umkristallisiert. Man erhält ein oranges Pulver (41 mg, 90%).
39c: C19H25AuBr3N3O3 (776.91 g/mol): EA, ber. C, 29.25; H, 3.23; N, 5.39; gef. C, 28.72, H, 3.45; N, 6.00. - MS (Fab, NBA): m/z = 540.0 [M-Br3]+ (100%), 344.1 [M-AuBr]+ (20%). - 1H NMR (CD2Cl2, 250 MHz): δ = 7.40−7.14 (7Η, m, N-CH=CH-N, N-CH=CH-N, CAr,PheH), 6.62 (1H, d, 3J = 7.0 Hz, NHPhe), 5.09-4.87 (3H, q+m, N-CH2-CO, Cα,PheH), 3.74 (3H, s, CO2CH3), 3.22-3.01 (2H, m, Cβ,PheH), 1.85 (9H, s, N-C(CH3)3). –
13
C NMR (Acetonitril-d3,
63 MHz): δ = 172.1 (CO2CH3), 165.1 (CONH), 137.4 (Cq,Phe), 135.8 (NCN), 130.6 (CAr,Phe), 129.6 (CAr,Phe), 128.0 (CAr,Phe), 127.1 (N-CH=CH-N), 124.0 (N-CH=CH-N), 62.7 (N-CH2CO), 55.0 (N-C(CH3)3), 53.7 (Cα,Phe), 52.9 (CO2CH3), 38.3 (Cβ,Phe), 31.7 (N-C(CH3)3).
175
Experimenteller Teil
N AuCl N
40a
In einem Schlenkkolben legt man 13a (74 mg, 0.09 mmol) und DMS-AuCl (50 mg, 0.17 mmol) vor und fügt wasserfreies Dichlormethan (15 mL) hinzu und rührt ü.N. im Dunkeln. Man filtriert durch Celite und entfernt das Lösemittel unter vermindertem Druck. Den Rückstand kristallisiert man aus einer Mischung von Dichlormethan/Pentan bei - 20°C um. Nach Filtration erhält man 28 als ein weißes, lichtempfindliches Pulver (61 mg, 75%).
40a: C17H16N2AuCl (480.07 g/mol): EA, ber. C, 42.47; H, 3.35; N, 5.83; gef. C, 41.57; H, 3.53; N, 5.42. - MS (Fab, NBA): m/z = 445.0 [M-Cl]+. - 1H NMR (CD2Cl2, 250 MHz, 25°C): δ = 7.44-7.36 (6H, m, HAr), 7.29 (1H, s, N-CHPh2), 7.18-7.13 (4H, m, HAr), 6.97 (1H, d, 3J = 2.0 Hz, N-CH=CH-N), 6.83 (1H, d, 3J = 2.0 Hz, N-CH=CH-N), 3.85 (3H, s, N-CH3). – 13
C NMR (CD2Cl2, 63 MHz, 25°C): δ = 172.9 (NCN), 139.0 (Cq,Ar), 129.4 (CAr), 129.1 (CAr),
128.9 (CAr), 122.6 (N-CH=CH-N), 120.2 (N-CH=CH-N), 68.9 (N-CHPh2), 39.0 (N-CH3).
176
Experimenteller Teil
N AuBr N
40b 40a (35 mg, 73 µmol) wird in Acetone (1 mL) gelöst und LiBr (53 mg, 620 µmol) wird dazugegeben. Man lässt für 24 h im Dunkeln rühren. Danach wird das Lösemittel unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wird in CH2Cl2 (2 mL) gelöst und über MgSO4 getrocknet. Die Salze werden duch eine kurze Kieslgelfiltration entfernt und das Lösemittel unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wird aus CH2Cl2/Pentan bei -20°C umkristallisiert. Man erhält ein weißes Pulver (25 mg, 65%).
40b: C17H16AuBrN2 (x g/mol): EA, ber. C, 38.88; H, 3.07; N, 5.33; gef. C, 38.10; H, 3.24; N, 4.99. - MS (Fab, NBA): m/z = 693.1 [M+Carbene]+ (60%), 445.0 [M-Br]+ (25). - 1H NMR (CD2Cl2, 250 MHz): δ = 7.40- 7.35 (6Η, m, CΑrH), 7.30 (1H, s, NCH(Ph)2), 7.19-7.13 (4H, m, CΑrH), 6.97 (1H, d, 3J = 1.8 Hz, N-CH=CH-N), 6.83 (1H, d, 3J = 1.8 Hz, N-CH=CH-N), 3.85 (3H, s, N-CH3), –
13
C NMR (CD2Cl2, 63 MHz): δ = 176.3 (NCN), 138.8 (Cq,Phe), 129.4
(CAr,Phe), 129.1 (CAr,Phe), 128.9 (CAr,Phe), 122.5 (N-CH=CH-N), 120.2 (N-CH=CH-N), 68.5 (NCH(Ph)2), 49.0 (N-CH3).
177
Experimenteller Teil
N AuBr3 N
40c Zu einer Lösung von 40b (15 mg, 28.6 mol) in CH2Cl2 (2 mL) wird Brom dazugegeben (4 mg, 34.4 µmol). Man lässt die Reaktion für 3 h rühren und entfernt das Lösemittel zusammen mit dem überschüssigen Brom unter vermindertem Druck. Der Rückstand wird aus CH2Cl2/Pentan (1:5) bei -20°C umkristallisiert. Man erhält ein oranges Pulver (10 mg, 51%).
40c: C17H16AuBr3N2 (681.85 g/mol): EA, ber. C, 29.81; H, 2.35; N, 4.09; gef. C, 27.93; H, 2.37; N, 3.50. - MS (Fab, NBA): m/z = 445.0 [M-Br3]+. - 1H NMR (CD2Cl2, 250 MHz): δ = 7.44- 7.39 (6H, m, CΑrH), 7.28-18 (6H, m, NCH(Ph)2, CΑrH), 7.16 (1H, d, 3J = 2.0, N-CH=CH-N), 6.95 (1H, d, 3J = 2.0 Hz, N-CH=CH-N), 3.92 (3H, s, N-CH3). –
13
C NMR
(CD2Cl2, 63 MHz): δ = 141.3 (NCN), 137.0 (Cq,Phe), 129.6 (CAr,Phe), 129.6 (CAr,Phe), 129.3 (CAr,Phe), 125.3 (N-CH=CH-N), 1203.2 (N-CH=CH-N), 68.5 (N-CH(Ph)2), 38.9 (N-CH3).
178
Experimenteller Teil NHBoc HN
O O
HS O
41
Zu einer Lösung von Boc-Leucin Monohydrat (0.72 g, 2 mmol) in THF (30 mL) gibt man NMM (0.22 mL, 2 mmol), gefolgt von IBCF (0.26 mL, 10 mmol), wobei sich ein weißer Niederschlag bildet. In einem zweiten Kolben suspendiert man Cysteinethylester Hydrochlorid (0.37 g, 2 mmol) in THF (50 mL) mit NEt3 (0.28 mL, 2 mmol). Man vereinigt beide Kolben und lässt das Gemisch 2 h rühren. Der Niederschlag wird abfiltriert und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt. Das resultierende Öl wird in CHCl3 (50 mL) gelöst und mit H2O (50 mL) gewaschen. Die wässrige Phase wird mit CHCl3 (3 × 30 mL) zurückextrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden über Na2SO4 getrocknet und das Lösemittel unter vermindertem Druck entfernt. 41 wird aus THF/ Pentan umkristallisiert und man erhält ein weißes Pulver (0.58 g, 80%).
41: C16H30N2O5S (362.19 g/mol): EA, ber. C 53.01, H 8.34, N 7.73, S 8.85; gef. C 53.19, H 8.36, N 7.67, S 8.88. - MS (ESI+): m/z = 385.13 [M+Na]+ , 334.14 [M-C2H5]+, 307.10 [Mtert-Butyl]+. -1H NMR (DMSO-d6, 250 MHz): δ = 8.17 (1H, d, 3JH,H = 7.8 Hz, NHLeu), 6.93 (1H, td, 3JH,H = 8.2Hz, NHBoc), 4.55-4.39 (1H, m, Hα,Cys), 4.14-4.09 (3H, m, CO2-CH2-CH3, Hα,Leu), 2.91-2.65 (2H, m, Hβ,Cys), 1.68-1.52 (1H, m, Hγ,Leu), 1.43 (10H, s, Boc, SHCys), 1.30 (3H, t, 3JH,H = 7.1 Hz, CO2-CH2-CH3), 0.86 (6H, dd, 3JH,H = 6.4 Hz, 2JH,H = 4.1 Hz, Hδ,Leu). 13
C NMR (DMSO-d6, 63 MHz): δ = 172.9 (CO2Et), 170.1 (COLeu), 155.4 (COBoc), 78.1
(C(CH3)3), 60.9 (CO2-CH2-CH3), 54.0 (Cα,Cys), 52.4 (Cα,Leu), 40.6 (Cβ,Leu), 27.8 (C(CH3)3), 25.1 (Cβ,Cys), 24.0, 22.6 (Cδ,Leu), 21.3 (Cγ,Leu), 14.0 (CO2-CH2-CH3).
179
Experimenteller Teil
NHBoc
N Au S
HN
N
O O O
42 Zu einer Lösung von 39a (40 mg, 83 µmol) und 41 (31.5 mg, 87 µmol) in wasserfreien CH2Cl2 (5 mL) gibt man NEt3 (13 µL, 91.7 µmol) und lässt ü.N. rühren. Man filtriert durch Celite und entfernt das Lösemittel under vermindertem Druck. Der Rückstand wird aus CH2Cl2/Pentan (1:5) bei - 20°C umkristallisiert. Man erhält 42 als weißes Pulver (17 mg, 25%).
42: C33H45AuN4O5S (806.28 g/mol): EA, ber. C, 49.13; H, 5.62; N, 6.94; S, 3.97; gef. C, 45.7; H, 6.52; N, 7.32; S 3.06.- MS (Fab+): m/z = 693.2 [NHC2-Au]+ (85%), 830.3 [M+Na]+, 1251.2 [M+NHC-Au]+. - 1H NMR (CD2Cl2, 250 MHz): δ = 7.47-7.04 (13H, m, NCH(Ph)2, NHBoc, NHCys, N-CH(PH)2), 6.97 (1H, d, 3JH,H = 1.9 Hz, N-CH=CH-N), 6.81 (1H, d, 3JH,H = 1.9 Hz, N-CH=CH-N), 4.61-4.50 (1H, m, Cα,CysH), 4.22-3.97 (3H, m, Cα,LeuH, CO2-CH2CH3), 3.84 (3H, s, N-CH3), 3.35-3.12 (2H, m, Cβ,CysH), 1.75-1.56 (3H, m, Cγ,LeuH, Cβ,LeuH), 1.40 (9H, s, C(CH3)3), 1.36 (3H, t, 3JH,H = 7.3 Hz, CO2-CH2-CH3), 0.88 (6H, dd, 3JH,H = 6.1 Hz, 2JH,H = 10.5 Hz, Cδ,LeuH). –
13
C NMR (CD2Cl2, 63 MHz): δ = 185.1 (NCN), 172.1
(CO2Et), 171.0 (COLeu), 155.3 (COBoc), 138.8 (Cq,Ar), 129.9 (CAr), 128.9 (CAr), 128.3 (CAr), 122.2 (N-CH=CH-N), 119.6 (N-CH=CH-N), 79.4 (C(CH3)3), 68.3 (CH(Phe)2), 68.0 (CO2CH2-CH3), 55.0 (Cβ,Cys), 45.8 (Cα,Cys), 42.3 (Cα,Leu), 38.2 (N-CH3), 28.1 (C(CH3)3), 24.7 (Cβ,Leu), 22.9 (Cδ,Leu), 21.8 (Cγ,Leu), 14.1 (CO2-CH2-CH3).
180
Experimenteller Teil
N Au S
NHBoc
N OH O
43
Zu einer Lösung von 39a (40 mg, 83 µmol) und Boc-Cystein (18.4 mg, 87 µmol) in wasserfreien CH2Cl2 (5 mL) gibt man NEt3 (13 µL, 91.7 µmol) und lässt ü.N. rühren. Man filtriert durch Celite und entfernt das Lösemittel under vermindetem Druck. Der Rückstand wird aus CH2Cl2/Pentan (1:5) bei .-20°C umkristallisiert. Man erhält 43 als weißes Pulver (33 mg, 60%).
43: C25H30AuN3O4S (665.16 g/mol): EA, ber. C, 45.12; H, 4.54; N, 6.31; S, 4.82; gef. C, 46.02; H, 5.89; N, 6.62; S, 3.84. - MS (ESI-, Acetonitril): m/z = 664.03 [M-H]-. -1H NMR (CD2Cl2, 250 MHz): δ = 7.41- 6.76 (15H, m, NCH(Ph)2, NHBoc, NHCys, N-CH(PH)2, NCH=CH-N, N-CH=CH-N), 4.40-4.26 (1H, m, Cα,CysH), 3.86 (2H, m, Cβ,CysH), 3.04 (3H, s, NCH3), 1.37 (9H, s, C(CH3)3). -
13
C NMR (CD2Cl2,, 63 MHz): δ = 185.4 (NCN), 174.1
(CO2H), 155.8 (COBoc), 139.1 (Cq,Ar), 129.5 (CAr), 129.3 (CAr), 128.7 (CAr), 122.6 (NCH=CH-N), 120.0 (N-CH=CH-N), 79.3 (C(CH3)3), 68.36 (CH(Phe)2), 57.6 (Cβ,Cys), 46.2 (Cα,Cys), 38.7 (N-CH3), 28.6 (C(CH3)3).
181
Experimenteller Teil
N AuCl N NH
O
O HN OCH3 O
44 Zu einer Lösung von 17 (100 mg, 0.19 mmol) in wasserfreiem Dichlormethan (20 mL) über 4 Å MS gibt man Ag2O (21.4 mg, 0.093 mmol) und lässt ü.N. im Dunkeln schwenken. Man filtriert durch Celite und kristallisiert aus einer Mischung Dichlormethan / Pentan bei 4°C um. Nach Filtration erhält man das Silbercarben als ein weißes, lichtempfindliches Pulver (60 mg, 49%). Das Silbercarben wird direkt mit DMS-AuCl (27 mg, 90 µmol) in wasserfreiem CH2Cl2 (15 mL) für 24 h gerührt. Nach Filtration durch Celite wird das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt und der Rückstand aus CH2Cl2 /Pentan (10 mL/30 mL) bei – 20°C ausgefällt. Das Rohprodukt wird säulenchromatographisch (SiO2, CH2Cl2/MeOH, 10:1) aufgereinigt. Man erhält nach erneuter Kristallisation 44 als ein weißes Pulver (40 mg, 65%). 44: C25H36AuClN4O4 (688.21 g/mol): EA, ber. C, 43.85; H, 5.27; N, 8.31; gef. C, 43.54; H, 5.54; N ,7.80. ). - MS (Fab, NBA): m/z = 653.4 [M-Cl]+ (100%), 711.3 [M+Na]+ (25). - 1H NMR (CD2Cl2, 250 MHz): δ = 7.32-7.11 (7Η, m, N-CH=CH-N, N-CH=CH-N, CAr,PheH), 7.00 (1H, d, 3J = 7.8 Hz, NHLeu), 6.63 (1H, d, 3J = 7.1 Hz, NHPhe), 4.94 (2H, d, 2JH,H = 4.9 Hz, N-CH2-CO), 4.80 (1H, dd, 3J = 7.1 Hz, 2J = 14.0 Hz, Cα,PheH), 4.41 (1H, dd, 3J = 7.8 Hz, 2J = 14.6 Hz, Cα,LeuH), 3.67 (3H, s, CO2CH3), 3.19-2.99 (2H, m, Cβ,PheH), 1.82 (9H, s, N(C(CH3)3), 1.69-1.50 (3H, m, Cγ,LeuH, Cβ,LeuH), 0.88 (6H, dd, 3J = 8.6 Hz, 2J = 6.63 Hz, Cδ,LeuH). -
13
C NMR (CD2Cl2, 63 MHz): δ = 172.1 (CO2CH3), 171.7 (N-CH2-CO), 171.2
(NCN), 166.5 (CONH), 136.7 (Cq,Phe), 129.9 (CAr,Phe), 129.0 (CAr,Phe), 127.5 (CAr,Phe), 121.0 (N-CH=CH-N), 119.3 (N-CH=CH-N), 59.7(N-C(CH3)3), 59.2 (N-CH2-CO), 53.91 (Cα,Phe), 52.7 (CO2CH3, Cα,Leu), 41.5 (Cβ,Leu), 31.9 (Cβ,Phe), 31.9 (N-C(CH3)3), 25.2 (Cγ,Leu), 23.2, 22.4 (Cδ,Leu).
182
Experimenteller Teil
N AuBr3 N NH
O
O HN OCH3 O
45
44 (40 mg, 58 µmol) wird in Acetone (1 mL) gelöst und LiBr (42 mg, 494 µmol) wird dazugegeben. Man lässt für 24 h im Dunkeln rühren. Danach wird das Lösemittel unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wird in CH2Cl2 (2 mL) gelöst und über MgSO4 getrocknet. Die Salze werden duch eine kurze Silicasäule entfernt und das Lösemittel unter vermindertem Druck entfernt. Zum NHC-Au Bromid (18 mg, 29 µmol) in CH2Cl2 (2 mL) wird Brom dazugegeben (4 mg, 34.4 µmol). Man lässt die Reaktion für 3 h rühren und entfernt das Lösemittel zusammen mit dem überschüssigen Brom unter vermindertem Druck. Der Rückstand wird aus CH2Cl2 /Pentan (1:5) bei -20°C umkristallisiert. Man erhält 45 als ein oranges Pulver (20 mg, 38%).
45: C25H36AuBr3N4O4 (890 g/mol): EA, ber. C, 33.61; H, 4.06; N, 6.27; gef. C, 34.1; H, 3.54; N, 5.30. - MS (ESI-, Acetonitril): m/z = 971.22 [M+Br]-. - 1H NMR (CD2Cl2, 250 MHz): δ = 7.62-7.05 (8Η, m, N-CH-CH-N, N-CH=CH-N, CAr,PheH, NHLeu), 6.74 (1H, d, 3J = 7.0 Hz, NHPhe), 5.13 (2H, s, N-CH2-CO), 4.82 (1H, dd, 3J = 7.0 Hz, 2J = 13.0Hz, Cα,PheH), 4.39 (1H, dd, 3J = 6.5 Hz, 2J = 12.8 Hz, Cα,LeuH), 3.72 (3H, s, CO2CH3), 3.25-3.07 (2H, m, Cβ,PheH), 1.85 (9H, s, N-(C(CH3)3), 1.64-1.44 (3H, m, Cγ,LeuH, Cβ,LeuH), 0.850 (6H, ps-tr., Cδ,LeuH).-
13
C NMR (CD2Cl2, 63 MHz): δ = 172.6 (CO2CH3), 172.3 (N-CH2-CO), 165.5
(CONH), 137.9 (NCN), 136.5 (Cq,Phe), 129.9 (CAr,Phe), 129.2 (CAr,Phe), 127.7 (CAr,Phe), 125.9 (N-CH=CH-N), 123.4 (N-CH=CH-N), 62.5 (N-C(CH3)3), 54.6 (N-CH2-CO), 54.2 (Cα,Phe), 53.8 (CO2CH3), 53.4 (Cα,Leu), 41.4 (Cβ,Leu), 37.7 (Cβ,Phe), 31.9 (N-C(CH3)3), 25.2 (Cγ,Leu), 23.2, 22.5 (Cδ,Leu).
183
Experimenteller Teil Kristallographische Daten
Verbindung
31a
24d
Summenformel
C16H24ClN2O2Rh
C23H29Cl2IN2Ru
Molekulargewicht
414.73
632.35
Kristalldimensionen [mm]
0.2 × 0.2 ×0.1
0.1 × 0.1 × 0.2
ρ ber [g/ cm-3]
1.611
1.230
Kristallsystem
triklin
monoklin
Raumgruppe
P1
P21/c
a [Å]
7.497(4)
9.458(2)
b [Å]
9.870(5)
29.665(7)
c [Å]
12.608(7)
12.815(3)
α [°]
95.71(1)
90
β [°]
98.29(1)
108.233(6)
γ [°]
110.26(1)
90
V [Å3]
854.7(8)
3415.0(14)
Z
2
4
Absorptionskoeffizient µ [mm-1]
1.163
1.528
Diffraktometer
Bruker AXS
Bruker AXS
Strahlung
Moα
Moα
Meßtemperatur [K]
213
213(2)
Mepbereich [°]
1.65-25.00
1.81-25.00
Anzahl der gemessenen Reflexe
4802
26577
Anzahl der unabhängigen Reflexe
2948
5999
Anzahl der verfeinertern Parameter
199
263
R-Wert
0.0658
0.0857
GOOF
1.102
0.924
Methode der Verfeinerung
Full-matrix least-square on F2
184
Experimenteller Teil Verbindung
33
40c
Summenformel
C15H22Cl2N2Ru
C17H16AuBr3N2
Molekulargewicht
402.02
681.85
Kristalldimensionen [mm]
0.2 × 0.1 × 0.1
?
ρ ber [g/ cm-3]
1.662
1.883
Kristallsystem
monoklin
monoklin
Raumgruppe
P21/c
P21/n
a [Å]
16.801(12)
9.6826(5)
b [Å]
7.690(6)
12.2416(4)
c [Å]
12.536(9)
20.3950(8)
α [°]
90
90
β [°]
96.946(6)
91.488(4)
γ [°]
90
90
V [Å3]
1607.77
2416.61
Z
2
4
Absorptionskoeffizient µ [mm-1]
1.30
11.05
Diffraktometer
Bruker AXS
Oxford Excalibur II
Strahlung
Moα
Moα
Meßtemperatur [K]
213
193
Mepbereich [°]
?
?
Anzahl der gemessenen Reflexe
8785
14456
Anzahl der unabhängigen Reflexe
2824
4284
Anzahl der verfeinertern Parameter
181
208
R-Wert
0.057
0.062
GOOF
0.976
0.825
Methode der Verfeinerung
Full-matrix least-square on F2
185
Experimenteller Teil Verbindung
39c
Summenformel
C19H25AuBr3N3O3
Molekulargewicht
780.09
Kristalldimensionen [mm]
?
ρ ber [g/ cm-3]
2.115
Kristallsystem
monoklin
Raumgruppe
P21
a [Å]
8.4520(37)
b [Å]
9.2123(41)
c [Å]
15.7560(67)
α [°]
90
β [°]
92.894(9)
γ [°]
90
V [Å3]
1225.23
Z
2
Absorptionskoeffizient µ [mm-1]
10.92
Diffraktometer
Bruker AXS
Strahlung
Moα
Meßtemperatur [K]
213
Mepbereich [°]
?
Anzahl der gemessenen Reflexe
6753
Anzahl der unabhängigen Reflexe
3852
Anzahl der verfeinertern Parameter
262
R-Wert
0.0497
GOOF
1.085
Flack- Parameter
0.0033 (188)
Methode der Verfeinerung
Full-matrix least-square on F2
186
Literatur
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188
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192
Anhang
11. Anhang
11.1 Verzeichnis der im Rahmen dieser Arbeit erstmalig hergestellten Verbindungen (Angabe des Laborbuchkürzels unter vergebener Strukturnummer)
Nr.
Strukturformel
1
Strukturformel
6a
jl148
jl101 CO2H
F
O F N
Br N F
O Br
N
F
F
6b
Nr.
6c Br
N
N
Br
F
N
jl021
F
jl151
F
O
CO2CH3
F F
O
7a
7b N
N Br
jl033
N
jl287
Br
N F O
CO2CH3
O Br
8a jl072
N
F F
F
I
8b jl156
N
I
I N CH3
N CH3
9a
9b
N
N Br
jl133
F
Br
N
N
jl132 Br I
193
Anhang CH3 N Br
11a
N
jl308
11b N
O
Br
N
jl311
O
O
O
CH3 N Br
15a
N
15b O
jl184
jl329
N Br
HN
N
OCH3
O
O
HN OCH3 O
15c
16c O O
Br NH
jl333
AgBr
O
O
jl423
Br
N
N
N H
Ag N
N
O
H N
OCH3
O
HN
O
O O
17
18 O N
jl424
N Br
N Br H N
N H
N
O
jl199
OCH3
H N
O
O N H
O
19
O
O
20a
N Br
S
N
jl217
H N O
20b
H N
O
H N
N H
S
O
N H
NH2
j465
O
NH CO2CH3
NH
j464
O N Boc NH
O
21a
O N Boc NH
O
Br N
jl469
S O
HN Boc NH
NH
H3CO2C CO2CH3
194
N H
OH O
Anhang 21b
22
Br
Br
S
N
jl468
jl085
O
N OC CO W CO N OC CO CH3
NH
Boc NH
O HN
H3CO2C
23a
23b N
N
Rh
Rh N
jl042
N
jl213
Cl
Cl F
F
O
F
CO2CH3 O
24a
F
F
24b N
N Ru
N
jl265
Ru Cl
Cl
N
jl214
Cl
F Cl
F
F
O
F F
O
H3CO2C
24c
24d N
N
Ru
Ru
jl298
N
Cl Cl
F
F
O O
N
jl155
Cl
Cl
F F
I
F
25
26 N Rh
N
jl450
N
F
Cl
Cl F
F
Ru
jl492
N
F
O
O
F
O
Cl
HN O
H3CO
27a
27b
jl487
jl473
Boc HN
O
N H
O
H3CO O
N
H3CO
Boc HN
Rh S Cl Cl
195
N H
N Ru
O
S
Cl
Cl
Cl
Anhang
28a
O H3CO
N N H
O
jl486
28b
Boc HN
H N
S Cl
29
N Ru
N H
O
jl472
Cl
Boc HN
H N
H3CO
Rh O
O
S Cl
O
Cl
30 N
N Ru
N
Cl
jl230
Cl O
H N O
jl470
O
H N
N H
N H
O
N
Rh Cl
Cl
OH
O
H N
N H
O
O
31a
OCH3 O
31b O O
O
jl310
jl313
N
O
N
N N
Rh Cl
O
32a
Rh Cl
O
32b O
O
N
N
jl309
jl312
Ru N
Cl
Ru N
Cl
Cl
Cl
34b
34a N
N Ru
N
jl367
Cl
35
Cl
jl366
36
Br
N
jl321
N Ag
N
Rh Cl
N
Br
Br
N
jl324
N
N AgBr
Br
Br
196
N Au N
Cl
Anhang 39b
39a N
N AuCl
jl341
AuBr
jl344
N
N
HN
O
O
HN O
O H3CO
H3CO
39c
40b N AuBr3
jl351
N
jl388 N
HN
O
AuBr
O
N
H3CO
40c
42 N
jl391
jl481
AuBr3 N
NHBoc
N Au S
HN
N
O O O
43
44 N AuCl
N
jl453
Au S
NHBoc
jl431
N
N
NH OH
O
O
O
HN OCH3 O
45 N AuBr3
jl471
N NH
O
O HN OCH3 O
197
Anhang
11.2 HPLC- Spektren Verbindung 29:
Verbindung 19:
198
Anhang Verbindung 18:
11.3 Massenspektren
Verbindung 29:
199
Anhang Verbindung 18:
Intens. x10
8
591.22
[M-Br-]+ 1.5
1.0
0.5
305.96
510.47 0.0 200
400
600
800
1000
1200
1400
Verbindung 19: Intens. 8 x10
4
590.27
[M-Br]+ 3
2
1
200
400
600
800
1000
1200
1400
200
1600
1800
m/z
m/z
