Aus der Abteilung Neuropathologie des Pathologischen Instituts der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg/Br.

Die Expression und Lokalisation von Matrix Metalloproteinasen (MMP) und ihrer spezifischen endogenen Inhibitoren (TIMP) in menschlichen primären Gehirntumoren

INAUGURAL - DISSERTATION zur Erlangung des Medizinischen Doktorgrades der Medizinischen Fakultät der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg i.Br.

Vorgelegt 2001 von Klaus B. J. Lampert geboren in Bühl/Baden

Dekan:

Prof. Dr. M. Schumacher

1. Gutachter:

Prof. Dr. B. Volk

2. Gutachter:

Prof. Dr. H.H. Peter

Jahr der Promotion:

2003

Auszüge aus dieser Arbeit wurden veröffentlicht: Lampert, K., Machein, U., Machein, M.R., Conca, W., Peter, H.H. and Volk, B. (1998) Expression of matrix metalloproteinases and their tissue inhibitors in human brain tumors. American Journal of Pathology 153, 429-437.

Der Weisheit Anfang ist die Furcht des HERRN, und die Erkenntnis des Heiligen ist Verstand

Buch der Sprüche 9, 10

Inhaltsverzeichnis Einleitung .........................................................................................................................1 Matrix Metalloproteinasen und TIMP .....................................................................2 Gehirntumoren .........................................................................................................6 Material und Methoden ................................................................................................10 Auswahlkriterien....................................................................................................10 Gewebeaufbereitung ..............................................................................................11 RNA-Extraktion.....................................................................................................11 Northern blot Analyse............................................................................................13 PCR........................................................................................................................14 Zymographie..........................................................................................................16 Immunhistochemie.................................................................................................17 Ergebnisse ......................................................................................................................19 Northern blot Analyse............................................................................................19 PCR........................................................................................................................25 Zymographie..........................................................................................................25 Immunhistochemie.................................................................................................29 Diskussion ......................................................................................................................37 Mt-MMP und Gelatinase A ...................................................................................38 Gelatinase B...........................................................................................................41 Aktivierung der Gelatinasen ..................................................................................42 Andere MMP .........................................................................................................43 TIMP......................................................................................................................45 Besonderheiten bei Medulloblastomen..................................................................47 Zusammenfassung.........................................................................................................49 Literaturverzeichnis......................................................................................................50

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Einleitung

Gehirntumoren sind die dritthäufigste Todesursache bei Krebserkrankungen Männern mittleren Alters und die zweithäufigste Todesursache bei Krebserkrankungen von Kindern. Bei Erwachsenen sind maligne Gliome die häufigsten primären Gehirntumoren, während bei Kindern Medulloblastome, die zu der Entität der Primitiven Neuroektodermale Tumoren (PNET) gehören, für ungefähr 30% der zentralnervösen Neoplasien verantwortlich sind. Die meisten primären Gehirntumoren metastasieren nicht systemisch, breiten sich jedoch lokal aus, entweder durch die Infiltration von Tumorzellen in normales Gehirngewebe oder seltener durch liquorgene Disseminierung entlang der Neuroaxis. Die lokale Invasivität ist charakteristisch für Gliome und trägt substantiell zum Versagen kurativer Therapien bei. Schon niedriggradige zerebrale Gliome sind infiltrativ und maligne Gliome sind hochgradig invasiv. Die Aussaat von Tumorzellen in die Neuroaxis ist ein verbreitetes Merkmal der PNET, wobei Fernmetastasen in ungefähr 15% der Fälle gefunden werden. Aus diesen Gründen ist die vollständige chiurgische Entfernung von Gehirntumoren schwierig, und fokale Therapien oft erfolglos. Rezidive treten nicht nur an der Primärlokalisation auf, sondern auch entfernt davon. Somit ist das Verständnis der Invasionsmechanismen der Tumoren im Gehirn von großer Bedeutung bei der Entwicklung neuer Strategien, das lokale Tumorwachstum zu kontrollieren. Das Verständnis des Tumorinvasionsprozesses mehrte sich durch eine zunehmende Erforschung der Schlüsselrollen der extrazellulären Matrix, der Zelladhäsionsmoleküle und der Proteasen. Zwei Familien von Proteasen wurden mit dem Prozeß der Tumorinvasion in Verbindung gebracht: Die Serinproteasen und die Matrix Metalloproteinasen (MMP) (Liotta et al. 1980; Matrisian, 1992; Birkedal-Hansen et al. 1993; Stetler-Stevenson et al. 1993; Behrendtsen und Werb, 1997). MMP sind eine Familie strukturell verwandter Enzyme, die Makromoleküle der extrazellulären Matrix degradieren. Die Genfamilie der humanen MMP umfaßt mindestens 19 Mitglieder. Sie werden in vier verschiedene Klassen eingeteilt, entweder auf Grundlage ihrer Domänen-Struktur und bevorzugten Substrate (z.B. Kollagenasen, Gelatinasen), oder durch ihre transmembrane Lokalisation, wie die Klasse membranständiger MMP (mt-MMP)

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(Woessner und Nagase, 2000). Mit Ausnahme von Stromelysin 3 werden alle freien MMP als inaktive Proenzyme sezerniert, die eine enzymatische Abspaltung der Propeptiddomäne zur Aktivierung benötigen (Stetler-Stevenson et al. 1993; Woessner, 1994). Nach Sekretion und Aktivierung, werden sie von einer Familie endogener Inhibitoren, den Tissue Inhibitors of Metalloproteinases (TIMP) inhibiert (Woessner, 1991; Greene et al. 1996). Die Balance zwischen den Mengen an aktivierten MMP und freien Inhibitoren bestimmt die effektive MMP-Aktivität (Mohanam et al. 1995). Die Homöostase dieses kritischen Equilibriums ist essentiell, da ein gestörtes Verhältnis von MMP zu TIMP den invasiven Prozeß beeinflußt. Verminderte TIMP-Genexpression resultiert in vermehrte Tumorinvasivität während Überexpression in vivo zu reduziertem invasivem Wachstum führt.

Matrix Metalloproteinasen (MMP) und „Tissue Inhibitors of Metalloproteinases“ (TIMP)

Erstbeschreiber einer MMP, einer Kollagenase, waren 1962 Gross und Lapiere (Gross und Lapière, 1962). Sie zeigten, daß Hautzellen aus dem Schwanz einer Kaulquappe in Metamorphose zum Frosch, eingebracht in ein Kollagen-Gel, die Kollagen-Tripelhelix degradierten. Schon lange vorher war bekannt, daß in vielen pathologischen Prozessen (z.B. Krebs, Arthritis, Dekubitus), aber auch in physiologischen Situationen (z.B. Embryogenese, postpartale Unterusinvolution, Knochenumbau) ein schneller Abbau von Bindegewebe stattfindet.

Dieser

ersten

Veröffentlichung

folgte

eine

rasante

Entwicklung

des

Forschungsgebietes, so daß es heute mehr als 10.000 Veröffentlichungen zum Thema Matrix Metalloproteinasen gibt, mit ungefähr 1.000 Neuerscheinungen pro Jahr. Eine einheitliche Nomenklatur wurde 1992 auf einer Konferenz in Destin Beach entwickelt (Woessner und Nagase, 2000). Klassischerweise wird die Zugehörigkeit zur Familie der MMP durch folgende Kriterien festgelegt (Nagase et al. 1992): 1. Blockierung durch Chelatoren 2. Aktivierung latenter Formen durch organische Quecksilberverbindungen 3. Inhibierung durch TIMP 4. Degradierung mindestens einer der Komponenten der extrazellulären Matrix

3

Später zeigte sich, daß das erste Merkmal zu breit formuliert war und das zweite und vierte nicht für alle MMP galt, so daß nur die Inhibierung durch TIMP blieb. Das derzeitig beste Kriterium wäre die Sequenzähnlichkeit aufgrund evolutionärer Verwandtschaft (Woessner und Nagase, 2000). Kollagenase 1 (MMP-1) wurde als solche erstmals 1966 von Fullmer und Gibson in menschlichem Zahnfleisch beschrieben (Fullmer und Gibson, 1966) und 1970 von Bauer, Eisen und Jeffrey aus menschlicher Haut aufgereinigt (Bauer et al.

1970). 1986

veröffentlichten Goldberg et al. die humane cDNA-Sequenz (Goldberg et al.

1986).

Synonyme: Fibroblasten-Kollagenase, Interstitielle Kollagenase. Lazarus et al. berichteten 1968 als erste über Kollagenase-Aktivität in humanen Neutrophilen Granulozyten (Lazarus et al.

1968): Kollagenase 2 (MMP-8), Synonym: Neutrophilen-

Kollagenase. Kollagenase 3 (MMP-13) wurde 1976 von Weeks, Halme und Woessner aus Ratten-Uterus in Involution extrahiert (Weeks et al. 1976). Synonym: Interstitielle Kollagenase der Ratte. Harris und Krane beobachteten 1972 in rheumatoidem Synovia-Gewebe Gelatinase-Aktivität (Harris und Krane, 1972). Das war, retrospektiv, Gelatinase A (MMP-2). 1979 fanden Liotta et al. das gleiche Enzym im Tumor einer Maus, welches Kollagen Typ IV der Basalmembran abbaute (Liotta et al. 1979). Das führte zu der frühen Bezeichnung des Enzyms als Typ IV Kollagenase. Ein anderes Synonym ist 72 kDa Gelatinase. Eine Gelatinase aus humanen polymorphnukleären Leukozyten wurde 1974 von Sopata und Dancewicz beschrieben (Sopata und Dancewicz, 1974): Gelatinase B (MMP-9). Ein gleiches Enzym, das Kollagen Typ V degradieren kann, wurde in Kaninchen-Makrophagen gefunden (Mainardi et al. 1980), daher der frühere Name Typ V Kollagenase. Sein Molekulargewicht von 92.000 Dalton führte zu dem anderen Namen 92 kDa Gelatinase. TIMP-1 bildet mit Pro-MMP-9 einen Komplex, der die Aktivierung und nachfolgende Aktivität des Enzyms reguliert (Goldberg et al. 1992). Humane Gelatinase B ist gewöhnlich über intermolekulare Disulfidbrücken mit Lipocalin zu einem Komplex verbunden (Kjeldsen et al. 1993). Dieses 95 kDa gelatinebindende Protein wurde in einigen Veröffentlichungen irrtümlicherweise als MMP-9 bezeichnet. Stromelysin 1 (MMP-3) wurde 1974 von Werb und Reynolds in Fibroblasten-Kulturen aus Kaninchenknochen entdeckt (Werb und Reynolds, 1974). Sie nannten es damals Proteoglykanase; der spätere Name Stromelysin kommt von Chin et al. (Chin et al. 1985). Weitere Synonyme sind Transin und Kollagenase-aktivierendes Protein (CAP).

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Stromelysin 2 (MMP-10) war die erste MMP, die durch Konierung und Sequenzierung entdeckt wurde (Breathnach et al. 1987). Stromelysin 2 kann latente Kollagenase 1 aktivieren (Nicholson et al.

1989). Aktivität konnte v.a. in Tumoren von Kopf, Hals und Lunge

nachgewiesen werden (Muller et al. 1991). Synonym: Transin 2. Basset et al. entdeckten 1990 Stromelysin 3 (MMP-11) (Basset et al. 1990). Pei et al. zeigten dann, daß Stromelysin 3 α1-Proteinase Inhibitor und α2-Makroglobulin degradiert und daß es intrazellulär aktiviert wird (Pei et al. 1994; Pei und Weiss, 1995). Matrilysin (MMP-7) ist die kleinste MMP. Sie wurde 1980 von Sellers und Woessner gefunden, die eigentlich nach Stromelysin im postpartalen Ratten-Uterus fahndeten (Sellers and Woessner, 1980). 1988 wurde die humane Form kloniert, sequenziert und pump-1 für „putative metalloproteinase-1“ benannt (Muller et al. 1988). Später zeigte sich, daß es sich nicht nur um eine „vermutliche“, sondern eine tatsächliche MMP handelt. Matrilysin wurde auch aus einer humanen Karzinom-Zellline gereinigt und Matrin genannt (Miyazaki et al. 1990). Metalloelastase (MMP-12) wurde 1975 von Werb und Gordon aus stimulierten MausMakrophagen gewonnen. Synonym: Makrophagen-Elastase (Werb und Gordon, 1975). Die Sequenz von RASI – „rheumatoid arthritis synovial inflammation“ (MMP-19) wurde 1996 von Cossins et al. veröffentlicht (Cossins et al. 1996). 1994 wurde von Sato et al. eine neuartige MMP mit einer transmembranen Domäne kloniert und sequenziert: Membrane-type matrix metalloproteinase 1 – mt1-MMP (MMP-14) (Sato et al. 1994). Diese Zelloberflächen-Proteinase kann ProMMP-2 aktivieren (Atkinson et al. 1995). Mt2-MMP (MMP-15) wurde 1995 von Will und Hinzmann entdeckt (Will und Hinzmann, 1995), mt3-MMP (MMP-16) ebenfalls 1995 von Takino et al. (Takino et al. 1995), mt4MMP (MMP-17) 1996 von Puente et al. (Puente et al. 1996), mt5-MMP 1999 von Llano et al. (Llano et al. 1999) und mt6-MMP 2000 von Velasco et al. (Velasco et al. 2000). Neben Kollagen und dessen Abbauprodukt Gelatine degradieren MMP auch andere Bindegewebs-Proteine, wie z.B. Fibronectin, Vitronectin, Laminin, Entactin, Tenascin, Aggrecan, Myelin und auch regulatorische Proteine wie z.B. α2-Makroglogulin, Ovostatin, α1-PI, IL-1α, IL-1β, ProTNFalpha, IGFBP-3, Substanz P, T Kininogen (Woessner und Nagase, 2000). Die einzelnen MMP unterscheiden sich sich in ihrem Substrat-Profil, d.h. in der Affinität bestimmter Substrate.

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TIMP wurden erstmals 1975 identifiziert (Bauer et al. 1975), seither wurden vier genetisch verschiedene Typen charakterisiert. TIMP haben mehrere Funktionen: Erstens, wie der Name schon sagt, inhibieren sie MMP; und zwar inhibieren TIMP 1-3 alle MMP, TIMP-4 zumindest MMP 1,2,3,7,9. In der Bindungsaffinität der TIMP zu den jeweiligen MMP bestehen Unterschiede. Zweitens nehmen sie durch Komplexbildung mit den Gelatinasen Einfluß auf die Aktivierung derselben: TIMP-1 bildet einen Komplex mit ProMMP-9 und TIMP-2 bildet einen Komplex mit ProMMP-2. Immer mehr kristallisieren sich auch Proteinase-unabhängige Funktionen wie z.B. als Wachstumsfaktoren und bei der Steroidgenese heraus. Somit besteht ein wachsendes wissenschaftliches Interesssen an den TIMP: Von den ca. 1.000 Veröffentlichungen, die jedes Jahr auf dem Gebiet der Matrix Metalloproteinasen erscheinen, behandeln etwa 25% die TIMP. Als die Aminosäuresequenz von TIMP-1 1985, 10 Jahre nach der Erstbeschreibung durch Bauer et al., bestimmt wurde, war man überrascht, daß das Protein in einem ganz anderen Kontext bereits bekannt war: Als „erythroid potentiating factor“ (Docherty et al. 1985). Danach mehrten sich die Hinweise, daß TIMP tatsächlich auch als Wachstumsfaktor wirkt. 1987 wurde aus mit Phorbolester stimulierten Mauszellen ein „tumour promoting factor“ TPA-S1 gewonnen, dessen Sequenz wiederum mit TIMP-1 übereinstimmte (Johnson et al. 1987). Ein weiteres Merkmal von TIMP-1 ist seine Fähigkeit, an die Hämopexin-Domäne von proMMP-9 zu binden und dadurch die Aktivierung und Funktion der Gelatinase B zu regulieren (Wilhelm et al. 1989). TIMP-2 wurde zuerst 1986 von Herron et al. beschrieben (Herron et al. 1986). Goldberg et al. bemerkten, daß TIMP-2 und proMMP-2, ähnlich wie TIMP-1 und proMMP-9, einen nichtkovalenten Komplex bilden (Goldberg et al. 1989). Dieser Komplex könnte bei der Aktivierung von proMMP-2 durch mt1-MMP an der Zelloberfläche eine regulierende Rolle spielen (Strongin et al. 1995). TIMP-3 wurde 1983 von Blenis und Hawkes in Hühnerembryo-Fibroblasten entdeckt (Blenis and Hawkes, 1983). Als TIMP-3 wurde es aber erst später bezeichnet, anfangs nannte man es ChiMP-3 (Pavloff et al. 1992). Humane TIMP-4 wurde 1996 von Greene et al. durch Klonierung entdeckt (Greene et al. 1996). Es bindet, wie TIMP-2, an proMMP-2 (Bigg et al. 1997).

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Gehirntumoren

Malignität bezeichnet die Neigung eines Krankheitsprozesses, fortzuschreiten, zerstörend zu wirken und zum Tode zu führen. Histologisch-zytologische Charakteristika der Malignität von Tumoren sind: Schnelles, infiltratives und destruktives Wachstum, Rezidive und Fernmetastasen, vermehrte und pathologische Mitosen, Zell- und Kernpolymorphie und -hyperchromasie, Verlust der normalen Kern- Zytoplasma-Relation, Anaplasie. Anaplasie ist eine rückläufige, zum Verlust der Differenziertheit führende Umwandlung der Zelle. Man spricht auch von einer „retrograden Metaplasie“. Tumor-Klassifikations-Systeme dienen der Bestimmung des Ausmaßes von Malignomen, insbesondere als Kriterium für Operabilität, Prognose und statistische Vergleichbarkeit. Das in der allgemeinen Tumorpathologie übliche Staging ist in der Neuroonkologie nicht anwendbar, z.B. weil nicht mit entsprechenden Lymphknotenbeteiligungen u.ä. zu rechnen ist. Zur Bewertung der Malignität wird aber ein Grading angewandt, das sich hier konkret auf folgende morphologische Malignitätskriterien stützt: •

Grad der Dedifferzierung der Tumorzellen

•

Pleomorphie des Tumors

•

Art des invasiven Wachstums

•

Vorkommen regressiver Veränderungen und Tumornekrosen

•

Art der Gefäßreaktion

•

Ausbreitung auf dem Liquorweg

Für Astrozytome gibt es verschiedene Grading-Systeme: das Kernohan-Grading, das Ringertz-System, das St. Anne/Mayo-System und das WHO-Grading. In der vorliegenden Arbeit wurden die Tumoren gemäß der WHO-Klassifikation eingeteilt, da diese als einzige von internationaler Bedeutung ist, außerdem ist sie durch die Wahl ihres Vokabulars zur Beschreibung bestimmter Merkmale und ihrer Definitionen sicherlich diejenige mit der höchsten Objektivität und Reproduzierbarkeit. Des weiteren sind die von ihr eingekreisten Tumorgruppen am Besten hinsichlich der Prognose vergleichbar, d.h. sie korrelieren auch stark mit dem Überleben der Patienten. •

Mit Grad I wird eine Läsion bezeichnet, die bei mittlerer Zelldichte eine weitgehende Isomorphie der Tumorzellen aufweist. Beispiele sind das pilozytisches Astrozytom und das Meningeom. Nach bloßer chirurgischer Resektion ist die Möglichkeit der Heilung gegeben.

7

•

Dem Grad II sind Tumoren zuzurechnen, die entweder eine erhöhte Zelldichte oder eine weniger ausgeprägte Isomorphie aufweisen. Die Mitosezahl kann erhöht sein, vor allem finden

sich

atypische

Mitoseformen.

Beispiele

sind

das

fibrilläre

oder

das

protoplasmatische (=„niedriggradige“) Astrozytom oder Oligo-Astrozytom. In der Regel findet ein infiltrierendes Wachstum statt und nach einer Resektion treten Rezidive auf, die auch zu höheren Malignitätsgraden fortgeschritten sein können. •

Für eine Einordnung als Grad III spricht eine erhöhte Polymorphie, das Auftreten von Nekrosen oder das gelegentliche Vorkommen zellreicher, mitunter schlingenförmig angeordneter Gefäße. Beispiele sind das anaplastisches Astrozytom oder OligoAstrozytom.

•

Der Grad IV umfaßt additiv ausgedehnte Gewebsnekrosen, in der Regel mit kernreichen Nekroserändern, intratumoral weite sinusoidale venöse Gefäße und vor allem an den Herdrändern

glomerulumähnliche

kleine

Gefäße,

schließlich

eine

ausgeprägte

Zellpolymorphie und wechselnde Zelldichten. Beispiele sind das Glioblastoma multiforme, sowie das Medulloblastom und andere PNET. Die Bestimmung des Malignitätsgrades wird dadurch erschwert, daß dieser innerhalb eines Neoplasmas verschieden sein kann. Da der jeweils maligneste Anteil die Prognose bestimmt, wird die endgültige Diagnose an ihm orientiert. Im Folgenden wird eine kurze Beschreibung der spezifischen histopathologischen Merkmale der in dieser Studie untersuchten astrozytischen Tumoren gegeben. Dies erleichtert später die Darstellung der Ergebnisse der immunhistochemischen Untersuchung und deren Diskussion. Astrozyten (Makroglia) sind große, sternförmige Zellen mit zahlreichen Zellfortsätzen. Sie treten auf als sogenannte fibrillenreiche Langstrahler oder protoplasmatische Kurzstrahler. 1. Das fibrillären Astrozytom (Grad II) ist der am weitesten ausdifferenzierte, in der Regel auch wenig zelldichte, dafür aber breit infiltrierende Tumor, dessen Grenzen oft schwierig zu

bestimmen

sind.

Es

überwiegen

Zellen

mit

unregelmäßig

ausgerichteten

Zytoplasmafortsätzen, zwischen denen sich bei zunehmenden regressiven Veränderungen spongiöse Hohlräume, schließlich kleine Zysten bilden. Die Kerne liegen an den scheinbaren Überschneidungspunkten des Fasergitters. 2. Beim protoplasmatische Astrozytom (Grad II) ist die grobspongiöse bis kleinzystische Gewebsumwandlung deutlicher als beim fibrillären Astrozytom. Dementsprechend treten die Faserstrukturen relativ zurück, während die Perikarya breiter sind. Die Zellfortsätze

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sind nur auf kurze Strecken verfolgbar und intrazytoplasmatische Fibrillen nur in geringem Grad nachweisbar. 3. Ein

gemischtes

Oligo-Astrozytom

Oligodendroglioms:

Durch

zeigt

perinukleäre

zusätzlich

folgende

Schrumpfräume

Merkmale

entsteht

eine

eines

typische

Honigwabenstruktur; die Kerne liegen in der Mitte der kleinen Gewebshohlräume. Die Infiltrationszone ist in den Randpartien nicht so breit wie bei den Astrozytomen. In den Randpartien finden sich zahlreiche Kalkkonkremente und häufig eine verstärkte Satellitenbildung der Oligodendrogliom-Zellen um die erhalten gebliebenen Nervenzellen. 4. Beim anaplastischen Astrozytom oder – Oligo-Astrozytom (Grad III) finden sich selektiv Blutungen, Nekrosen, Zellpolymorphie, pathologische Gefäße. Treten all diese Kriterien additiv auf, wird die Diagnose eines multiformen Glioblastoms gestellt. 5. Das Glioblastoma multiforme (Grad IV) ist gekennzeichnet durch eine hohe Tumorzelldichte. Wesentlich für die Diagnose ist die Kombination mit ausgedehnten Nekrosen, die palisadenförmig von einem Saum dichtliegender Tumorzellen umrandet sind. Hinzu kommen die ausgeprägten Gefäßproliferate. Blutungen unterschiedlichen Alters mit entsprechenden Residuen in Form von Sidero- und Lipophagen sind häufig erkennbar. In vielen Fällen bestehen dichte Lymphozyteninfiltrate um die Gefäße vor allem der Randbezirke des Tumors. Die primitiven neuroektodermalen Tumoren (PNET) gehören zur Gruppe der embryonalen Tumoren, die alle de novo per definitionem einem Grad IV entsprechen, also nicht wie die astrozytischen

Tumoren

in

einen

Malignisierungsprozess

eingebunden

sind.

Das

Medulloblastom ist ein PNET mit der Lokalisation im Kleinhirn. Der PNET entsteht aus einer multipotenten (undifferenzierten) Vorläuferzelle und kann neuronale, astrozytäre, ependymale und sogar muskuläre oder melanozytäre Anteile enthalten. Seine genaue Histogenese ist aber immer noch ungeklärt, als Ausgangspunkt und Proliferationszone wird die äußere Körnerzellschicht vermutet. Er entsteht überwiegend im Kindesalter mit einem Vorzugssitz in der wurmnahen Kleinhirnregion. Beim Medulloblastom handelt es sich morphologisch um einen zelldichten Tumor, der aus rundlichen bis rübchenförmigen Kernen besteht, ohne daß in der Regel lichtmikroskopisch deutlichere Zelleiber und –fortsätze sichtbar wären. Atypische Mitosen können häufig sein. Der Tumor bildet gelegentlich palisadenförmige Strukturen und Pseudorosetten (d.h. radiäre Kernanordnung der Tumorzellen um ein zentrales Gefäß oder um ein virtuelles Zentrum). Die Abgrenzung zum gesunden Kleinhirngewebe ist unterschiedlich scharf.

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Eine

Sonderform

stellt

das

desmoplastische

Medulloblastom

(sogenanntes

Arachnoidalsarkom des Kleinhirns) dar. Dieser Tumor trifft häufiger Adoleszenten und Erwachsene und ist biologisch als nicht so maligne aufzufassen wie das typische Medulloblastom. Dem entspricht auch ein anderes morphologisches Muster, bei dem ein vielfach hoher Gehalt an Retikulinfasern zwischen den rundlichen bis spindelförmigen Kernen erkennbar ist.

In Gehirntumoren wurde eine positive Korrelation zwischen Tumormalignität und MMPMenge dokumentiert (Nakano et al. 1995; Yamamoto et al. 1996). In bisherigen Studien wurde auch gezeigt, daß Gliomzellen in vitro eine Anzahl von Metalloproteinasen und deren Gewebsinhibitoren sezernieren können (Apodaca et al. 1990; Nakano et al. 1993). Obwohl die Literatur auf diesem Gebiet in den letzten Jahren angewachsen ist, gibt es nur wenige systematische Studien der repräsentativsten Mitglieder der MMP und TIMP-Familien in Gehirntumoren. Diese Studie wurde durchgeführt, um die Expressionsmuster der MMPGene in Gliomen und Medulloblastomen zu untersuchen und zu ermitteln, ob ihre Expression mit dem invasiven Potential und dem histologischen Tumor-Grad korreliert. Außerdem wurde auf Proteinebene die Aktivierung der Gelatinasen quantifiziert und mt1-MMP, Gelatinase A und - B und TIMP-1 und –2 im Gewebe lokalisiert. Entsprechend wurde auch die Rolle der TIMP in dem invasiven Prozess und ihr Verhältnis zu den sezernierten MMP auf RNA- und Proteinebene untersucht.

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Material und Methoden

Auswahlkriterien

Nur Patienten, bei denen ein Gehirntumor zum ersten Mal auftrat, wurden in diese Studie aufgenommen, keine Rezidive. Voraussetzung war außerdem, daß vor der Tumorresektion keine Bestrahlung oder Chemotherapie stattgefunden hatte. Die histopathologische Diagnose basiert auf den Kriterien der jüngsten WHO-Klassifikation (Kleihues et al.

1993). Untersucht wurden drei niedriggradige Astrozytome, zwei

anaplastische Astrozytome, vier Glioblastome und drei Medulloblastome im Vergleich mit normalem Gehirngewebe als Kontrolle. Eine Übersicht der in diese Studie eingegangenen Tumoren zeigt Tab. 1: Proben-Nr.

(Sektion) 1 2 4 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

Patient: Neuropathologische Diagnose Alter, Geschlecht 66, F 88, M 67, F 52, M 30, F 41, M 57, M 28, F 32, F 58, F 66, F 57, F 7, M 11, M 31, M

Normalgehirn Normalgehirn Normalgehirn Fibrilläres Astrozytom Protoplasmatisches Astrozytom Oligo-Astrozytom Anaplastisches Astrozytom Anaplastisches Oligo-Astrozytom Glioblastoma multiforme Glioblastoma multiforme Glioblastoma multiforme Glioblastoma multiforme Medulloblastom Medulloblastom Desmoplastisches Medulloblastom

WHO- Lokalisatio Grad n

II II II III III IV IV IV IV IV IV IV

front.-par. temp. par. front. front. occip. front.-temp. front. par.-occip. unt. Vermis ob. Vermis

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Gewebeaufbereitung Der vom Operateur resezierte Tumor wurde sofort nach der Entnahme zweigeteilt. Ein Teil wurde formalinfixiert, paraffiniert und für neuropathologische Diagnostik weiterverarbeitet. Die andere Hälfte, das für molekularbiologische Untersuchungen vorgesehene Gewebe, wurde sofort nach der Entnahme in flüssigem Stickstoff tiefgefroren und bis zur RNAExtraktion bei –80°C gelagert. An dem in Paraffin gelagerten Tumorgewebe wurden die immunhistochemischen

Untersuchungen

durchgeführt

und

aus

dem

tiefgefrorenen

Tumoranteil wurde sowohl RNA zur Northern Blot Analyse und zur reversen Transkription mit anschließender PCR extrahiert, als auch Protein für die Zymographie (SubstratGelelektrophorese) gewonnen. Bei dem als Kontrolle verwendeten Normalgehirngewebe konnten nicht, wie bei den Tumoren, immunhistochemische und molekularbiologische Untersuchungen an Geweben von demselben Individuum durchgeführt werden. So stammt das für Northern Blot, PCR und Zymographie benutzte Normalgehirngewebe aus der tumorfreien, neokortexnahen weißen Substanz von Patienten, bei denen ein operativer Zugang zu einem tiefliegenden Meningeom geschaffen werden mußte. Da es sich dabei verständlicherweise um winzige Mengen handelte mußte für die entsprechenden Kontollen der immunhistochemischen Untersuchungen Sektionsgewebe derselben Lokalisation, ohne gehirnpathologischen Befund, herangezogen werden (s. Tab. 1). Abb. 1 zeigt ein Flußdiagramm der Methoden.

RNA-Extraktion

Die Gesamt-RNA wurde aus den Gewebeproben mit einem Zwei-Stufen Protokoll extrahiert. Die gefrorenen Gewebe wurden mechanisch pulverisiert und die RNA in einem ersten Schritt mit der Guanidin-Isothiocyanat-Methode nach Chomczynski und Sacchi präpariert (Chomczynski und Sacchi, 1987). Dabei wird das Gewebe durch die Suspension in Guanidinumisothiocyanat-Puffer vollständig denaturiert. Der Zusatz von Mercaptoethanol und N-Laurylsarkosin verhindert eine Degradation der RNA. Dann werden proteinhaltige Verunreinigungen durch Extraktion mit Phenol vollständig denaturiert und entfernt und anschließend die in der wässrigen Phase zurückbleibenden Nukleinsäuren mit Isopropanol gefällt, um sie von den kleinen Molekülen der Zelle abzutrennen.

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Abb. 1: Flußdiagramm der Methoden

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Nach der Präzipitation mit Isopropanol wurde die RNA wieder in der RLT-Pufferlösung des RNeasy Mini Kit (Quiagen, Hilden) gelöst und gemäß der Anleitung des Herstellers weiterpräpariert. Der jeweilige RNA-Gehalt wurde photometrisch bestimmt und durch Zugabe von H2O in allen Proben die gleiche Konzentrationen hergestellt. Vor der Aufnahme in die Studie, d.h. Messung der spezifischen mRNAs, wurde zunächst die Qualität der Gesamt-RNA des jeweiligen Gewebes geprüft, da diese sehr anfällig für Degradierung ist. Die Qualität der extrahierten Gesamt-RNA wurde anhand der zwei charakteristischen Banden der 28S- und 18S-Untereinheiten der ribosomalen RNA, die 95% der cytoplasmatischen RNA ausmacht, mit einem 1,5% Agarose-Testgel überprüft. Dabei waren scharfe, klar definierte Banden ein Beweis für gut erhaltene RNA. Insgesamt wurden aus der Tumor-Bank der Abteilung Neuropathologie 29 Gewebeproben untersucht, davon konnten die oben erwähnten 12 mit verwerbarer RNA in dieser Studie weiterverarbeitet werden.

Northern blot Analyse

Beim Northern Blotting werden gelelektrophoretisch aufgetrennten RNA-Moleküle, damit sie für spezifische DNA-Sonden erreichbar werden, auf ein Blatt Nylonpapier übertragen („geblottet“). Diejenigen RNA-Moleküle, die mit der radioaktiv markierten DNA-Sonde hybridisieren, werden dann lokalisiert, indem das Papier in einer Lösung inkubiert wird, die die Sonde enthält und schließlich durch Autoradiographie nachgewiesen. Die Größe der RNA-Moleküle jener Bande, an die die Indikatorsonde bindet, wird durch Referenz-RNA-Moleküle bekannter Größe bestimmt (RNA-Standards), die parallel zu den fraktionerten RNA-Molekülen in der Elektrophorese aufgetrennt wurden.

Die Gesamt-RNA (jeweils 15 µg von jeder Gewebsprobe) wurde elektrophoretisch aufgetrennt in einem denaturierenden 1,4% Agarose-Gel, das 2,2 mol/l Formaldehyd enthielt, und anschließend über Nacht mittels Kapillarblot von dem Gel auf eine Duralon UltraviolettMembran (Stratagene, La Jolla, CA) transferiert und durch UV-Bestrahlung an die Membran fixiert (Ultraviolett cross-linker, Stratagene). Die Membranen wurden für eine Stunde in QuikHyb Hybridization Solution (Stratagene) bei 68°C mit 32P-markierter cDNA zusammen mit folgenden DNA-Sonden hybridisiert:

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Der 2,1 kb Kollagenase 1, einem 469 bp Kollagenase 2 Fragment, der 1,9 kb Kollagenase 3 (Conca and Willmroth, 1994), der 2,1 kb Gelatinase A (Huhtala et al. 1990), einem 1,7 kb Gelatinase B-Fragment (Wilhelm et al.

1989), dem 1,8 kb Stromelysin 1, dem 1,6 kb

Stromelysin 2 (Conca and Willmroth, 1994), dem 1,8 kb Stromelysin 3 (Anglard et al. 1995), einem 1,1 kb Matrilysin-Fragment (Muller et al.

1988), einem 408 bp Humane

Metalloelastase-Fragment , einem 735 bp RASI Fragment (Kolb et al. 1997), der 1,2 kb mt1-MMP (Okada et al. 1995), einem 495 bp mt2-MMP-Fragment, einem 429 bp mt3-MMPFragment, einem 317 bp mt4-MMP-Fragment (Puente et al. 1996), ein 780 bp TIMP-1 Fragment (freundlicherweise zur Verfügung gestellt von S.Gay), einem 357 bp TIMP-2 Fragment, einem 341 bp TIMP-3-Fragment und der 1,27 kb Glyzerinaldehyd-3-phosphat Dehydrogenase (GAPDH). Die Membranen wurden folgerdermaßen gewaschen: zwei Mal für jeweils 15 Min. bei 60°C in 2xSSC, 0,1% SDS und schließlich 30 Min. in 0,1xSSC, 0,1%SDS. Dann wurde mit den Membranen ein Biomax MR Film (Kodak) mit Verstärkerfolie für 18 bis 48 Stunden bei – 80°C belichtet. Der mRNA-Gehalt wurde mit einem Image Master System DTS (Pharmacia, Uppsala) densiometrisch quantifiziert. GAPDH wurde als interne Ladekontrolle eingesetzt: Um Unterschiede in der Transkription in den verschiedenen Geweben genau quantifizieren zu können, wurden gleiche Mengen Gesamt-RNA aufgetragen. Die Vergleichbarkeit ist so aber immer noch problematisch, da die RNA-Proben zum Teil genomische DNA oder degradierte DNA enthalten, die nicht zur Hybridisierung beitragen, aber bei Konzentrationsbestimmungen mitgemessen werden. Die Menge einer bestimmten RNA kann auch von der Transkription einer anderen RNA innerhalb einer Zelle abhängen. Darum wurde der Blot nochmals mit einer Sonde hybridisiert, die ubiquitär in allen Zellen exprimiert wird: Glyzerinaldehyd-3phosphat Dehydrogenase (GAPDH). Gleich starke Signale in allen Spuren sind dann ein guter Anhaltspunkt für ihre Vergleichbarkeit, ansonsten, wie auch hier, werden sie rechnerisch angeglichen.

PCR

Die Polymerase-Kettenreaktion ist ein Arbeitsverfahren zur Vermehrung spezifischer Abschnitte einer DNA durch vielfache Zyklen von DNA-Polymerisation und kurzer Hitzebehandlung, um die synthetisierten komplementären Stränge zu trennen. Für die

15

Amplifikation ist es notwendig, die RNA zunächst in DNA umzuschreiben, da die AusgangsRNA nicht direkt als Matrize von der Taq-Polymerase genutzt werden kann. Die hierzu verwendeten Enzyme werden als Reverse Transkriptasen (RTasen) oder RNA-abhängige DNA-Polymerasen bezeichnet. Man nennt den dabei gebildeten DNA-Strang auch komplementäre DNA (cDNA), und der Schritt, in dem diese cDNA entsteht wird als Reverse Transkription (RT) bezeichnet. Primer sind kurze Abschnitte doppelsträngiger DNA mit einem freien 3´-OH-Ende, das dann entsprechend verlängert werden kann. Sie binden an den zu amplifizierenden cDNAEinzelstrang und können nun von der Polymerase verlängert werden. Denaturiert man anschließend die neu synthetisierte doppelsträngige DNA durch Temperaturerhöhung in ihre Einzelstränge, so können neue Primermoleküle binden und der Prozess wiederholt sich im Sinne einer exponentiellen Amplifikation. Die zelluläre Gesamt-RNA wurde extrahiert wie oben beschrieben. Mit einem System zur Reversen Transkription (Promega, Madison, WI) wurde gemäß der Anleitung des Herstellers der erste cDNA-Strang generiert. Die anschließende Polymerase-Kettenreaktion wurde mit 2 µl des Produktes der Reversen Transkriptions und Taq-Polymerase (High Fidelty, Boehringer AG, Mannheim) mit folgenden Parametern durchgeführt: 4 Min. auf 94°C; 31 Zyklen: 45 Sek. auf 94°C, 1 Min. auf 55°C, 1 Min. auf 72°C; und schließlich 7 Min. bei 72°C. Zur Amplifizierung der gesuchten Gene wurden folgende Oligonukleotid-Primerpaare für die PCR

benutzt:

Kollagenase

1:

5-ATTCTACTGATATCGGGGCTTTGA-3

5-ATGTCCTTGGGGTATCCGTGTAG-3

(+683

bis

+1092);

Kollagenase

und 2:

5-ACGGGAAGCCAAATGAGGA-3 und 5-GAGTGAGCGAGCCCCAAAGAAT-3 (+222 bis

+680);

Kollagenase

3:

5-CCTGGCTGCCTTCCTCTTCTTGA-3

5-AACCCCGCATCTTGGCTTTTTC-3

(+15

5-ATGCCCACTTTGATGATGATGAAC-3 (+581

bis

+1022);

Stromelysin

und

2:

5-GGAGGGGGAGGTCCGTAGAGA-3

bis

+294);

Stromelysin

und 1:

5-CCACGCCTGAAGGAAGAGATG-3

5-ATGCGCAAGCCAAGGTGTG-3

(+257

bis

+871);

Stromelysin

und 3:

5-GCCGCCGGACGTCCACCACCTC-3 und 5-CAGCGCCCGCCAGAAAGCACGAAC-3 (+103

bis

+315);

Matrilysin:

5-CTCCTCGCGCAAAGCCAATCAT-3

5-TGTTAAACTCCCGCGTCATAGAAA-3 (+218

bis

+486);

Humane

und

Metalloelastase:

5-GACCGGGCAACTGGACACATCTA-3 und 5-CACGGGCAAAAACCACCAAAAT-3 (+225

bis

+496);

RASI:

5-GCTGGGCCGCTGGAGAAAGAA-3

5-CGAGGCGAGTAGACAGCAGCATCC-3

(+300

bis

+1035)

und

TIMP

und 3:

16

5-TTGGCTCGGGCTCATCGTGCTC-3 und 5-GCCCCGTGTACATCTTGCCATCAT-3 (+9 bis +349). GAPDH-Primer wurden als Ladekontrolle benutzt. Als negative Kontrolle wurde eine RTPCR ohne RNA durchgeführt. Die Amplifikationsprodukte wurden in 1,5% Agarose-Gels aufgetrennt.

Zymographie

Bei

der

Zymographie

(Synonym:

Substratgelelektropherese)

werden

Enzyme

elektrophoretisch in einem Gel aufgetrennt, dem das entsprechende Substrat, hier Gelatine, zugesetzt wurde. Gelatine wird durch Coomassie Blue blau gefärbt; wo sie enzymatisch degradiert wird, ist dementsprechend eine entfärbte Bande im Gel sichtbar. Die aktivierten und latenten Gelatinasen wandern zunächst im Gel an die ihrem Molekulargewicht entsprechende Position. Danach, beim Waschen des Gels in Triton X-100, werden auch die latenten Formen durch autokatalytische Abspaltung der Pro-Domäne in aktive Formen überführt, so daß jetzt an den Positionen der in vivo aktivierten Gelatinasen und der in vivo latenten, jetzt aber in vitro aktivierten Gelatinasen, das Substrat Gelatine degradiert wird und durch Entfärbung sichtbar gemacht werden kann. Das Tumorgewebe wurde also aufgetaut, gewogen, in Tris-Pufferlösung (50 mmol/l Tris-HCl und 75 mmol/l NaCl, pH 7,5) homogenisiert und 20 Min. mit 5000 x g zentrifugiert. Die Pellets wurden verworfen, die Überstände aliquotiert und der Proteingehalt mit BCA Protein Assay Reagent (Pierce, Rockford, IL) bestimmt. Die Proben wurden mit SDS-Puffer ohne reduzierendes Agens gemischt und für 20 Min. inkubiert um die MMP zu denaturieren und die MMP-TIMP-Komplexe zu dissoziieren. Die Elektrophorese erfolgte in 10% Polyacrylamid-Gelen, die 0,1% SDS und Gelatine in einer Endkonzentration von 0,12% enthielten. Nach der Elektrophorese wurden die Gele für eine Stunde in 2,5% Triton X-100 gewaschen, um das SDS zu entfernen. Während dieses Prozesses werden Proenzyme autokatalytisch aktiviert. Die Gels wurden dann für 24 h bei 37°C in Reaktionpuffer (50 mmol/l Tris-HCl, 0,15 mol/l NaCl, 10 mmol/l CaCl2 und 0,02% NaN3, pH 7,5) inkubiert und mit 0,1% Coomassie Brilliant Blue R 250 gefärbt.

17

Nach ausreichendem Entfärben ist die gelatinolytische Aktivität als klare Bande auf blauem Hintergrund erkennbar.

Immunhistochemie

Paraffinschnitte wurden mit Immunperoxidase-Färbe-Kits für Maus– und KaninchenImmunglobulin (Vector Laboratories, Burlingame, CA) gemäß den Angaben des Herstellers gefärbt. Folgende fünf Primärantikörper wurden in folgenden Konzentrationen eingesetzt: Anti-mt1-MMP (Klon 114-1F2), 5 µg/ml; anti-MMP 2 (Klon 42-5D11), 5µg/ml (beide Maus, monoklonal; Calbiochem, Bad Soden); anti-MMP 9, 10µg/ml (Kaninchen, polyklonal; Quartett, Berlin), anti-TIMP 2, 10µg/ml (Kaninchen, polyklonal; Biogenesis, Poole, UK) und anti-TIMP-1, 5µg/ml (Maus, monoklonal, Klon 147-6D11; ICN, Aurora, Ohio). Insgesamt wurden folgende fünf weitere Antikörper sowohl an Paraffin- als auch an Kryoschnitten mit unbefriedigendem Ergebnis getestet und daher nicht eingesetzt: Anti-MMP 9 (Maus, monoklonal, Klon 6-6B; Calbiochem), anti-TIMP-2 (Maus, monoklonal, Klon T2-101; Calbiochem), Anti-MMP 2 (Kaninchen, polyklonal; Biogenesis, Poole, UK), anti-TIMP-1 (Kaninchen, polyklonal; NMI, San Diego, California) und anti-TIMP-1 (polyklonal; Calbiochem). Die entnommenen Gewebe wurden in 4% Paraformaldehyd fixiert und in Paraffin eingebettet. 2 µm dicke Schnitte wurden angefertigt, entparaffiniert, und, nach dem Blockieren der endogenen Peroxidase durch Behandlung mit 0,3% H2O2 für 30 Min. und dem Blockieren unspezifischer Bindungen mit 2% Normalserum, mit den jeweiligen Primärantikörpern für 12-14 h bei 4°C in einer feuchten Kammer inkubiert. Nach dem Waschen in PBS-Puffer (Phosphate-buffered saline) wurden die Schitte zuerst mit den biotinylierten anti-Ig der jeweiligen Spezies und anschließend mit den Avidin-Biotin-MeerrettichperoxidaseKomplexen inkubiert. Nach jedem Inkubationsschritt wurde drei Mal mit PBS gewaschen. Das Immunperoxidase-Reaktionsprodukt wurde sichtbar gemacht mit 3,3´-DiaminobenzidinHCl (DAB-Puffer-Tabletten, Merck, Darmstadt) und 0,006% H2O2. Die Objekte wurden kurz mit Hämatoxylin gegengefärbt, eingedeckelt und mit einem Leitz Dialux 20 EB Mikroskop untersucht. Kontrolliert wurde mit 2% Normalserum.

18

Für die Immunfluoreszenz wurde anti-mt-MMP in einer Konzentration von 10 µg/ml benutzt. Cy3-konjugierte, affinitätsgereinigte anti-Maus IgG (Ziege; Rockland Lab, Gilbertsville, PA) wurden in einer Konzentration von 2 µg/ml als Sekundärantikörper eingesetzt, nachdem überschüssiger Primärantikörper durch mehrmaliges Waschen entfernt worden war. Die Inkubationszeit betrug bei Raumtemperatur 3 h. Die eingedeckelten Objekte wurden mit einem Leica TCS NT konfokalen Laserscanning Mikroskop ausgewertet.

19

Ergebnisse

Northern blot Analyse

Eine Northern blot Analyse wurde durchgeführt, um die MMP- und TIMP-mRNA in Gilomen, Medulloblastomen und normalem Gehirngewebe zu quantifizieren und somit das Expressionsmuster der jeweiligen Gene in den Gehirntumoren des Menschen zu erkennen. Untersucht wurden die 14 Gewebeproben auf Kollagenase 1, Kollagenase 2, Kollagenase 3, Gelatinase A, Gelatinase B, Stromelysin 1, Stromelysin 2, Stromelysin 3, Matrilysin, Humane Metalloelastase, RASI, mt1-MMP, mt2-MMP, mt3-MMP, mt4-MMP, TIMP-1, TIMP-2 und TIMP-3. Die Transkripte in Abb. 2 korrespondieren bei 2,9 kb mit Gelatinase A, bei 2,8 kb mit Gelatinase B, bei 0,9 kb mit TIMP-1, bei 4,5 kb mit mt1-MMP, bei 4,1 kb mit mt2-MMP, bei 5,2 kb mit mt3-MMp und bei 1,4 kb mit GAPDH. TIMP-2 Transkripte treten sowohl in normalem Gehirngewebe als auch in Tumoren mit einer Hauptbande bei 3,5 kb und zusätzlichen Nebenbanden bei 2,3; 1,5 und 1,0 kb auf. Die Dichte sämtlicher MMP- / TIMP-Banden wurde gemessen und rechnerisch der Dichte der GAPDH-Bande des jeweiligen Gewebes angeglichen. Abb. 3–8 zeigen graphische Darstellungen der Ergebnisse in relativen Dichteeinheiten als Maß der Extinktion der jeweiligen Bande. Es zeigte sich eine Expression von 6 der 15 untersuchten MMPs und von 2 der 3 TIMP. In allen untersuchten Geweben war TIMP-2 stark exprimiert (Abb. 3). Die 3,5- und 2,3 kb TIMP-2 Transkripte waren die deutlichsten. Mt2-MMP war ebenfalls, bis auf zwei Ausnahmen, in allen Proben exprimiert, mit Abstand am deutlichsten jedoch bei zwei der drei Medulloblastome (Abb. 4). Hier zeigte mt2-MMP 2,90 und 2,42 Einheiten. Bei dem dritten Medulloblasom, einer desmoplastischen Variante, war mt2-MMP überhaupt nicht nachweisbar. Interessanterweise wurde bei diesem insgesamt am meisten Gelatinase A gemessen. Im Normalgehirn lag mt2-MMP bei 0,60 bzw. 0,61 Einheiten, bei einem fibrillären Astrozytom bei 1,04 Einheiten, bei einem Oligo-Astrozytom bei 0,92 Einheiten und war bei dem dritten der WHO-Grad-II-Tumoren, einem protoplasmatischen Astrozytom, nicht nachweisbar. Dieser Tumor produzierte in seiner Gruppe am meisten Gelatinase A. Während also die WHO-Grad-II-Gruppe gegenüber dem Normalgehirn eine leichte Zunahme zeigte,

20

kam es bei der WHO-Grad-III-Gruppe zu keiner weiteren Zunahme. Hier wurden 0,54 und 1,06 Einheiten gemessen. Bei den in der malignen Progression weiter fortgeschrittenen Glioblastomen kam es sogar wieder zu einer leichten Abnahme von mt2-MMP, der höchste Wert war 0,77 Einheiten, der niedrigste 0,17 Einheiten. Der Durchschnittswert dieser Gruppe betrug 0,48 Einheiten. TIMP-1 und Gelatinase B waren nur in der Glioblastom-Gruppe relativ einheitlich und deutlich erhöht. TIMP-1 lag bei den Glioblastomen bei 4,62 bis 19,97, durchschnittlich 9,30 Einheiten, bei zwei Medulloblastomen bei 0,67 bzw. 0,22 Einheiten und bei einem protoplasmatischen Astrozytom bei 0,93 Einheiten (Abb. 5). Gelatinase B maß bei drei der vier Glioblastome 0,78 bis 2,72 Einheiten, bei einem Medulloblastom 0,45 Einheiten und bei einem anaplastischen Gliom 0,41 Einheiten (Abb. 6). Verglichen mit normalem Gehirngewebe, wo sie praktisch nicht nachweisbar waren, wurde die mRNA von mt1-MMP und Gelatinase A in niedriggradigen und anaplastischen Astrozytomen hochreguliert. Im Glioblastoma multiforme stieg die Expression beider Gene nochmals deutlich an. In Medulloblastomen waren mt1-MMP und Gelatinase A ebenfalls überexprimiert, aber wesentlich weniger als in den Glioblastomen. Mt1-MMP zeigte in der Astrozytom-Gruppe 0,12 bis 0,89, durchschnittlich 0,51 Einheiten (Abb. 7). Bei einem anaplastischen Astrozytom wurden 0,71 Einheiten gemessen, bei dem anderen war mt1-MMP nicht nachweisbar – hier war auch Gelatinase A insgesamt am niedrigsten. Bei den Glioblastomen betrug die mt1-MMP zwischen 1,96 und 14,20; durchschnittlich 6,20 Einheiten. In der ebenfalls viertgradigen Medulloblastom-Gruppe wurden 1,68 bis 2,44, im Durchschnitt 2,13 Einheiten gemessen. Gelatinase A zeigte in der Astrozytom-Gruppe 0,05 bis 0,29, durchschnittlich 0,17 Einheiten, bei den anaplastischen Astrozytomen 0,02 und 0,28 Einheiten und in der Glioblastom-Gruppe zwischen 0,63 und 4,16, im Durchschnitt 2,24 Einheiten (Abb. 8). In der MedulloblastomGruppe wurden 0,05, 0,35 und 7,7 Einheiten gemessen. Wie vorher beschrieben zeigt sich, vor allem bei den Extremwerten und im Gruppendurchschnitt, ein proportionales Verhältnis von Gelatinase A zu mt1-MMP (Probe 9) und ein antiproportionales Verhältnis zu mt2-MMP (Proben 6 und 16). In allen untersuchten Geweben wurde nur eine schwache Expression von mt3-MMP und mt4-MMP gefunden, ohne jegliche Korrelation zur histopathologischen Klassifikation. Interessanterweise wurde in keinem der in dieser Studie getesteten Tumoren mit Northern Blot detektierbare Mengen von Kollagenasen, Stromelysinen, Matrilysin, Metalloelastase und RASI beobachtet.

21

Abb. 2: Northern blot von MMP und TIMP aus Normalgehirn (NB), niedriggradigen Astrozytomen (ASTRO II), anaplastischen Astrozytomen (ASTRO III), Glioblastomen (GBM) und Medulloblastomen (PNET). GAPDH wurde als interne Ladekontrolle eingesetzt.

22

TIMP-2 25

20,2 20

Extinktion

15

10 8,06

7,92 6,45 4,47

5

4,4 3,19

4,44

3,77

3,07

2,77

2,65 1,43 0,32

6) (1

5)

4)

(1

PN ET

G

PN ET

bm

PN ET

(1

(1 bm G

G

(1

3)

2)

1) bm

(1

(1

0)

) bm G

AA

AA

As

III

III

(8

(9

)

) II

II As

II As

(7

(6

)

) (4

(2 ) N

N

B

B

(1 )

0

Abb. 3: Densiometrische Quantifizierung der Northern blot Banden für TIMP-2, die Einheiten der Extinktion sind willkürlich gewählt: Normalgehirn (NB), niedriggradiges Astrozytom (As II), anaplastisches Astrozytom (AA III), Glioblastom (Gbm) und Medulloblastom (PNET).

mt2-MMP 3,5

2,9

3

2,42

Extinktion

2,5

2

1,5 1,06

1,04 0,92

1

0,77 0,61

0,6

0,59

0,54

0,5

0,38 0,17

(1 6 ET PN

ET PN

ET PN

)

) (1 5

) (1 4

) bm G

bm G

bm G

(1 3

(1 2

)

) (1 1

) G

bm

(1 0

(9 ) III AA

AA

III

(8 )

(7 ) II As

As

II

(4 ) As

II

(2 ) N

B

(1 ) B N

(6 )

0

Abb. 4: Densiometrische Quantifizierung der Northern blot Banden für mt2-MMP, die Einheiten der Extinktion sind willkürlich gewählt: Normalgehirn (NB), niedriggradiges Astrozytom (As II), anaplastisches Astrozytom (AA III), Glioblastom (Gbm) und Medulloblastom (PNET).

23

TIMP-1 25

19,79

20

Extinktion

15

10 7,63 4,96

4,62

5

0,93

0,22

0,67

0,1

ET

(1 6

)

) PN

ET PN

PN

bm

ET

(1 5

) (1 4

) (1 3

) G

G

bm

(1 2

) (1 1

) G

bm

bm

(1 0

(9 ) G

AA

AA

III

III

(8 )

(7 ) II As

As

As

II

(6 )

(4 ) II

(2 ) B N

N

B

(1 )

0

Abb. 5: Densiometrische Quantifizierung der Northern blot Banden für TIMP-1, die Einheiten der Extinktion sind willkürlich gewählt: Normalgehirn (NB), niedriggradiges Astrozytom (As II), anaplastisches Astrozytom (AA III), Glioblastom (Gbm) und Medulloblastom (PNET).

Gelatinase B 3 2,72 2,5

Extinktion

2

1,44

1,5

1 0,78 0,45

0,41

0,5

(1 6 ET PN

ET PN

ET PN

)

) (1 5

) (1 4

) bm G

bm G

bm G

(1 3

(1 2

)

) (1 1

) G

bm

(1 0

(9 ) III AA

AA

III

(8 )

(7 ) II As

As

II

(4 ) As

II

(2 ) N

B

(1 ) B N

(6 )

0

Abb. 6: Densiometrische Quantifizierung der Northern blot Banden für Gelatinase B, die Einheiten der Extinktion sind willkürlich gewählt: Normalgehirn (NB), niedriggradiges Astrozytom (As II), anaplastisches Astrozytom (AA III), Glioblastom (Gbm) und Medulloblastom (PNET).

24

mt1-MMP 16 14,2 14

12

Extinktion

10

8 5,8

6

4 2,82 2

) ET PN

ET PN

ET PN

bm

(1 6

) (1 5

) (1 4

) (1 3

) G

bm

(1 2

) G

G

bm

bm

(1 1

(1 0

(9 ) G

AA

AA

III

III

(8 )

(7 ) II As

)

0,01

(6 ) As

As

1,68

0,71

0,12

(4 ) II

(2 ) B N

N

B

(1 )

0

0,89

0,51

0,01

II

0,02

2,44

2,26

1,96

Abb. 7: Densiometrische Quantifizierung der Northern blot Banden für mt1-MMP, die Einheiten der Extinktion sind willkürlich gewählt: Normalgehirn (NB), niedriggradiges Astrozytom (As II), anaplastisches Astrozytom (AA III), Glioblastom (Gbm) und Medulloblastom (PNET).

Gelatinase A 9

8

7,7

7

Extinktion

6 5 4,16 4 3

3

2 1,16

0,05 )

)

)

(1 5 ET PN

PN

ET

(1 3 G

bm

(1 2 bm G

(1 4

)

)

) G

bm

(1 1

) G

bm

(1 0

(9 ) III AA

AA

III

(8 )

(7 ) II As

0,35

0,02

(1 6

0,28

0,05

(6 ) As

II

(4 ) II As

N

B

(1 ) B N

0,29

0,18

0,01 (2 )

0,01

0

ET

0,63

PN

1

Abb. 8: Densiometrische Quantifizierung der Northern blot Banden für Gelatinase A, die Einheiten der Extinktion sind willkürlich gewählt: Normalgehirn (NB), niedriggradiges Astrozytom (As II), anaplastisches Astrozytom (AA III), Glioblastom (Gbm) und Medulloblastom (PNET).

25

PCR Um die negativen Ergebnisse in der Northern blot Analyse zu konsolidieren, wurde als noch sensitivere Methode eine PCR-Analyse durchgeführt. Außerdem konnte so noch nach spezifischen mRNA für einige zusätzliche MMP gefahndet werden. Damit auch sehr kleine Mengen mRNA detektiert werden konnten, wurden die mRNA-Transkripte mit spezifischen Primern für 31 Zyklen vervielfältigt. Auch mit dieser hohen Anzahl an Zyklen konnte keine mRNA von Kollagenese 2, Kollagenase 3, und Stromelysin 2 gefunden werden. In einigen Fällen, ohne jegliche Korrelation zu Tumor-Grad oder Histologie, wurden sehr schwache Signale gefunden, und zwar für: Kollagenase 1 (ein Glioblastom), Metalloelastase (eine Normalgehirn-Probe, ein Astrozytom, ein anaplastisches Astrozyom), Stromelysin 1 (ein anaplastisches Astrozytom, ein Glioblastom), Stromelysin 3 und RASI (beide waren gleichmäßig schwach zu finden in allen untersuchten Geweben). Eine schwache MatrilysinExpression war sichtbar in zwei Glioblastomen (Proben 12 und 13; Abb. 9). Die Signale, die in den zwei Spuren des normalen Gehirngewebes (Proben 1 und 2) und der ersten Spur der Astrozytom-Gruppe (Probe 4) erschienen, waren ungefähr 350 bp und damit länger als die erwartete Größe von 270 bp. Eine TIMP-3-Expression war in allen untersuchten Geweben ohne jegliche Korrelation zum WHO-Tumorgrad sichtbar (Abb. 9).

Zymographie

Die Sekretion von Gelatinasen wurde mittels Zymographie (Substratgelelektrophorese) untersucht. Mit dieser Methode kann man latenten Progelatinasen von aktivierten Enzymformen unterscheiden. Nachdem in Northern Blot und PCR die erste Stufe der MMPRegulation, die Genexpression, demonstriert wurde, wird hier die zweite Stufe erfasst, d.i. die Aktivierung

der

Genprodukte.

Die

entsprechenden

Progelatinasen

mit

einem

Molekulargewicht von 92 kd für Progelatinase B und 72kd für Progelatinase A sind in Abb. 10 gezeigt. Unterhalb der latenten Formen erscheinen die proteolytisch aktivierten Formen als ein deutlicher Komplex von 2 - 3 Banden. Es entstehen mehrere Banden durch unterschiedliche Spaltung. Die Banden oberhalb der 92 kd Progelatinase B entsprechen einem nicht dissoziiertem Dimer aus Gelatinase B und NGAL (Neutrophil Gelatinase Associated Lipocain).

26

Die Zymographie zeigt eine konstitutive Sekretion latenter Formen von Gelatinase A und B in jedem untersuchten Tumor und sogar in normalem Gehirngewebe; jedoch wurden in niedriggradigen Astrozytomen und in normalem Gehirngewebe keine meßbaren Mengen der aktivierten Enzyme gefunden. Im Gegensatz dazu war bei Glioblastomen ein Anstieg der aktivierten Formen der Gelatinasen deutlich durch eine zweite und sogar dritte Bande sichtbar. In den Medulloblastomen war die Menge der Proenzyme hoch, mit kaum meßbaren aktivierten Formen beider Gelatinasen. Die Ergebnisse der Zymographie sind, in Zusammenschau zusammengefaßt.

mit

den

Meßwerten

der

anderen

Untersuchungen,

in

Tab.

2

27

Abb. 9: Agarosegel der rtPCR-Amplifikationsprodukte für Matrilysin und TIMP-3. GAPDH wurde als interne Ladekontrolle verwendet. Normalgehirn (NB), niedriggradige Astrozytome (ASTRO II), anaplastische Astrozytome (ASTRO III), Glioblastome (GBM), Medulloblastome (PNET).

Abb. 10: Substratgelelektrophorese (Zymographie) der Gelatinasen. Die latenten Formen zeigen sich bei 92 kDa (Gelatinase B) bzw. 72 kDa (Gelatinase A), darunter sind die jeweils aktivierten Formen sichtbar. Normalgehirn (NB), niedriggradige Astrozytome (ASTRO II), anaplastische Astrozytome (ASTRO III), Glioblastome (GBM), Medulloblastome (PNET).

28

29

Immunhistochemie Auf Grundlage der Ergebnisse der Nothern blot-Analysen wurde eine Immunfärbung der Gliome, Medulloblastome und normalen Gehirngewebes aus Sektionen mit Anti-mt1-MMP, Anti-Gelatinase A, Anti-Gelatinase B, Anti-TIMP-2 und Anti-TIMP-1 durchgeführt. Die Ergebnisse der Immunfärbungen bestätigen die der Northern Blot-Analyse. Positive Färbung für mt1-MMP war beschränkt auf Tumorzellen; sie war lokalisiert in der Zellmembran und zeigte ein heterogenes Muster mit fokalem Anstieg der Immunreaktivität. Ebenso wurde Gelatinase A in Tumorzellen identifiziert, jedoch zytoplasmatisch und teilweise in Kolokalisation mit mt1-MMP (Abb. 11 und 12). In niedriggradigen Astrozytomen zeigten wenige Zellen eine sporadisch positive Färbung für Gelatinase A und mt1-MMP, wobei maligne Gliome und Medulloblastome eine starke Immunreaktion aufwiesen (Abb. 13). Einer der Medulloblastomfälle (Probe 16) war eine desmoplastische Variante mit einem außergewöhnlichen Befund: die zellreichen mesenchymalen Trabeculae der Tumorzellen, die in einer anderen Färbung Retikulin aufwiesen, zeigten eine starke Immunfärbung für Gelatinase A, wobei die retikulinfreien neuroektodermalen Inseln sich überwiegend mit mt1-MMP färbten (Abb. 14). Positive Färbung für Gelatinase B war im Zytoplasma der Tumorzellen lokalisiert. Sie war schwach in niedriggradigen Astrozytomen und Medulloblastomen; Glioblastome dagegen wurden stark gefärbt. Die Immunfärbung für TIMP-2 zeigte Nester positiver Zellen in allen Tumoren. Mit Anti-Gelatinase B, TIMP-1 und TIMP-2 wurden auch Endothelzellen gefärbt. In normalem Gehirngewebe wurde keine spezifische Immunreaktivität für mt1-MMP, Gelatinase A, Gelatinase B und TIMP-1 gefunden. TIMP-2 wurde in normalem Gehirngewebe hauptsächlich in Endothelzellen und wenigen Astrozyten und Neuronen angetroffen (Abb. 15). In einem Medulloblastom (Probe 15) kam teilweise gesundes Cortexareal zur Darstellung, dort zeigten Purkinje-Zellen eine positive Färbung für Gelatinase B und TIMP-2 (Abb. 16). Auch die Färbung mit Anti-TIMP-1 Antikörper bestätigte die Ergebnisse des Northern Blot: kein Nachweis in Normalgehirn, schwache Färbung im Astrozytomen und Medulloblastom und deutliche Färbung im Glioblastom von Tumor- und Endothelzellen (Abb. 17).

Fluoreszenzfärbung mit Anti-mt1-MMP Antikörper und Auswertung mittels Konfokaler Laserscanning Mikroskopie verdeutlichte nochmals besonders die ZelloberflächenLokalisation von mt1-MMP; es handelt sich hierbei um Glioblastom-Gewebe (Abb. 18).

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Abb. 11: Immunfärbung von Glioblastom-Gewebe (Probe 13) mit monoklonalen mt1-MMP-Antikörpern. Orginal-Vergrößerung x788.

Abb. 12: Immunfärbung von Glioblastom-Gewebe (Probe 13) mit monoklonalen Gelatinase A-Antikörpern. Orginal-Vergrößerung x788.

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Abb. 13: Immunfärbung mit monoklonalen Gelatinase A-Antikörpern (a bis d) und monoklonalen mt1-MMPAntikörpern (e bis h) von Normalgehirn (a und e; Sektionsgewebe), niedriggradigem Astrozytom (b und f; Probe 6), Glioblastom (c und g; Probe 13) und Medulloblastom (d und h; Probe 16). Orginal-Vergrößerung x313.

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Abb. 14: Immunfärbung mit monoklonalen Gelatinase A-Antikörpern (a) und monoklonalen mt1-MMPAntikörpern (b) von Probe 16: Desmoplastisches Medulloblastom. Orginal-Vergrößerung x313.

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Abb. 15: Immunfärbung mit polyklonalen Gelatinase B-Antikörpern (a bis d) und polyklonalen TIMP-2Antikörpern (e bis h) von Normalgehirn (a und e; Sektionsgewebe), niedriggradigem Astrozytom (b und f; Probe 6), Glioblastom (c und g; Probe 13) und Medulloblastom (d und h; Probe 16). Orginal-Vergrößerung x313.

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Abb. 16: Immunfärbung mit polyklonalen Gelatinase B-Antikörpern und polyklonalen TIMP-2-Antikörpern von Purkinje-Zellen aus peritumorösem gesundem Kleinhirngewebe (Probe 16: Medulloblastom). Orginal-Vergrößerung x125.

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Abb. 17: Immunfärbung mit monoklonalen TIMP-1-Antikörpern von Normalgehirn (Sektionsgewebe), niedriggradigem Astrozytom (Probe 6), Glioblastom (Probe 13) und Medulloblastom (Probe 16). Orginal-Vergrößerung x313.

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Abb. 18: Immunfluoreszenz (Cy3) mit monoklonalen mt1-MMP-Antikörpern von Glioblastom-Gewebe (Probe 13) im Konfokalen Lasserscanning Mikroskop. Orginal-Vergrößerung x400.

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Diskussion

Gliome und Medulloblastome sind hochinvasive neuroektodermale Tumoren. Degradierung extrazellulärer Matrix ist eine Voraussetzung für den invasiven Phänotyp (Matrisian, 1992). Es ist bekannt, daß Mitglieder der MMP-Genfamilie an diesem Prozeß unmittelbar beteiligt sind (Rao et al. 1993). Die MMP-Regulation ist sehr komplex und findet überwiegend auf der Ebene der Genexpression statt. Eine zweite Ebene der Regulation ist die Aktivierung der sezernierten Proenzyme (Woessner, 1991). Um die Rolle der einzelnen MMP im Invasionsprozeß zu untersuchen ist es somit notwendig, nicht nur ihre Expression zu bestimmen, sondern auch, ob die Enzyme in ihrer aktiven Form vorliegen. Schließlich werden MMP durch TIMP spezifisch inhibiert, dies ist die dritte Ebene der Regulation. Um das Profil der MMP-Netto-Aktivität in einem Gewebe zu charaktersieren, müssen somit alle drei Regulationsebenen detailliert untersucht werden: Die Expression, die Aktivierung und die Inhibition. In dieser Arbeit wurde in Glioblastomen eine Hochregulation von mt1-MMP mRNA zusammen mit einer hohen Expression von Gelatinase A gefunden. Dieses Muster wurde auch in Medulloblastomen beobachtet. Dort waren allerdings die mRNA-Mengen der beiden Enzyme nicht so sehr erhöht, wie in den Glioblastomen. Die mt1-MMP wurde immunhistochemisch auf der Zelloberfläche lokalisiert, während Gelatinase A im Zytoplasma der Tumorzellen gefunden wurde. Eine Hochregulation der Gelatinase B Expression wurde in drei Glioblastomen gefunden. Mittels Gelatine-Zymographie wurde aktivierte Gelatinase A und aktivierte Gelatinase B in allen Glioblastomen nachgewiesen. Die unterschiedlichen Ergebnisse innerhalb einer Tumorgruppe sind sicher auch auf die Heterogenität des Tumorgewebes zurückzuführen, d.h. daß z.B. bei verschiedenen Gewebsproben ein jeweils anderes Verhätnis von vitalem Tumorgewebe, Nekrose und noch gesundem Gehirngewebe vorlag.

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Membrane-type Matrix Metalloproteinasen und Gelatinase A Gelatinase A war im Normalgehirn kaum nachweisbar, während sich in niedriggradigen Astrozytomen schon deutlich erhöhte Spiegel fanden, die schließlich in Glioblastomen nochmals um den Faktor 13 erhöht waren. Mt1-MMP war im Normalgehirn ebenfalls kaum nachweisbar, zeigte in niedriggradigen Astrozytomen schon erhöhte Spiegel, die in Glioblastomen nochmals um den Faktor 12 erhöht waren. Nakano et al. untersuchten insgesamt 17 Gliom-Gewebsproben und 3 NormalgehirnGewebsproben mittels Northern blot auf ihren Gelatinase A mRNA-Gehalt (Nakano et al. 1995). Sie fanden bereits in Normalgehirn eine schwache Expression von Gelatinase A. Im Einklang mit dieser Studie war Gelatinase A proportional zur Gliom-Malignität erhöht: In niedriggradigen und anaplastischen Astrozytomen dreifach und in Glioblastomen sechsfach gegenüber Normalgehirn. Sawaya et al. vom M.D. Anderson Cancer Center, Houston, aus der Arbeitsgruppe um J.S. Rao, untersuchten niedriggradige und anaplastische Astrozytome sowie Glioblastome (n= jeweils 6) mittels Northern Blot auf Gelatinase A mRNA und mittels ELISA und Immunhistochemie auf Gelatinase A Protein (Sawaya et al.

1996). Durch Gelatine-

Zymographie wurde die Gelatinase A Aktivität gemessen. Bei der Zymographie war die Intensität der Progelatinase A Banden in anaplastischen Astrozytomen und Glioblastomen signifikant stärker als in Normalgehirn und niedriggradigen Astrozytomen. Die aktive Form der Gelatinase A wurde nur in den GlioblastomGewebsproben deutlich gesehen, nur in den anaplastischen Astozytomen war sie noch, allerdings nur sehr schwach, sichtbar. Die densiometrische Ausmessung der Progelatinase A Banden ergab bei anaplastischen Astrozytomen eine dreifach höhere Extinktion und bei Glioblastomen eine siebenfach höhere Extinktion als bei niedriggradigen Astrozytomen. Bei der Quantifizierung mit ELISA ergaben sich identische Verhältnisse, ebenso bei der Quantifizierung der mRNA im Northern blot. Die Immunhistochemie bestätigte die Ergebnisse semiquantitativ. In der vorliegenden Studie war der Gelatinase A Anstieg im Malignisierungsprozess der Gliome noch etwas eindrucksvoller als bei Sawaya et al..

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Yamamoto et al., ebenfalls aus der Arbeitsgruppe um J.S. Rao, untersuchten später niedriggradige und anaplastische Astrozytome, Glioblastome und Gehirnmetastasen von Adenokarzinomen der Lunge auf ihren mt1-MMP mRNA-Gehalt und den Aktivierungsstatus von Gelatinase A (Yamamoto et al. 1996). Im Northern blot und der PCR zeigten sich in malignen Astrozytomen deutlich mehr mt1-MMP mRNA als in niedriggradigen Astrozytomen und Normalgehirn. Im Northern blot wurde in Normalgehirn keine (n=1) bzw. nur geringe (n=2) mt1-MMP mRNA-Spiegel gefunden, bei niedriggradigen Astrozytomen (n=4) schon etwa die doppelte Menge, die bei anaplastischen Astrozytomen (n=5) diesen gegeüber nochmals um den Faktor 2,5 und bei Glioblastomen (n=7) um den Faktor 5,5 erhöht waren. Bei den vier untersuchten Gewebeproben von metastasiertem Adenokarzinomen der Lunge wurden mt1-MMP mRNASpiegel gemessen, die zwischen denen der niedriggradigen Astrozytome und denen der Glioblastome, etwa gleich dem Spiegel der anaplastischen Astrozytome lagen. Ebenso zeigte sich in der Immunhistochemie, wie hier, daß mt1-MMP in neoplastischen Astrozyten der malignen Astozytome, nicht aber in normaler weißer Gehirnsubstanz lokalisiert ist. Bei der Gelatine-Substratgelelktrophorese fanden sie ebenfalls in fast allen Gewebsproben eine latente Form der Gelatinase A und in malignen Astrozytomen und Gehirnmetastasen, vor allem aber in Glioblastomen die aktivierte Form der Gelatinase A. Insgesamt zeigte diese Studie, vollständig in Übereinstimmung mit der vorliegenden, eine deutliche Korrelation zwischen einerseits der Expression aktivierter Gelatinase A und mt1-MMP und andererseits dem histologischen Tumorgrad. Zu dieser Studie besteht lediglich ein quantitativer Unterschied: Hier war mt1-MMP-mRNA in Glioblastomen gegenüber niedriggradigen Astrozytomen um den Faktor 12, dort um den Faktor 5,5 erhöht. Insgesamt gehen erhöhte Mengen mt1-MMP mit der vermehrten Expression aktivierter Gelatinase A einher und korrelieren eng mit der malignen Progression von Gliomen. Diese Daten legen insgesamt nahe, daß mt1-MMP essentiell für die Aktivierung von Progelatinase A ist. Jedoch ist es nicht ausreichend für diesen Prozess: Ein Progelatinase A – TIMP-2 – Komplex ist zusätzlich erforderlich (s.u.). Nakada et al., aus der Arbeitsgruppe um H. Sato, fanden in einer aktuellen Studie mittels Enzyme Immuno Assay ebenfalls eine deutliche Zunahme von Gelatinase A bei der malignen Progession von Gliomen (Nakada et al. 2001). Die produzierte Menge an Gelatinase A war in 30 Glioblastomen mit durchschnittlich 0,041 nmol/g Protein viel höher als die in den elf

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untersuchten anaplastischen Astrozytomen (0,019 nmol/g Protein), den acht niedriggradigen Astroszytomen (0,014 nmol/g Protein), den acht Normalgehirn-Gewebsproben (0,007 nmol/g Protein) und auch den zehn Gehirnmetastasen (0,015 nmol/g Protein; primär: Adenokarzinom der Lunge). In der quantitativen RT-PCR fanden Nakada et al. in den Glioblastomen wesentlich mehr mt1-MMP-mRNA

als

in

anaplastischen

und

niedriggradigen

Astrozytomen

und

Normalgehirn.

In einer früheren Studie untersuchten Nakada et al. mittels Northern blot und RT-PCR Gliome auf mt1-3MMP (Nakada et al. 1999). Für mt1-MMP fanden sie im Northern blot ein starkes Signal in 6/6 Glioblastom-Gewebsproben und keinen Nachweis einer Hybridisierung in Normalgehirn-Gewebsproben. In der RT-PCR fanden sie mt1-MMP-mRNA in 17/17 Glioblastomen und 4/4 Gehirnmetastasen primärer Adenokarzinome der Lunge, während es nur in 2/9 anaplastischen Astrozytomen, 0/9 niedriggradigen Astrozytomen und 0/5 Normalgehirn-Proben gefunden wurde. Mt2-MMP mRNA fanden sie im Northern blot in 5/6 Glioblastomen. In der RT-PCR fanden sie mt2-MMP exprimiert in 12/17 Glioblastomen und 4/4 Gehirnmetastasen, aber nur in 2/9 anaplastischen Astrozytomen, 0/9 niedriggradigen Astrozytomen und 0/5 Normalgehirn-Proben. Mt3-MMP schließlich war im Northern blot nicht auffindbar, in der RT-PCR jedoch, allerdings nur mit einem Fünfzigstel der oben gemessenen Mittelwerte, in 12/17 Glioblastomen, 4/9 anaplastischen Astrozytomen, 6/9 niedriggradigen Astrozytomen und sogar in 5/5 Normalgehirn-Proben, jedoch in keiner der vier Metastasen. Also gab es insgesamt keine Korrelation zwischen der mt3-MMP-Expression und dem histologischen Tumorgrad der Gliome. Für mt1-MMP und mt3-MMP bestätigen diese Befunde die vorliegende Studie, bezüglich mt2-MMP wurde hier jedoch eine konstitutive Expression gefunden, nicht wie dort ein Anstieg parallel zum Malignitätsgrad. Wie diese Studie, beschrieben auch Jäälinojä et al. sowohl bei den niedriggradigen als auch den anaplastischen Gliomen mit Oligo-Komponente deutlich weniger Gelatinase A als bei den im Malignitätsgrad gleichwertigen reinen Astrozytomen (Jaeaelinojae et al. 2000). In dieser Studie ist Probe 7 ein Oligo-Astrozytom II, Probe 9 ein anaplastisches Oligo-Astrozytom III und Probe 10 ein Glioblastom IV mit noch erkennbaren Oligo-Anteilen. Alle diese Tumoren weisen innerhalb ihrer Gruppe den mit Abstand niedrigsten Gelatinase A-Gehalt auf. Jäälinojä et al. fanden mittels Immunhistochemie in vier untersuchten Oligodendrogliomen keine Reaktivität für Gelatinase A, während 6/18 Astrozytome positiv waren. Bei den

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anaplastischen Oligodendrogliomen waren nur 1/9 (11%) positiv, bei den anaplastischen Astrozytomen dagegen 6/18 (33%). In einer neuen Studie von Pagenstecher et al. wurden neben den zweit- bis viertgradigen Gliomen erstmals auch erstgradige pilozytische Astrozytome (n=5) und Tumoren aus der Entität der Ependymome (drittgradige anaplastische, n=2) u.a. auf mt1-MMP und Gelatinase A analysiert (Pagenstecher et al. 2001). Dort fand sich im RNase Protection Assay eine konstitutive Expression von Gelatinase A im Normalgehirn. Wie in dieser und den oben beschriebenen Untersuchungen, stieg die Expression von mt1-MMP und Gelatinase A vom Grad II bis zum Grad IV Gliom dramatisch an. Interessanterweise fand sich in den erstgradigen pilozytischen Astrozytomen mehr mt1-MMP- und Gelatinase A-mRNA als in den zweitgradigen fibrillären Astrozytomen, jedoch weniger als in den drittgradigen anaplastischen Astrozytomen. Bei den drittgradigen anaplastischen Ependymomen entsprach der mt1-MMP- und Gelatinase A-mRNA-Gehalt in etwa dem der ebenfalls drittgradigen anaplastischen Astrozytome. Wie in dieser Studie zeigte sich bei den viertgradigen PNET weniger mt1-MMP- und Gelatinase A-mRNA als bei den ebenfalls viergradigen Glioblastomen. Während in der vorliegenden Studie und bei Nakada et al. (Nakada et al. 1999) in allen untersuchten Geweben nur eine schwache Expression von mt3-MMP ohne jegliche Korrelation zur histopathologischen Klassifikation gefunden wurde, zeigte sich bei Pagenstecher et al. in allen untersuchten Geweben eine deutliche Expression. Am wenigsten im Normalgehirn, deutlich mehr in den pilozytischen Astrozytomen und dann aber mit der malignen Progression wieder abnehmende Spiegel an mt3-MMP-mRNA, so daß sich für die niedriggradigen Gliome ein mt1-MMp/mt3-MMP-Verhältnis von kleiner Eins und für die malignen Gliome ein Verhältnis von größer Eins ergab.

Gelatinase B Eine deutliche Hochregulation der Gelatinase B Expression wurde in dieser Studie nur in einem von zwei anaplastischen Astrozytomen und einem von drei Medulloblastomen gefunden während in drei von vier Glioblastomen eine starke Hochregulation gefunden wurde.

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Auch in dieser Hinsicht bestätigt diese Untersuchung die Veröffentlichung von Nakano et al., der in der Gruppe der niedriggradigen und der anaplastischen Astrozytomen nur eine sehr schwache Expression des Gelatinase B Gens fand, jedoch in allen Glioblastomen eine starke Expression (Nakano et al. 1995). Pagenstecher et al. fanden eine insgesamt etwas deutlichere Gelatinase B Expression (Pagenstecher et al.

2001). Sie fanden niedrige Spiegel in einigen pilozytischen

Astrozytomen und Oligoastrozytomen, interessanterweise aber keine Expression in fibrillären Astrozytomen und hohe Spiegel bereits in allen anaplastischen Astrozytomen und, wie zu erwarten, Glioblastomen.

Aktivierung der Gelatinasen In dieser Studie wurde mittels Gelatine-Zymographie aktivierte Gelatinase A und aktivierte Gelatinase B in allen Glioblastomen nachgewiesen. Sawaya et al. fanden, in Übereinstimmung damit, die aktive Form der Gelatinase A nur in den Glioblastom-Gewebsproben als deutliche Bande, in den anaplastischen Astozytomen war sie ebenfalls noch sichtbar, allerdings nur sehr schwach (Sawaya et al. 1996). Nakada et al. fanden, ebenfalls in Übereinstimmung mit dieser Studie, in der GelatineZymographie eine in Gliobastomen signifikant höhere Gelatinase A Aktivierung als in anderen Gliomen, Gehirnmetastasen und normalem Gehirngewebe (Nakada et al. 1999). In der in situ Zymographie fanden sie starke gelatinolytische Aktivität in den GlioblastomGewebsproben, jedoch nicht in normalem Gehirngewebe. Die Verteilung der Aktivität stimmte mit der Immunlokalisation der mt1-MMP-, mt2-MMP und Gelatinase-A-Proteine überein: Markiert waren neoplastische Astrozyten. Pagenstecher et al. fanden mittels SDS-PAGE-Zymograpie bereits in niedriggradigen und anaplastischen Astrozytomen gelatinolytische Aktivität, die jedoch in Glioblastomen am ausgeprägtesten war (Pagenstecher et al. 2001). Mittels In-situ-Zymographie lokalisierten sie die gelatinolytische Aktivität in malignen Gehirntumoren in Gefäßwänden und neutrophilen Granulozyten. Gelatinase A und B unterscheiden sich von anderen MMPs durch ihre Fähigkeit, als latente Proenzyme mit TIMP-2, bzw. TIMP-1, zu interagieren (Stetler-Stevenson et al. 1989).

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Der Komplex aus TIMP-2 mit Progelatinase A ist essentiell für die Aktivierung von Progelatinase A. Die Aktivierung von Pro-Gelatinase A findet in vivo auf der Zelloberfläche statt. So aktiviert MT1-MMP Pro-Gelatinase A, jedoch nicht Pro-Gelatinase B (Sato et al. 1994). Pro-Gelatinase A bindet an TIMP-2 durch die C-terminalen Domänen beider Moleküle. MT1-MMP auf der Zelloberfläche fungiert als Rezeptor für TIMP-2, welches wiederum an Pro-Gelatinase A bindet. Die Formation dieses Dreierkomplexes ist notwendig für die Bindung von Pro-Gelatinase A an die Zelloberfläche, wo anschließend ihre Aktivierung durch eine nebenstehende freie MT1-MMP stattfindet (Woessner und Nagase, 2000). Weiterhin wurde gezeigt, daß aktivierte Gelatinase A wiederum Progelatinase B aktivieren kann (Fridman et al. 1995). Ebenso können Stromelysin 1 und Plasmin die Gelatinase B aktivieren (Ogata et al. 1992). Jedoch sind in einigen Tumorzellen diese Enzyme nicht immer koexprimiert. Im Gegensatz dazu, wurde eine Koexpression von Gelatinase A und Gelatinase B in verschiedenen Tumorgeweben nachgewiesen (Polette et al. 1993; Fridman et al. 1995). Die Aktivierung von Progelatinase B durch Gelatinase A ist wahrscheinlich in jenen Geweben von Bedeutung, denen Stromelysin-1 fehlt. Somit ist folgende proteolytische Kaskade zur Steigerung der Degradierung extrazellulärer Matrix in malignen Giomen anzunehmen: Erhöhte Expression von mt1-MMP führt zu einer Aktivierung von Gelatinase A, die wiederum Gelatinase B aktiviert. Die Ergebnisse dieser vergleichbarer anderer Untersuchung unterstützen diese Hypothese (Yamamoto et al. 1996; Forsyth et al. 1999; Nakada et al. 1999; Pagenstecher et al. 2001; Nakada et al. 2001).

Andere Matrix Metalloproteinasen In der Nothern blot Analyse humaner Gehirngewebe dieser Studie kam keine mRNA von Kollagenasen (1-3), Stromelysinen (1-3), Matrilysin, Metalloelastase und RASI zur Darstellung. In der sensitiveren PCR gelang wiederum kein Nachweis von mRNA von Kollagenase 2, Kollagenase 3 und Stromelysin 2. Schwache Signale ohne jegliche Korrelation zu TumorGrad oder Histologie wurden gefunden für: Kollagenase 1 (ein Glioblastom), Metalloelastase (eine Normalgehirn-Probe, ein Astrozytom, ein anaplastisches Astrozyom), Stromelysin 1 (ein anaplastisches Astrozytom, ein Glioblastom), Stromelysin 3 und RASI (beide waren

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gleichmäßig schwach zu finden in allen untersuchten Geweben). Bei zwei von vier Glioblastomen fanden sich geringe Mengen Matrilysin-mRNA. Ein ähnlicher Befund zeigte sich bei Nakano et al. (Nakano et al. 1995): Sie fanden bei fünf von neun primären Glioblastomen und bei beiden Glioblastom-Rezidiven eine Expression von Matrilysin. Stromelysin 1-mRNA fanden sie in keinem ihrer untersuchten Gliome. Die Überexpression von Matrilysin wurde in der Literatur hautpsächlich in humanen Brustund Kolonkarzinomen beschrieben (Basset et al. 1990; Yamamoto et al. 1994). Nakagawa et al. fanden 1994 in einer immunhistochemischen Studie eine schwache Färbung von Stomelysin 1 bei 0/4 niedriggradigen Astrozytomen, 2/6 anaplastischen Astrozytomen, 2/5 Glioblastomen und 3/6 Adenokarzinom-Gehirnmetastasen (Nakagawa et al. 1994). Die Färbung für Kollagenase 1 war bei allen niedriggradigen Astrozytomen negativ, bei 4/6 anaplastischen Astrozytomen schwach bis deutlich positiv, bei allen Glioblastomen schwach bis stark positiv und bei allen Adenokarzinom-Gehirnmetastasen deutlich bis stark positiv. Béliveau et al. fanden Metalloeastase-Expression im Western blot in etwa gleicher Menge in pilozytischen, niedriggradigen und anaplastischen Astrozytomen sowie Glioblastomen, jedoch nicht in anaplastischen Oligoastrozytomen und Gehirnmetastasen aus der Lunge oder von Melanomen (Béliveau et al. 1999). Vince et al. untersuchten zwölf Glioblastome mittels PCR u.a. auf mRNA von Matrilysin und Stromelysin 1 (Vince et al. 1999). Matrilysin wurde mit einem schwachen Signal in den meisten Proben gesehen, während sich Stromelysin 1 nur in einer Probe fand. Außerdem untersuchten sie sechs Glioblastome immunhistochemisch. Für Matrilysin zeigte sich bei einer Probe eine schwache Färbung, für Stromelysin 1 war keine Probe positiv. Pagenstecher et al. untersuchten ebenfalls Gliome und Medulloblastome im Northern Blot u.a. auf Kollagenase 1, Kollagenase 3, Stromelysin 1, Matrilysin und Metalloelastase und fanden bei einem einzigen pilozytischen Astrozytom eine Expression von Stromelysin 1 und bei einem einzigen Glioblastom eine Expression von Metalloelastase (Pagenstecher et al. 2001). Stromelysin 2 und Kollagenase 1 wurden bisher hauptsächlich in Epidermoidkarzinomen von Kopf und Hals gefunden (Kohn and Liotta, 1995). Diese Untersuchungen legen insgesamt nahe, daß es eine organ- oder zelltypspezifische Expression bestimmter Mitglieder der MMP-Genfamilie in malignen Tumoren gibt. Die hier vorliegenden Ergebnisse implizieren außerdem, daß das mt1-MMP / Gelatinase A System in malignen Gliomen eine sehr viel wichtigere Rolle spielt,als andere MMP.

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Diese Hypothese wird auch durch eine Untersuchung von Deryugina et al. bestätigt, die zeigten, daß Gliomzellen, die mit mt1-MMP cDNA transfiziert wurden, folgende Veränderungen aufwiesen: Vermehrte Exprimierung von mt1-MMP und TIMP-2 an der Zelloberfläche, daraus folgende Aktivierung des Gelatinase A Proenzyms, vermehrte Kollagen-Degradierung und Zellmigration im „tumor spheroid outgrowth assay“ (Deryugina et al. 1997).

„Tissue Inhibitors of Metalloproteinases“ Einige Studien haben erklärt, daß die Balance zwischen MMP und ihren Inhibitoren ausschlaggebend für die Kontrolle der Proteolyse ist (Kohn und Liotta, 1995). Darum wurde in dieser Untersuchung die auch die Expression von TIMP in Gehirntumoren untersucht. In den Tumoren mit hoher Expression von mt1-MMP und Gelatinase A wurden auch große Mengen von TIMP-1 gefunden. In der Literatur gibt es hinsichtlich der Expression von TIMP in Gliomen widersprüchliche Ergebnisse. Mohanam et al. berichteten, daß TIMP-1 und TIMP-2 in normalem Gehirngewebe und in Tumorgewebe exprimiert werden, aber in hochinvasiven Glioblastomen wesentlich niedriger sind (Mohanam et al. 1995). Niedriggradige ZNS-Tumoren könnten so proportional mehr TIMP produzieren, als höhergradige Tumoren, was den unterschiedlichen Grad der Invasivität erklären würde. Jedoch fanden wir, in Übereinstimmung mit den Ergebnissen von Nakano et al. (Nakano et al. 1995), Pagenstecher et al. (Pagenstecher et al. 2001) und Groft et al. (Groft et al. 2001), daß die Überexpression von TIMP-1 mit dem Malignitätsgrad des jeweiligen Glioblastoms und der Überexpression von mt1-MMP / Gelatinase A proportional in Zusamenhang steht. Somit ist es denkbar, daß die Überexpression von TIMP-1 eine übermäßige MMP-Aktivität verhindert, übermäßiger Proteolyse entgegensteuert. Die Arbeit von Pagenstecher et al. bestätigt ebenfalls dieses Ergebnis (Pagenstecher et al. 2001). Bei ihnen zeigten im RNase protection assay alle malignen Tumoren eine Hochregulation von TIMP-1, während keiner der zweitgradigen Astrozytome oder Oligoastrozytome diese Hochregulation aufwiesen. Interessanterweise zeigten alle benignen pilozytischen Astrozytome eine TIMP-1 RNA-Expression in Höhe der malignen Gliome. Nakada et al., aus der Arbeitsgruppe um H. Sato, fanden in einer aktuellen Studie mittels Enzyme Immuno Assay ebenfalls eine deutliche Zunahme von TIMP-1 bei der malignen

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Progession von Gliomen, wobei die höchten Werte in Metastasen (primär: Adenokarzinom der Lunge) gemessen wurden (Nakada et al. 2001). Die Mengen an produziertem TIMP-1 in den Gewebsproben der 30 untersuchten Glioblastome (0,388 nmol/g Protein) und der 10 Gehirnmetastasen (0,731 nmol/g Protein) waren viel höher als die in den elf anaplastischen Astrozytomen (0,088 nmol/g Protein), den acht niedriggradigen Astrozytomen (0,024 nmol/g Protein) und den acht untersuchten Normalgehirn-Proben (0,021 nmol/g Protein). In dieser Studie wurde eine deutliche TIMP-2 Expression in allen Geweben gefunden. Die 3,5- und 2,3 kb TIMP 2 Transkripte waren am deutlichsten und das kleine Transkript (1,5und 1,0 kb) wurde nur in Glioblastomen gefunden. In neoplastischem Gehirngewebe wurde TIMP-2 immunhistochemisch in einem hohen Prozentsatz an Tumorzellen nachgewiesen. In normalem Gehirngewebe war TIMP-2 in Endothelzellen lokalisiert und erschien sporadisch in Astrozyten und Neuronen. Auch für TIMP-2 widersprechen die Ergebnisse der vorliegenden Studie denen von Mohanam et al. und unterstützen die von Nakano et al. und Groft et al. (Groft et al. 2001). Mohanam et al. fanden im Northern blot für TIMP-2 das gleiche Muster wie für TIMP-1: Eine mit zunehmendem Malignitätsgrad (II-IV) abnehmende Expression (Mohanam et al. 1995). Hier und bei Nakano et al. (Nakano et al. 1995) fand sich eine etwa gleichmäßige Expression von TIMP-2 in Normalgehirn und sämtlichen Gliomen (in dieser Studie einschließlich der Medulloblastome). Nakada et al. fanden mittels Enzyme Immuno Assay ebenfalls keinen Unterschied in den Mengen an produziertem TIMP-2 zwischen den Gliom-Gruppen unterschiedlicher Malignitäts-Grade, jedoch war der TIMP-2-Gehalt in den Gehirnmetastasen etwa um die Hälfte geringer als in den primärenGehirntumoren und auch dem normalen Gehirngewebe (Nakada et al. 2001). Immunhistochemisch fanden Nakada et al., in Übereinstimmung mit dieser Studie, TIMP-1 und TIMP-2 überwiegend in neoplastischen Astrozyten lokalisiert, vereinzelt auch in den Endothelzellen der Blutgefäße. Im Gegensatz dazu fanden Pagenstecher et al. eine TIMP-1 positive Färbung nur in Endothel und Leukozyten, nicht jedoch in Tumorzellen (Pagenstecher et al. 2001). Die konstitutive Expression von TIMP-2 in normalem Gehirngewebe kann noch nicht befriedigend erklärt werden.

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In Gliomen, Medulloblastomen und normalem Gehirngewebe wurde in der RT-PCR dieser Studie eine sehr niedrige Expression von TIMP-3 gefunden, d.h. die TIMP-3-Expression ist unabhänig vom Tumorgrad. Pagenstecher et al. fanden im RNase protection assay ebenfalls eine konstituive Genexpression von TIMP-2 und TIMP-3 (Pagenstecher et al. 2001). Groft et al. fanden in einer Untersuchung von TIMP-1 bis -4 in menschlichen Gliomen (19 Glioblastome, 7 anaplastische Astrozytome, 8 niedriggradige Gliome, 4 NormalgehirnProben) mittels PCR, wie diese Untersuchung, eine positive Korrelation mit dem Tumorgrad für TIMP-1, und für TIMP-2 und TIMP-3 konstante RNA-Spiegel zwischen allen untersuchten Tumorgruppen, wobei TIMP-2 insgesamt deutliche und TIMP-3 nur schwache Banden zeigte (Groft et al. 2001). Die TIMP-4 mRNA-Expression zeigte interessanterweise eine negative Korrelation mit dem Tumorgrad, war aber in allen Tumoren höher als in Normalgehirn. TIMP-1 wurde mittels in situ Hybridisierung im Zytoplasma der malignen Zellen und bei den Glioblastomen auch in (Neo-)Gefäß-Endothelzellen lokalisiert.

Besonderheiten bei Medulloblastomen Charakteristisch für Medulloblastome ist die leptomeningeale Invasion und anschließende liquorgene Aussaat (Deutsch and Reigel, 1980). Obwohl diese Eigenschaft von erheblicher klinischer Relevanz ist, ist der zugrundeliegende Mechanismus noch kaum geklärt. Diese Studie zeigt zum ersten Mal, daß Medulloblastome hohe Mengen MMP exprimieren. Ein interessanter Aspekt wurde in einem desmoplastischen Medulloblastom beobachtet: Die sehr zelldichten mesenchymalen Trabeculae zeigten eine intensive Immunfärbung für Gelatinase A, wohingegen die neuroektodermalen Bezirke eine starke Reaktivität für mt1-MMP zeigten. Dieses besondere Verteilungsmuster ist sehr interessant und könnte bedeuten, daß verschiedene Zellpopulationen interagieren um die Gelatinase A Kaskade zu aktivieren. Die beiden anderen untersuchten Medulloblastome zeigten im Northern blot die höchste Expression von mt2-MMP überhaupt. Dieses membrangebundene Enzym wurde, wie auch mt1-MMP, als Aktivator der Pro-Gelatinase A und des Pro-Gelatinase A–TIMP-2– Komplexes beschrieben (Kolkenbrock et al. 1997).

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Obwohl die kleine Fallzahl noch keine definitive Schlußfolgerung zuläßt, zeigen diese Ergebnisse, daß MMP eine wichtige Rolle im biologischen Verhalten und Verlauf von Medulloblastomen spielen.

In dieser Arbeit wurden zum ersten Mal Astrozytome und Glioblastome auf mt2-MMP und mt3-MMP untersucht, außerdem wurde zum ersten Mal ein umfassendes MMP/TIMP-Profil bei Medulloblastomen erstellt. Die Ergebisse der bis dahin einzigen Studie (Yamamoto et al. 1996) über mt1-MMP und Gelatinase A in Korrelation zum Malignitätsgrad bei Gliomen konnten bestätigt und ergänzt werden (Lampert et al.

1998). Noch nie zuvor waren

Gehirntumoren in einer Studie auf so viele MMP (n=15) und TIMP (n=3) untersucht worden. Noch nie zuvor gab es also ein detaillierteres Profil von MMP und TIMP in menschlichen Gehirntumoren, was eine Koexpressionen von Proteinen oder ein proportionales bzw. antiproportionales Mengenverhältnis der MMP/TIMP zueinander erkennen ließ oder auch Spekulationen über Aktivierungs- und Hemmungskaskaden ermöglichte. Wünschenswert wäre eine Folgestudie mit mehr Gehirntumoren pro Gruppe. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit, daß das mt1-MMP/Gelatinase ASystem für die Mechanismen lokaler Tumorinvasion wie sie in malignen Gliomen auftritt eine Schlüsselrolle spielt. Die Überexpression der MMP ist von einer Hochregulation der TIMP-1 begleitet. Zukünftige Versuche, die MMP-Enzymaktivität spezifisch zu blockieren, oder die lokale TIMP-1 Expression anzuheben, könnten neue Mittel bereitstellen, die Invasivität von Gehirntumoren zu vermindern.

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Zusammenfassung

Ziel dieser Studie war, ein Profil der Expression und Aktivierung von Matrix Metalloproteinasen (MMP) und ihrer spezifischen Inhibitoren (TIMP) in primären menschlichen Gehirntumoren zu beschreiben, und die Proteine im Gewebe zu lokalisieren. Ausganshypothese war, dass es bei der malignen Progression von Gliomen zu einer Zunahme der invasionsvermittelnden MMP und zu einer Abnahme der sie inhibierenden TIMP kommen würde. Untersucht wurden drei niedriggradige Astrozytome, zwei anaplastische Astrozytome, vier Glioblastome und drei Medulloblastome im Vergleich mit normalem Gehirngewebe als Kontrolle. Methodisch kamen zum Einsatz: Northern blot mit densiometrischer Auswertung, PCR,

Zymographie,

Immunhistochemie

einschließlich

Fluoreszenzmarkierung

und

Auswertung mit dem Konfokalen Laserscanning Mikroskop. Es zeigte sich für mt1-MMP und Gelatinase A eine Zunahme der jeweiligen mRNA Spiegel mit dem Malignitätsgrad. Gelatinase B und TIMP-1 waren in den Glioblastomen erhöht. Mt2-MMP und TIMP-2 waren in allen Proben etwa gleich stark exprimiert, mt3-MMP, mt4-MMP und TIMP-3 waren in allen Proben etwa gleich schwach exprimiert. In gemischten Astrozytomen mit Oligo-Komponente war Gelatinase A etwas niedriger exprimiert als in reinen Astrozytomen. In keinem der Tumoren wurden signifikante Mengen von Kollagenasen (1-3), Stromelysinen(1-3), Matrilysin, Metalloelastase und RASI gefunden. Mt1-MMP, Gelatinase A und B, sowie TIMP-1 und –2 waren überwiegend in den Tumorzellen, vereinzelt auch im Endothel der Blutgefäße und Leukozyten lokalisiert. Mt1-MMP zeigte sich ausschließlich in der Zellmembran, die anderen im Zytoplasma. Ein desmoplastisches Medulloblastom war in zweifacher Hinsicht einzigartig: Es zeigte umgekehrte Verhältnisse von mt2-MMP mRNA (nicht nachweisbar) und Gelatinase A mRNA (extrem hoch) im Vergleich zu den beiden anderen Medulloblastomen. Außerdem war die Verteilung der MMP-Proteine innerhalb des Tumors heterogen: Die zellreichen mesenchymalen Trabeculae der Tumorzellen zeigten eine starke Immunfärbung für Gelatinase A, wobei die neuroektodermalen Areale sich überwiegend mit mt1-MMP färbten.

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Danksagung

Herrn Prof. Dr. Benedikt Volk danke ich herzlich für die Überlassung des Themas und die Möglichkeit, mich in einem bestens ausgestatteten Labor frei bewegen zu können. Bedanken möchte ich mich auch für seine Unterstützung bei studienbegleitendenden Projekten, wie z.B. einem Stipendium zum Besuch der Hebräischen Universität Jerusalem. Mein besonderer Dank gilt Frau Dr. Ulrike Tauer und Herrn Dr. Uwe Machein, die viel Zeit und Geduld verwendeten, mich in den immunhistochemischen bzw. molekularbiologischen Methoden dieser Arbeit anzuleiten. Bedanken möchte ich mich auch bei Herrn Dr. Rolf Knoth, Herrn PD Dr. Axel Pagenstecher und Frau Dr. Márcia Machein für die Beantwortung zahlreicher, intermittierend auftretender Fragen. Ebenso gilt mein Dank Frau Irene Lethenet, stellvertretend für die Damen vom Eingangslabor, für die Hilfe beim Paraffin- und Kryoschneiden. Ich möchte mich aber auch bei allen anderen, namentlich hier nicht erwähnten Mitarbeiterinnen und Mitarbeitern der Abteilungen Neuropathologie und Rheumatologie für die gute Zusammenarbeit bedanken. Meine Eltern haben mir dieses Studium im wesentlichen ermöglicht, ihnen sei auch an dieser Stelle nochmals herzlich gedankt. Bei meiner Frau Susanne bedanke ich mich für die Überlassung des Wohnzimmers während der Niederschrift und das Verständnis für die in diese Arbeit investierte Zeit.