Biophysikalische Methoden SS 2010

Biophysikalische Methoden SS 2010 (KELLER)

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Biophysikalische Methoden SS 2010

Inhaltsangabe WICHTIGE INFORMATIONEN ....................................................................................................................... 3 PROBENVORBEREITUNGEN: ........................................................................................................................ 3 DSC – DIFFERENTIAL SCANNING CALORIMETRY ................................................................................. 4 GRUNDLAGEN ..................................................................................................................................................... 4 ZIEL .................................................................................................................................................................... 4 DURCHFÜHRUNG................................................................................................................................................. 4 Probenvorbereitung ....................................................................................................................................... 4 Inbetriebnahme .............................................................................................................................................. 5 Entgasen der Proben ..................................................................................................................................... 5 Wichtige Tipps: .............................................................................................................................................. 5 AUSWERTUNG ..................................................................................................................................................... 5 Aufgaben: ...................................................................................................................................................... 5 CIRCULAR DICHROISM-SPEKTROSKOPIE ............................................................................................... 7 GRUNDLAGEN ..................................................................................................................................................... 7 ZIEL .................................................................................................................................................................... 7 ARBEITSANLEITUNG............................................................................................................................................ 7 Probenvorbereitung ....................................................................................................................................... 7 Inbetriebnahme .............................................................................................................................................. 8 Vorbereiten der Küvetten............................................................................................................................... 8 Auftragen der Probe ...................................................................................................................................... 9 Aufnahme von Spektren ................................................................................................................................. 9 Temperaturscan ........................................................................................................................................... 10 AUSWERTUNG ................................................................................................................................................... 10 FLUORESZENZ ................................................................................................................................................. 11 GRUNDLAGEN ................................................................................................................................................... 11 ZIEL .................................................................................................................................................................. 11 DURCHFÜHRUNG UND AUSWERTUNG ............................................................................................................... 11 Messung ....................................................................................................................................................... 12 THERMOFLUR, THERMAL SHIFT ASSAY ODER DIFFERENTIAL SCANNING FLOURIMETRY 16 GRUNDLAGEN: ................................................................................................................................................ 16 ZIEL: .................................................................................................................................................................... 16 DURCHFÜHRUNG: .......................................................................................................................................... 17 AUSWERTUNG: ................................................................................................................................................ 17 KURZZUSAMMENFASSUNG DER BEISPIELE: ........................................................................................ 18

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Biophysikalische Methoden SS 2010

Wichtige Informationen Um den Start des Praktikums zu erleichtern, machen Sie sich Gedanken, welche Mengen des jeweiligen Proteins Sie im Verlauf des gesamten Praktikums benötigen. Weiters sollten Sie sich überlegen, wie hoch die Konzentration der einzelnen Stocklösungen (Proteine, Liganden, Detergentien) sein muss, um die Konzentrationen in den Proben der einzelnen Beispiele gewährleisten zu können. Bedenken Sie, eine zu hohe Konzentration bedingt, dass sehr kleine Mengen pipetiert werden müssen und es so zu Ungenauigkeiten kommen kann. Eine zu niedrige Konzentration kann im Extremfall dazu führen, dass bei Zugabe des Liganden oder der jeweiligen Detergenzien das Volumen überschritten wird und somit die erwartete Konzentration nicht gewährleistet ist.

Probenvorbereitungen: Es werden alle Stocklösungen für alle Versuche auf einmal vorbereitet d.h. Sie müssen sich im Vorhinein überlegen wie viel Protein und Ligand Sie für alle Versuche zusammen benötigen. Weiters muss gut überlegt werden wie hoch die Konzentration der Stocklösung sein muss damit man bei den einzelnen Versuchen die richtige Konzentration von Protein, Ligand bzw. Detergenz und das richtige Volumen erhält. Angaben zu den Konzentrationen der einzelnen Versuche sind im Kapitel ‚Kurzzusammenfassung der Beispiele‘ zu finden während die Angaben zu benötigten Volumina bei den einzelnen Versuchen zu suchen sind.

Für die Protein-Stocklösung wird das Protein zuerst im zugehörigen Puffer gelöst und anschließend gegen ca. 2L des Puffers dialysiert um eventuellen Verunreinigungen weg zu bekommen. Da die Liganden (für Lysozym: N-Acetyl Chitotetrose; für Rnase 3'CMP) zum Teil zu klein für die Dialyse sind, werden diese am nächsten Tag einfach im Dialysepuffer des Proteins gelöst (selbiges gilt auch für das Detergenz Gd-HCl).

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DSC – Differential Scanning Calorimetry

Grundlagen Die DSC ist eine thermoanalytische Methode, die es erlaubt, thermodynamische Parameter (Wärmekapazität, ΔH, ΔS, Tm etc.) einer Probe zu bestimmen. Messprinzip: Das Gerät enthält zwei Zellen: eine Referenzzelle die mit Wasser oder Puffer gefüllt ist und eine Messzelle, die die Probe (in unserem Fall ein Protein) enthält. In beiden Zellen muss die Temperatur absolut gleich sein. Nun werden beide Zellen einem Temperaturprogramm unterworfen. In unserem Fall werden die Zellen kontinuierlich von 25 °C auf 95 °C aufgeheizt. Irgendwann passiert in der Messzelle etwas, nämlich zu dem Zeitpunkt bzw. bei der Temperatur, bei der das Protein sich zu entfalten beginnt. Je nachdem ob es sich um einen endothermen oder exothermen Vorgang handelt, ändert sich die Wärme in der Messzelle. Da nun aber Referenzzelle und Messzelle immer auf der gleichen Temperatur gehalten werden müssen, muss die Referenzzelle auf diese Änderung reagieren und nachheizen bzw. abkühlen. Diese differentielle Wärmeentwicklung zwischen Mess- und Referenzzelle wird in einem DSC-Experiment gemessen.

Ziel

Ziel des Experimentes ist es, mittels DSC die Entfaltung eines Proteins zu verfolgen und die thermodynamischen Parameter ΔH und Tm zu bestimmen. Durch Vergleichen der thermodynamischen Parameter lässt sich herausfinden, welchen Einfluss ein bestimmter Ligand oder ein bestimmtes Detergenz auf das Protein hat. Durchführung

Probenvorbereitung Ausgehend von den Stocklösungen werden die jeweiligen Proben in den passenden Konzentrationen pipettiert und gemessen (siehe Anhang). Wichtig ist, dass die Proben vor dem Befüllen der Zellen entgast werden.

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Biophysikalische Methoden SS 2010 Inbetriebnahme Bevor man mit den eigentlichen DSC-Scans starten kann, muss das Gerät nach jedem Einschalten

kalibriert

werden.

Zur

Kalibration

werden

sogenannte

‚Wasser-

Scans‘ durchgeführt. Dabei ist zu beachten, dass man jenen Temperaturebereich kalibriert, den man anschließend für seine Protein-Scans verwenden will. Es macht wenig Sinn, einen Temperaturbereich von 20°C bis 90°C zu kalibrieren, wenn man in einem Bereich von 15°C bis 120°C messen möchte!!! Für die Wasser-Scans werden sowohl die Referenz- als auch die Messzelle mit Wasser gefüllt und das ganze Messprogramm durchlaufen. Wichtig ist, dass die Proben – weder bei den ‚Wasser-Scans‘ zur Kalibration, noch bei den eigentlichen Proben Luftblasen bilden bzw. enthalten. Daher müssen die Proben unbedingt entgast werden.

Entgasen der Proben Bevor eine Probe in die Zelle eingefüllt werden kann, muss zuerst jegliche Luft aus der Probe entfernt werden, d.h. die Proben mit einem Volumen von ca. 2ml werden etwa 10 bis 15 Minuten vor der Befüllung entgast.

Wichtige Tipps: Einstellen der Scanparameter sowie das Befüllen werden in Beisein eines Betreuers durchgeführt. Das Refill der Probe ist nur in einem bestimmten, vom Computer vorgegebenen, Zeitrahmen möglich. Verpasst man dieses Zeitfenster, so muss man den nächsten Scan abwarten, bevor man die Probenzelle neu befüllen kann. Bitte bedenken Sie auch, dass die Probe in diesem Zeitfenster bereits entgast sein muss.

Auswertung

Die Auswertung wird im Programm VPViewerDSC durchgeführt. Aufgaben: Bestimmen und vergleichen Sie die ΔH und Tm – Werte der verschiedenen Kurven! Wie könnte sich die Bindung eines Liganden auf die Stabilität des Proteins auswirken? Sieht man eine Änderung durch einen Vergleich der Kurven? Warum ist der Peak nach der 2. Messung niedriger als nach der 1. Messung? 5

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Abbildung 1: Bestimmung thermodynamischer Parameter

Abbildung 1 zeigt, welche thermodynamischen Parameter man aus einer DSC-Kurve erhalten kann. Für die Bestimmung von ΔH muss die Fläche unter der Kurve integriert werden. Zuvor sind allerdings noch einige Prozessierungsschritte nötig: zuerst wird die Puffer-Kurve von der Protein-Kurve abgezogen („substract

reference“). Anschließend wird die Protein-

Konzentration der gemessenen Probe eingetragen (unter „normalize concentration“). Nun ist es möglich, Bereiche der Kurve zu entfernen, z.B. den Anfangsbereich in dem die Kurve nicht schön verläuft („Data“ → “remove bad data points“ → die Pfeile verschieben → „Enter“ → mit der „Delete“-Taste den markierten Bereich entfernen).

Nun geht es darum, die

Baseline optimal zu setzen. Für die Baseline wird eine

Kurve gefittet, die den

gefalteten Zustand (Δcp folded) mit dem ungefalteten Zustand (Δcp unfolded) optimal verbindet. Mit „start baseline session“ → „adjust“ → „refit left/right segment“ ist es möglich, Geraden in die Ausläufer der linken und rechten Seite des Peaks zu legen und so die Lage der Baseline entscheidend zu beeinflussen. Unter „Baseline“ → „progress baseline“ kann man aus mehreren Modellen wählen, hier muss man durch Ausprobieren den schönsten Verlauf finden. Hat man die Baseline passend gesetzt, bestätigt man mit „OK“ → „Yes“. Schließlich wird die Kurve gefittet, um die thermodynamischen Parameter berechnen zu lassen: „DSC“ → „2 state cursor init“. Mit einem Doppelklick auf die Peakspitze definiert man die Peakhöhe. Nun wird durch einen Klick auf „100 Iter.“ eine Kurve gefittet. Das wiederholt man nun so oft, bis sich die Kurve nicht mehr verändert. Mit „Done“ erhält man die gefittete Kurve mit den daraus berechneten thermodynamischen Parametern. 6

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Circular Dichroism-Spektroskopie

Grundlagen CD-Spektroskopie ist eine beliebte Methode um Aussagen über die Struktur von asymmetrischen Molekülen, wie Proteine zu erhalten. Um Information über die Sekundärbzw. Tertiärstruktur zu bekommen wird der ferne UV-Bereich von 185 nm bis 260 nm verwendet. Dabei kommt es zur Wechselwirkung zwischen linear polarisiertem Licht und dem Protein beim Durchtritt des Lichtes durch die Probe. Diese Wechselwirkung führt zu einem Extinktionsunterschied von rechts und links zirkulierendem Licht (aus dem das linear polarisierte Licht zusammengesetzt ist), welcher gemessen wird. Die unterschiedlichen Sekundärstrukturen (α-Helices, β-Faltblätter) führen zu charakteristischen Maxima und Minima in den Spektren mit deren Hilfe man Aussagen über die Gesamtstruktur bzw. Anteile der jeweiligen Sekundärstruktur treffen kann. Kommt es durch Zugabe von Detergentien oder Temperaturerhöhung zu Entfaltung/Denaturierung, so kann man diese durch Abnahme der Maxima

und

Minima

verfolgen.

Für

Stabilitätsuntersuchungen

werden

die

Schmelztemperaturen der freien Proteine und der Lignad-gebundenen Proteine ermittelt und miteinander verglichen.

Ziel Ziel dieses Experimentes ist es, zu Verfolgen, ob durch Zugabe von Liganden bzw. Detergentien die Stabilität der Proteine beeinflusst wird Arbeitsanleitung

Probenvorbereitung Für jede Messung wird ein Volumen von 200 µl Probe benötigt, wobei die Proteinkonzentration 1 mg/ml (Ausnahme Myoglobin: 0.5 mg/ml) beträgt. Vom jeweiligen Protein (Myoglobin, Lysozym und Rnase A) wird eine Stocklösung in ausreichend hoher Menge und Konzentration hergestellt und gegen den zugehörigen Puffer dialysiert. Auch von den zugehörigen Liganden bzw. Detergentien werden Stocklösungen hergestellt (wieder in ausreichender Menge und Konzentration). Diese Stocklösungen werden aber NICHT DIALYSIERT, sondern nur im dazugehörigen Dialysepuffer gelöst. 7

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Ausgehend von den Stocklösungen werden die jeweiligen Proben in den passenden Konzentrationen pipettiert und gemessen

Inbetriebnahme Das CD gerät muss ständig mit Stickstoff (N2) durchflutet werden. Der Stickstoff Druck muss zwischen 10 und 20 bar betragen und der Stickstoffzufuhr muss als erstes aufgedreht werden.

Das Einstellen und stabilisieren des Drucks kann für Anfänger eine Herausforderung bedeuten, Sie sollten sich dafür Zeit nehmen. Der Druck muss nach dem Einstellen für 10 Minuten stabil bleiben bevor man die Xenon-Lampe einschaltet, der Druck kann an einem Barometer beobachtet werden.

Nach einschalten der Xenon-Lampe wartet man weitere 15 Sekunden bis diese hochgefahren ist und schaltet danach erst das Gerät ein. Diese Reihenfolge ist wichtig und muss unbedingt eingehalten werden. Die Abfolge der Handlungen wird beim Ausschalten des Gerätes einfach umgekehrt: Nach Ausschalten des Gerätes wartet man 15 Sekunden bis es runtergefahren ist und schaltet dann die Xenon-Lampe aus; nach weiteren 10 Minuten kann der Stickstoff abgedreht werden.

Vorbereiten der Küvetten Da man im Laborbetrieb nie wissen kann wer zuletzt mit einem Gerät gearbeitet hat und wie gründlich geputzt wurde ist es sinnvoll die Arbeit mit der Reinigung der Küvette zu beginnen. Die Küvette wird zuerst mit Wasser, dann mit Ethanol oder Isopropanol und abschließend nochmal mit Wasser gespült. Es ist wichtig nicht mit Ethanol oder Isopropanol anzufangen, weil dadurch etwaige Reste einer Proteinlösung in der Küvette ausfallen würden. Die zweite Wasserspülung dient demselben Zweck, Ethanol Reste in der Küvette könnten das Protein in der Lösung ausfällen das man beim nächsten mal in die Küvette pipettiert. Getrocknet wird die Küvette schließlich mit einem Stickstoff-Strahl den man durch die Küvette schießt. Die Stickstoff-Spritze sollte nach öffnen der Leitung permanent geöffnet sein (am Besten schon vor dem Öffnen der Leitung abdrücken und erst nach dem Schließen der Leitung wider auslassen). Da die Küvetten höllisch teuer sind sollte man immer knapp über der Laborbank arbeiten, des weiteren ist zu beachten, dass man sich die Flüssigkeit nicht während man mit 8

Biophysikalische Methoden SS 2010 dem Stickstoff durch eine Öffnung in die Küvette rein bläst, durch die andere Öffnung in die Augen schießt.

Bei besonders hartnäckigem Schmutz verwendet man eine 5% Decon Lösung, notfalls kann die Küvette auch mit Reinigungsmittel erhitzt werden. Im Allgemeinen ist es sinnvoll die Küvette noch bevor man sie putzen beginnt in das CD Gerät zu stellen und ein Spektrum aufzunehmen. Aus diesem Spektrum kann man mit ein wenig Erfahrung abschätzen ob die Küvette ausreichen sauber ist, oder noch gereinigt werden muss.

Auftragen der Probe Die Probe wird in der Regel mit einer 200 µl Transferpette aufgetragen, als Spitze verwendet man lange Gelladespitzen (diese sind in unserem Labor weiß), oder auch normale Spitzen (gelb). Die Küvetten haben unterschiedliche Volumina, bei den meisten kommt man mit 200 µl Probe gut aus, bei dickeren muss man noch einmal pipettieren. In der Küvette sollten nach Auftragen der Probe keine Bläschen oder sonstige Inhomogenitäten zusehen sein (gegens Licht halten und durchschauen!). Eine homogene Schicht kann oft schon mit kleineren Volumina als die Küvette fasst erreicht werden, diese muss jedoch trotzdem vollständig gefüllt werden, weil die Schicht sonst während der Messung zusammensacken könnte.

Aufnahme von Spektren Für die Aufnahme eines Spektrums kann eine normale (ohne Mantel) CD Küvette verwendet werden. Die Schichtdicke sollte möglichst klein sein, um die Störung durch das Lösungsmittel zu minimieren (Ausprobieren wo man noch ein gutes Signal bekommt).

Man nimmt zuerst ein Spektrum zwischen 270 nm und 185 nm auf. Der Sättigungsgrad des Detektors muss bei jeder Messung mitverfolgt werden. Idealerweise sollte man unter 500 bleiben. Geht das nicht, wird man den Scanbereich entsprechend verkleinern müssen: z.B. 270 nm bis 190 nm. Man kann auch versuchen die Probe zu verdünnen oder eine Küvette mit kleinerer Schichtdicke zu verwenden. Hat man einen Bereich gefunden indem man messen kann, nimmt man eine Serie von Spektren auf. Danach misst man den Puffer mit denselben Parametern. (Weiß man die Verdünnung und die Küvette schon im Voraus, ist es sinnvoll mit den Pufferscans zu beginnen. Nach dem Puffer ist das reinigen der Küvette viel einfacher.) 9

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Temperaturscan Für den Temperaturscan müssen die Küvetten mit Mantel und Schlauch verwendet werden. Sie werden auf die gleiche Weise gesäubert und beladen wie die einfachen Küvetten, beim befestigen in der CD-Apparatur müssen sie aber an die Kühl-Schläuche angeschlossen werden. Das System ist dabei selbst erklärend, ein falsches Anschließen ist nicht möglich. Man muss nur sicher gehen, dass man die Schlauchenden gut festgeschraubt hat, damit sie kein Wasser verlieren, aber auch das kann man leicht einschätzen. Zu beachten ist, dass die Schläuche sich nicht im Weg des Lichtstrahls also vor der Küvette befinden dürfen. Die Temperatur Küvetten können außerdem verschlossen werden.

Auswertung Das Programm fragt nach jeder Messung ob man die Messung speichern möchte. Drückt man ja wird eine Temperaturmessung als .jwb file und einfache Spektren als .jws files gespeichert.

Man zieht dann das Pufferspektrum von den Spektren ab und normalisiert die Spektren indem man die molare Elliptizität berechnet. Dazu muss man die Schichtdicke der Küvette und die „molar residue concentration (molare Konzentration der Probe * Anzahl der Peptidbindungen (Anzahl der Aminosäuren – 1)“ der Probe eingeben.

.jwb files können als .jws files exportiert werden. .jws files können zu .txt files konvertiert werden und diese können dann für Secondary Structure prediction verwendet werden. Am besten mit den Programm CDSSTR oder CONTIN. Beide Programme sind von der Dichroweb Seite erreichbar. Eine spannende Neuerung bei der Auswertung ist das Programm CDtools, das ebenso wie die Dichroweb Seite vom Labor von Professor Bonnie Wallace am Birkbeck College, an der University of London zur Verfügung gestellt wird. Auch in CDtools müssen die Spektren als .txt. files importiert werden, dort können sie dann angenehm manipuliert und skaliert werden. Außerdem kann man mit CDtools auch eine Standardabweichung von Spektren berechnen, was den Vergleich ähnlicher Spektren erleichtert.

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Fluoreszenz

Grundlagen

Fluoreszenz ist eine kurzzeitige spontane Emission von Licht beim Übergang eines elektronisch angeregten Systems in den energieärmeren Zustand. Typischerweise ist das emittierte Licht energieärmer als die zuvor absorbierten Photonen. Bei der Anwendung von Fluoreszenzspektroskopie auf Proteine ohne weitere Farbstoffe oder fluoreszierende Kofaktoren kann im Wesentlichen nur die Fluoreszenz von Tryptophan verwendet werden. Da die Absorptionsbanden von aromatischen Aminosäuren bei etwa 280 nm liegen, wird die Emission in einem Bereich von 300 – 350 nm angenommen.

Ziel

Mithilfe der Fluoreszenz wird die Denaturierung von Myoglobin bzw. von Lysozym verfolgt. Um dieses Ereignis nachvollziehen zu können, sollte eine Rotverschiebung bzw. eine Erhöhung der Signalintensität beobachtet werden.

Durchführung und Auswertung Um die richtige Proteinkonzentration zu bestimmen, wird ein Sampel (1 ml) mit 1 mg/ml ohne

Denaturierungsreagenz

vermessen.

Zugleich

wird

neben

der

richtigen

Proteinkonzentration auch das richtige Emmissions- und Absorbtionsmaximum des jeweiligen Proteins festgelegt. Sobald diese Parameter festgelegt sind, wird die Denaturierungskurve mit 20 Proben vorbereitet. Dabei wird die Proteinkonzentration konstant gehalten und die Konzentration des jeweiligen Detergenz variiert. Im Falle von Myoglobin verwenden sie einen Gd-HCl Konzentrationsbereich von 0.0 M bis 3.0 M und für das Lysozym einen Bereich von 0.0 M bis 6.0 M Gd-HCl bzw. 0.0 – 10 fach molar TCEP (bezogen auf die Probenkonzentration). Auch hier können Sie für die Berechnung der TCEPStocklösungen eine Proteinkonzentration von 1 mg/ml annehmen. Wichtig ist, dass bei der Vorbereitung der Denaturierungskurve auf genaue Beschriftung geachtet wird! Die Proben für die Denaturierungskurve müssen ca. 1 Stunde inkubieren bevor sie vermessen werden. 11

Biophysikalische Methoden SS 2010 Währen dieser Zeit wird jene Probe mit der höchsten Konzentration an Denaturierungsmittel vermessen um festzustellen wie lange die Proteinentfaltung dauert.

Messung 1. Emissions- und Absorbtionsmaximum des jeweiligen Proteins feststellen Da die Anregungs- wie auch die Emissionsmaxima der Proteine nicht bekannt sind, muss zu Beginn die 0.0M Probe im Fluoreszenzdetektor vermessen werden. Bevor die Küvetten (Achtung: Nur am oberen Rand angreifen, da Fingerabdrücke am Glas das Ergebnis beeinträchtigen können!) mit der Probe beladen werden, sollten diese mit dest. Wasser gespült und danach mit Luftdruck getrocknet werden. Gearbeitet wird mit dem Programm SCAN.

Um das Emissionsmaximum von Myoglobin messen zu können muss im SCAN SETUP Emission aktiviert werden. Als Anregungswellenlänge wird 280nm vorgegeben, da hier die aromatischen Aminosäuren am stärksten absorbieren. Das Emissionsmaximum wird gesucht und daher ein Bereich von 100nm definiert. Da das Maximum bei etwa 330nm zu erwarten ist, wird der Bereich von 300 bis 400nm angegeben. Sind alle Einstellungen gecheckt, bestätigt man mit OK und beginnt die Messung durch den Button START.

SETUP → CARY → DATA MODE → Fluorescence X MODE → Wavelength EXCITATION → 280 nm START → 300 nm STOP → 400 nm Abb.1: Screenshot des Programms SCAN SCAN CONTROL → SLOW → OK → START

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Biophysikalische Methoden SS 2010 Nachdem das Emissionsmaximum des Proteins gefunden wurde, wird die Gegenkontrolle durchgeführt, indem das Absorptions- am Emissionsmaximum gemessen wird. Dazu aktiviert man Excitation und definiert die Parameter ähnlich wie zuvor. Nun wird die Emissionswellenlänge genau angegeben und ein Absorptionsbereich definiert. Diese Gegenkontrolle wird solange wiederholt, bis das Absorptions- mit dem Emissionsmaximum aufeinander abgestimmt ist.

2. Dauer der Entfaltung feststellen Um herauszufinden nach welcher Zeit das Denaturierungsmittel (Guanidin – HCl) das jeweilige Protein entfaltet, misst man die Signalintensitäten gegen die Zeit. Wichtig zu wissen ist, dass eine bestimmte Menge Guanidin – HCl nur eine bestimmte Menge Protein entfalten kann.

Durch diese Messung soll also gezeigt werden, wie lange die Proben vor der Messung inkubiert werden müssen, um vollständige Information aus den Proben erhalten zu können. Damit die Entfaltung von Anfang an beobachtet werden kann, sollte die Probe in der Küvette, die schon im Fluoreszenzdetektor platziert werden sollte, zusammenpipettiert werden (Achtung: Alle Parameter werden schon im Vorhinein am Computer richtig eingestellt, um sofort mit der Messung beginnen zu können!). Klarerweise muss das Guanidin – HCl Reagenz als Letztes zugegeben werden. Damit eine schöne Sättigungskurve entstehen kann, wird über 60 Minuten gemessen. Wie man in Abbildung 2 sieht, tritt die Entfaltung nach etwa 35 Minuten ein. Die gewünschte Konzentrationsreihe sollte also schon 35 Minuten vor der Messung fertig sein  für den Entfaltungstest werden für Myoglobin eine Gd-HCl Konzentration von ~ 3 M verwendet und für Lysozym ~ 6 M. Entfaltungskurve Myoglobin (3.1M Guanidin-HCl)

Intensität

280 275 270 265 260 255 250 245 0

10

20

30

40

50

60

70

min

Abb.2: Denaturierungskurve von Myoglobin in 3.1M Guanidin – HCl 13

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3. Denaturierungskurve abhängig von verschiedenen Guanidin - HCl Konzentrationen Tryptophan ist an der Oberfläche wie auch im Inneren von Proteinen lokalisiert. Tritt eine Denaturierung ein, sind die Aminosäuren, die zuvor im Inneren gelegen sind, von außen zugänglich und können somit durch Licht angeregt werden. Diese tragen somit zu einem erhöhten Fluoreszenzsignal bei. Um die Denaturierung auf die steigenden Guanidin - HCl Konzentrationen beziehen zu können, werden die 20 verschiedenen Proben nacheinander im Detektor vermessen.

Abb.3: 20 verschiedene Emissionskurven, die von den jeweiligen Guanidin – HCl Konzentration abhängig sind

Schlussendlich sollen die Guanidin - HCl Konzentrationen mit den dazugehörigen Emissionsmaxima in Beziehung gebracht werden, wobei das Resultat, wie in Abbildung 4 zu sehen ist, einer Sättigungskurve entsprechen sollte.

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Myoglobin-Denaturierungskurve 350

Intensität

300 250 200 150 100 50 0 0

1

2

3

4

Guanidin-HCL-Konzentration (M)

Abb.4: Auf die unterschiedlichen Guanidin – HCl Konzentrationen bezogene Denaturierungskurve von Myoglobin

4. Denaturierungskurve bezogen auf die Wellenlänge Da Tryptophan in polarer Umgebung eine rotverschobene Fluoreszenz zeigt, kann über die Messung des Emissionsspektrums auf die Polarität der Umgebung geschlossen werden. Das Emissionsmaximum in unpolarer Umgebung (also im Inneren des Proteins) liegt bei ca. 335nm, während eine Verschiebung auf etwa 350nm in polarer Umgebung entsteht. Genau dieses Phänomen kann in unserem Experiment dazu genutzt werden, um die Denaturierung von Myoglobin nachvollziehen zu können. Gelingt das Experiment, sollte bei steigender Guanidin – HCl Konzentration ein Shift des Emissionsmaximums entstehen.

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Thermoflur, Thermal Shift Assay oder Differential Scanning Flourimetry Grundlagen: Bei der Thermoflur Messung wird ein Fluorophore das von Wasser gequencht wird als Sonde für die Entfaltung eines Proteins als Funktion der Temperatur verwendet. Das Fluorophore interagiert mit dem Protein über ionische und hydrophobe Wechselwirkungen. Da das Fluorophore von Wasser gequencht wird, ist es in Wasser nicht sichtbar. Wird es in einem hydrophoben Pocket eines Proteins gebunden, wird es dort vor dem Wasser geschützt und kann daher zur Fluoreszenz angeregt werden. Proteine sind meistens so aufgebaut, dass ihre im nativen Zustand dem Wasser zugewandten Oberflächen hydrophil sind und daher das Fluorophore entweder gar nicht binden, oder zumindest nicht vor dem Quenching schützen (ionische Wechselwirkung alleine verhindert noch kein Quenching). Daher gibt es nur ein relativ geringes Grundsignal. Bei der Entfaltung des Proteins wird der hydrophobe „core“ nach außen gedreht, dadurch kann das Fluorophore in hydrophoben pockets gebunden werden und das führt zu einer massiven Zunahme der Fluoreszenz, die dann gemessen werden kann. Das Ergebnis ist dann (in der Theorie) eine sigmoidale Kurve aus der die Schmelztemperatur errechnet werden kann. In der Praxis sieht man aber nie eine richtige sigmoidale Kurve, weil erstens die Fluoreszenz mit der Zeit gequencht wird, zweitens durch Präzipitation Protein aus der Lösung entfernt wird und drittens die Fluoreszenz des Fluorophores bis zu einem bestimmten Grad von der Temperatur abhängig ist. Das führt dazu, dass die sigmoidale Kurve nach der Messung mehr die Form eines DSC Peaks (siehe weiter oben) annimmt. Das sollte aber nicht dazu verleiten die Kurve auch wie ein DSC Peak zu fitten, vielmehr muss sie trotzdem wie eine sigmoidale Kurve gefittet werden. Thermofluor Messungen können zur Bestimmung von Dissoziationskonstanen (Kd) und zum Screening von Liganden und besonders guten Pufferbedingungen für Proteine verwendet werden.

Ziel: Das Ziel des Praktikums ist die erfolgreiche Durchführung einer Thermofluor Messung mit verschiedenen Proteinen unter verschiedenen Bedingungen und mit verschiedenen Liganden. Außerdem sollen die Kurven in hinsicht auf Schmelztemparatur (Tm), der van’t Hoff Enthalpie und Dissoziationskonstante (Kd) gefittet werden. Da das ein neues Gerät in unserem Repertoir ist, möchten wir die Praktikumsbeispiele in Kombination mit DSC und 16

Biophysikalische Methoden SS 2010 eventuell auch CD und ITC zur Validierung des Gerätes bei der Bestimmung von Dissoziationskonstanten (Kd) und andere thermodynamischen Parametern nutzen.

Durchführung: Thermofluor Messungen können in qPCR Geräten im 96-well plate format durchgeführt werden. In der ersten Reihe von A1 – A12 wird eine Verdünnungsreihe des Liganden vorgelegt. In der zweiten Reihe von B1 – B12 wird zuerst Puffer, dann 1 x Sypro orange (Fluorophore) vorgelegt. Dann wird von der Verdünnungsreihe jeweils die im Voraus berechnete Menge an Ligand zu Puffer und Sypro orange pipettiert. Ganz am Ende wird das Protein so dazugegeben, dass es überall eine Konzentration von 0,5 mg/ml haben soll. Die Gesamtvolumina sollen 40µl betragen. Das Sypro orange wird aus einem 5000x Stock zu nächst in Wasser (damit wir es mit allen Proteinen verwenden können, sonst im Puffer des interessierenden Proteins) 1:100 verdünnt. Aus dieser 50x Lösung soll dann berechnet werden, wie viel in ein 40µl Gesamtvolumen pipettiert werden muss, damit die Konzentration am Ende 1x ist.

Auswertung: Siehe Praktikum

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Kurzzusammenfassung der Beispiele: Puffer-Herstellung:

Für Rnase: 50 mM Kalium-Acetat pH 5.5 Für Myoglobin: 50 mM Na-Phosphat pH 7.0 Für Lysozym: 20 mM TRIS, 50 mM NaCl pH 7.5

DSC-Beispiele: 1.) Myoglobin (1 mg/ml) + Gd-HCl: a. Puffer/Puffer b. Myoglobin Scan (1 mg/ml) c. Myoglobin (1 mg/ml) + 1 M Gd-HCl d. Myoglobin (1 mg/ml) + 3 M Gd-HCl 2.) Rnase (1 mg/ml) + 3’CMP a. Puffer/Puffer b. Rnase-Scan (1 mg/ml) c. Rnase (1 mg/ml) + 0.5 fachen molaren Überschuss d. Ranse (1 mg/ml) + 5 fachen molaren Überschuss 3.) Lysozym (1 mg/ml) + Ligand a. Puffer/Puffer b. Lysozym (1 mg/ml) c. Lysozym (1 mg/ml) + 2 fachen molaren Überschuss d. Lysozym (1 mg/ml) + 10 fachen molaren Überschuss 4.) Lysozym (1 mg/ml) + TCEP a. Puffer/Puffer b. Lysozym (1 mg/ml) c. Lysozym (1 mg/ml) + 2 fachen molaren Überschuss TCEP d. Lysozym (1 mg/ml) + 10 fachen molaren Überschuss TCEP

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Biophysikalische Methoden SS 2010 UV/Fluoreszens (die hier angegebenen Proteinkonzentrationen dienen nur als Anhaltspunkt für die Berechnung der Stocklösungen, die genaue Konzentration muss direkt vor Ort bestimmt werden) 1.) Myoglobin (1 mg/ml) + Gd-HCl (UV) a. Myoglobin + 3 M Gd-HCl über eine Stunde im UV beobachte b. Myoglobin – Gd-HCl Dentaurierungskurve (0.0 M bis ~ 3 M) vermessen 2.) Myoglobin (1 mg/ml) + Gd-HCl (Fluoreszenz) a. Myoglobin + 3 M Gd-HCl über eine Stunde im Fluoreszenz beobachten b. Myoglobin – Gd-HCl Denaturierungskurve (0.0 M bis ~ 3 M) vermessen 3.) Lysozym (1 mg/ml)+ Gd-HCl a. Lysozym (1 mg/ml) + 6 M Gd-HCl über eine Stunde im Fluoreszenz beobachten b. Lysozym (1 mg/ml) – Gd-HCl Denaturierungskurve (0.0 M bis ~ 6 M) vermessen 4.) Lysoym (1 mg/ml) + TCEP a. Lysozym (1 mg/ml) + TCEP (10 facher molarer Überschuss für 1 Stunde beobachten) b. Lysozym (1 mg/ml) + TCEP-Denaturierungskurve von 0 bis 10 fach molarer Überschuss vermessen

CD

1.) Myoglobin (0.5 mg/ml) + Gd-HCl: a. Myoglobin Scan (0.5 mg/ml) b. Myoglobin (0.5 mg/ml) + 1 M Gd-HCl c. Myoglobin (0.5 mg/ml) + 3 M Gd-HCl 2.) Rnase (1.0 mg/ml) + 3’CMP a. Rnase-Scan (1.0 mg/ml) b. Rnase (1.0 mg/ml) + 0.5 fachen molaren Überschuss c. Ranse (1.0 mg/ml) + 5 fachen molaren Überschuss 3.) Lysozym (1.0 mg/ml) + Ligand a. Lysozym (1.0 mg/ml) b. Lysozym (1.0 mg/ml) + 2 fachen molaren Überschuss c. Lysozym (1.0 mg/ml) + 10 fachen molaren Überschuss 19

Biophysikalische Methoden SS 2010 4.) Lysozym (1.0 mg/ml) + TCEP a. Lysozym (1.0 mg/ml) b. Lysozym (1.0 mg/ml) + 2 fachen molaren Überschuss c. Lysozym (1.0 mg/ml) + 10 fachen molaren Überschuss

Thermofluor:

1.) Myoglobin (0.5 mg/ml) + Gd-HCl: a. Myoglobin Scan (0.5 mg/ml) b. Myoglobin (0.5 mg/ml) + 1 M Gd-HCl c. Myoglobin (0.5 mg/ml) + 3 M Gd-HCl 2.) Rnase (0.5 mg/ml) + 3’CMP a. Rnase-Scan(0.5 mg/ml) b. Rnase (0.5 mg/ml) + 0.5 fachen molaren Überschuss c. Ranse (0.5 mg/ml) + 5 fachen molaren Überschuss 3.) Lysozym (0.5 mg/ml) + Ligand a. Lysozym (0.5 mg/ml) b. Lysozym (0.5 mg/ml) + 2 fachen molaren Überschuss c. Lysozym (0.5 mg/ml) + 10 fachen molaren Überschuss 4.) Lysozym (0.5 mg/ml) + TCEP a. Lysozym (0.5 mg/ml) b. Lysozym (0.5 mg/ml) + 2 fachen molaren Überschuss c. Lysozym (0.5 mg/ml) + 10 fachen molaren Überschuss

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