POKYNY NA POUŽÍVANIE – PÔDA V PETRIHO MISKÁCH PRIPRAVENÁ NA POUŽITIE PA-254030.07

Rev.: April 2013

BD Mueller Hinton Agar with 5% Sheep Blood  BD Mueller Hinton Agar with 5% Sheep Blood (150 mm)  BD Mueller Hinton Agar with 5% Sheep blood, Square POUŽITIE Pôda BD Mueller Hinton Agar with 5% Sheep Blood, dostupná v niekoľkých formátoch misiek, sa používa na diskové difúzne testovanie citlivosti klinických izolátov Streptococcus pneumoniae a iných streptokokov, ako je štandardizované Úradom pre klinické a laboratórne normy (Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI).1

PRINCÍPY A VYSVETLENIE POSTUPU Mikrobiologická metóda. Postup Bauer-Kirby je založený na difúzii antibiotík, ktoré sú napustené do papierových diskov, cez agarový gél.2 Pri tomto teste sa štandardizovaná suspenzia organizmu rozotrie na celý povrch pôdy. Papierové disky napustené špecifickým množstvom antibiotických alebo iných bakteriostatických látok sa potom umiestnia na povrch pôdy, miska sa inkubuje a odmerajú sa inhibičné zóny okolo každého disku. Komisia CLSI stanovila normu pre postup Bauer-Kirby, v ktorej nájdete podrobnosti.1 Podľa postupu Bauer-Kirby boli vyvinuté ďalšie národné normy na testovanie citlivosti na antibiotiká. V týchto normách sa môžu hustota očkovacích látok, metóda očkovania, veľkosti výsledných zón a spôsob interpretácie odlišovať od normy komisie CLSI. Kým neexistujú všeobecné európske normy testovania citlivosti, v prípade, že nie je možné uplatniť smernice komisie CLSI, použite národné normy. Napriek tomu, že nedoplnená pôda Mueller Hinton je vhodná na testovanie citlivosti rýchlo rastúcich aeróbnych patogénov, nie je vhodná pre náročnejšie organizmy, napríklad Streptococcus pneumoniae. Dokument komisie CLSI M2 odporúča pôdu Mueller Hinton Agar doplnenú 5 % defibrinovanej ovčej krvi, ako aj podrobnosti o postupoch kontroly kvality a interpretačné kritériá na používanie so S. pneumoniae a inými streptokokmi.1

ZLOŽENIE BD Mueller Hinton Agar with 5% Sheep Blood Zloženie* na jeden liter deionizovanej vody Hovädzí extrakt 2,0 g Kyslý kazeínový hydrolyzát 17,5 Škrob 1,5 Agar 17,0 g Ovčia krv defibrinovaná 5% pH 7,3 +/- 0,2 *Upravené alebo doplnené podľa potreby, aby boli splnené analytické parametre.

UPOZORNENIA Na diagnostiku In Vitro . Iba na profesionálne použitie. Pôdu nepoužívajte, ak nesie známky mikrobiálnej kontaminácie, zmeny farby, vysušenia, prasknutia alebo iné znaky poškodenia. Prílišné zmrštenie tejto pôdy spôsobené vysušením môže viesť k nesprávnym výsledkom citlivosti. Ďalšie informácie o postupoch pri práci s aseptikami, o biologicky nebezpečnom odpade a likvidácii použitého produktu nájdete v dokumente VŠEOBECNÉ POKYNY NA POUŽÍVANIE.

PA-254030.07

-1-

USKLADNENIE A ŽIVOTNOSŤ Prijaté misky s pôdou uskladňujte na tmavom mieste pri teplote 2 až 8 °C v pôvodnom obale až do začiatku používania. Nezmrazujte a nevystavujte nadmerným teplotám. Misky môžu byť naočkované až do dňa exspirácie (uvedeného na obale) a môžu byť inkubované podľa odporúčania. Pôdy z otvorených balení po 10 kusov sa môžu používať jeden týždeň (ak sú uskladnené na čistom mieste pri teplote 2 až 8 °C).

KONTROLA KVALITY UŽÍVATEĽOM

Informácie o kontrole kvality nájdete v príslušnom dokumente komisie CLSI1 alebo v národných normách, ak sú k dispozícii. V zásade postupujte podľa pokynov popísaných v časti Postup testu vrátane kontrolného kmeňa S. pneumoniae ATCC 49619 a používané bakteriostatické disky testujte dvakrát týždenne na správnu účinnosť. Správne priemery zón nájdete v Tabuľke 3A dokumentu komisie CLSI M100, ktorý je súčasťou dokumentu komisie CLSI M21 Vzhľad nenaočkovanej pôdy: červená (farba krvi), nepriehľadná.

POSTUP Dodávaný materiál Pôda BD Mueller Hinton Agar with 5% Sheep Blood (dodávaná v niekoľkých formátoch misiek; pozri BALENIE/DOSTUPNOSŤ). Mikrobiologicky kontrolované. Nedodávaný materiál 1. Živný bujón v 5 ml množstvách, napríklad Mueller Hinton II Broth (BBL Kat. č. 4397701, 16 x 102 mm skúmavka) alebo 0,9-percentný fyziologický roztok na prípravu štandardnej očkovacej kultúry. 2. Norma na porovnanie bária sulfátu (0,5 ml z 0,048 M BaCl2 [1,175 % w/v BaCl22H2O] na 99,5 ml z 0,18 M [0,36 N] H2SO4 [1 % v/v]). 3. Fotometrické zariadenie na prispôsobenie zákalu očkovacej suspenzie tak, aby zodpovedala norme 0,5 McFarlanda. 4. Namiesto hore uvedených materiálov možno použiť zariadenie BD Prompt Inoculation System (odmerné zariadenie na prípravu očkovacej kultúry).1, 3 5. Kontrolná kultúra – Streptococcus pneumoniae ATCC 49619. 6. Papierové disky napustené špecifickým množstvom antibiotík, napr. disky na testovanie citlivosti BD Sensi-Disc. 7. Diskový dávkovač, napríklad 6-, 8- alebo 12-miestny samoaplikačný dávkovač BD Sensi-Disc. 8. Zariadenie na meranie alebo interpretáciu priemerov zón, napríklad posuvné meradlá alebo pravítko. 9. Inkubátor, ktorý produkujte prostredie s obsahom 5 % CO2, alebo iné zariadenie produkujúce podobné prostredie obohatené o CO2. 10. Pomocné kultivačné pôdy, činidlá a potrebné laboratórne vybavenie. Typy vzoriek Tento produkt sa používa na testovanie citlivosti čistých kultúr, ktoré boli izolované z klinických vzoriek (pozrite si aj časť VLASTNOSTI A OBMEDZENIA POSTUPU). Postup testu Metóda priamej suspenzie kolónií sa má používať pri testovaní S. pneumoniae. 1 Používajte aseptickú techniku. 1. Uistite sa, že máte k dispozícii čistú, čerstvú (jeden deň starú) kultúru z neselektívneho krvného agaru. 2. Suspendujte rast v bujóne, ako je napríklad Mueller Hinton II Broth alebo sterilný 0,9percentný fyziologický roztok. Prispôsobte mieru zákalu miere zákalu bária sulfátu (miera 0,5 McFarlanda). Mieru zákalu štandardnej a testovacej očkovacej kultúry treba porovnať PA-254030.07

-2-

3. 4. 5. 6.

7.

tak, že podržíte obidve skúmavky pred bielym pozadím s tenkými čiernymi čiarami, alebo použitím fotometrického zariadenia. Alternatívne metódy prípravy očkovacej kultúry použitím zariadení umožňujúcich priamu štandardizáciu očkovacích kultúr bez úpravy zákalu (napr. zariadenia BD Prompt Inoculation System) sa osvedčili ako prijateľné na rutinné testovacie účely.1, 3 Do 15 minút od úpravy zákalu očkovacej látky ponorte sterilný tampón do dostatočne zriedenej očkovacej látky a silno ním niekoľkokrát zakrúžte proti hornej vnútornej stene skúmavky, aby sa vytlačila nadbytočná tekutina. Celý agarový povrch pôdy BD Mueller Hinton Agar with 5% Sheep Blood naočkujte trikrát, po nanesení každej čiary misku otočte o 60°, aby sa dosiahlo rovnomerné naočkovanie. Nasaďte na misku uzáver a misku nechajte pri izbovej teplote najdlhšie 3 až 15 minút, aby sa povrchová vlhkosť mohla absorbovať skôr, než použijete disky napustené antibiotikom. Použite najviac deväť diskov na jednu misku s priemerom 150 mm alebo štyri disky na misku s priemerom 90 a 100 mm. Pri testovaní S. pneumoniae na penicilín použite disk s obsahom 1 µg oxacilínu.4 Inkubujte 20 až 24 hodín pri teplote 35 °C v prostredí s 5 % CO2.

Výsledky Po inkubácii by mal byť viditeľný súbežný rast. Ak rastú iba izolované kolónie, očkovacia kultúra bola príliš slabá a test treba zopakovať. Posuvnými meradlami, pravítkom alebo šablónou pripravenou na tento účel zmerajte z povrchovej časti misky bez veka priemer zón úplnej inhibície (voľným okom) vrátane priemeru disku pri zaokrúhlení na celé milimetre. 5 Za koncový bod treba považovať oblasť, ktorá nevykazuje žiadny rast viditeľný voľným okom. Nevšímajte si mierny rast drobných kolónií, ktoré môžete s ťažkosťami spozorovať pri okraji inhibičnej zóny. Na pôde BD Mueller Hinton Agar with 5% Sheep Blood zmerajte inhibičnú zónu rastu, nie inhibičnú zónu hemolýzy. Výpočet a interpretácia výsledkov Priemery zón porovnajte s údajmi v Tabuľke 2G pre S. pneumoniae a 2H pre iné streptokoky v dokumente komisie CLSI M100 (M2), kde sú uvedené interpretačné kritéria.1 Získané výsledky možno potom označiť za citlivé, stredne citlivé alebo rezistentné. Použite špeciálne interpretačné kritériá pre izoláty S. pneumoniae s priemermi oxacilínových zón  19 mm, uvedené v tejto norme (pozri aj časť VLASTNOSTI A OBMEDZENIA POSTUPU). Poznámka. Pravidelne sa vydávajú doplnené informácie k dokumentu komisie CLSI M2 alebo aktualizované verzie obsahujúce upravené tabuľky bakteriostatických diskov a výkladové normy. Aktuálne odporúčania nájdete v najnovších tabuľkách. Úplnú normu a doplnené informácie si môžete objednať v Národnej komisii pre klinické laboratórne normy (CLSI): National Committee for Clinical Laboratory Standards, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, PA 19087-1898, USA. Telefón: ++1-610-688-1100.

VLASTNOSTI A OBMEDZENIA POSTUPU Diskový difúzny test citlivosti je určený na použitie len s čistými kultúrami. Pred prípravou testu citlivosti sa odporúča vykonať Gramovo farbenie a predbežnú identifikáciu izolátu.1 Táto pôda sa používa na testovanie citlivosti S. pneumoniae a iných streptokokov voči vybraným antibiotikám.1, 2, 5 Berte do úvahy, že neexistujú spoľahlivé kritériá diskového difúzneho testovania amoxycilínu, ampicilínu, cefepimu, cefotaximu, ceftriaxonu, cefuroximu, imipenemu a meropenemu pre S. pneumoniae. Aktivita in vitro týchto antibiotík sa dá najlepšie stanoviť pomocou metódy MIC.1 Na stanovenie citlivosti S. pneumoniae na penicilín použite oxacilínový disk. Izoláty organizmu S. pneumoniae s priemermi oxalicínových zón  20 mm sú citlivé (MIC  0,06 mg/ml) na penicilín. Pretože zóny  19 mm s oxacilínovým skríningovým diskom sa objavujú u stredne citlivých alebo niektorých citlivých kmeňov rezistentných voči penicilínu, MIC penicilínu, meropenemu a cefotaximu alebo ceftriaxonu, stanovte na všetkých izolátoch S. pneumoniae s oxacilínovými zónami  19 mm.1 PA-254030.07

-3-

Pre streptokoky iné ako S. pneumoniae sa oxacilínový test na stanovenie citlivosti na penicilín neodporúča. Pre beta hemolytické streptokoky použite penicilínový alebo ampicilínový disk. Pre streptokoky druhu viridans difúzne testovanie penicilínovým a oxacilínovým diskom nie je spoľahlivé; ich citlivosť stanovte testovaním MIC.1 Diskové difúzne testovanie citlivosti na antibiotiká pomocou Streptococcus pneumoniae ATCC 49619 bolo vykonané interne s cefaklorom, cefprozilom, chloramfenikolom, erytromicínom, ofloxacínom, tetracyklínom, trimethoprim/sulfametoxazolom a vankomycínom. Na základe testovacích postupov popísaných v dokumente M2-A5 v období 10 testovacích dní sa vykonalo dvadsať testov s kmeňmi na kontrolu kvality a ôsmimi antibiotickými diskmi. Pri všetkých ôsmich antibiotikách spadalo 100 % (160/160) veľkostí zón do očakávaného rozsahu veľkostí zón uverejnených v dokumente M2-A5 a Tabuľke 3C dokumentu komisie NCCLS M100-S6.6, 7 Štandardná odchýlka pre tetracyklín bola menej ako 1 mm a pre všetky ostatné antibiotiká menej ako 2 mm.8 Reprodukovateľné štúdie (3-krát denne počas 3 dní) boli vykonané na dvoch lokalitách s antibiotikami uvedenými vyššie voči S. pneumoniae ATCC 49619 a deviatimi prídavnými, dobre charakterizovanými kmeňmi S. pneumoniae. Pre každé antibiotikum boli dodržiavané interpretačné normy priemerov zón z Tabuľky 2C dokumentu komisie NCCLS M2-A5 a dodatku M100-S6. 6, 7 Testovanie s chloramfenikolom, erythromycinon, ofloxacínom, tetracyklínom a vankomycínom skončilo vyše 95-percentnou skupinovou zhodou s referenčnou metódou komisie NCCLS. Testovanie s trimethoprim/sulfametoxazolom skončilo s 90-percentnou skupinovou zhodou s referenčnou metódou komisie NCCLS. Reprodukovateľnosť nemohla byť stanovená pre cefaklor a cefprozil vinou absencie interpretačných noriem pre tieto antibiotiká. Na základe štúdií popísaných vyššie sa pri testovaní S. pneumoniae na tejto pôde neodporúča použiť cefaklor, ceprozil ani trimethoprim/sulfametoxazol. Navyše, v literatúre je zaznamenaný nadmerný počet interpretačných chýb v diskovom difúznom testovaní s trimethoprim/sulfametoxazolom na pôde Mueller Hinton s ovčou krvou. 9 Inhibičná zóna pri niektorých kombináciách organizmov a antibiotických látok nemusí mať ostro ohraničený okraj, čo môže viesť k nesprávnej interpretácii. Zistilo sa viacero faktorov, ktoré ovplyvňujú diskové difúzne testy citlivosti. Patria medzi ne pôda, výška agaru, účinnosť disku, koncentrácia očkovacej kultúry, vek očkovacej kultúry a pH.2 Nesprávna koncentrácia očkovacej kultúry môže viesť k chybným výsledkom. Ak je očkovacia kultúra príliš silná, inhibičné zóny môžu byť príliš malé a naopak, ak je očkovacia kultúra príliš slabá, môžu byť príliš veľké a ťažko merateľné. Nevhodné uskladnenie antibiotických diskov môže spôsobiť stratu účinnosti a nesprávny výsledok testu rezistencie. Citlivosť organizmu na špecifické antibiotikum in vitro nemusí nevyhnutne znamenať, že antibiotikum bude účinné in vivo. Ďalšie informácie o postupoch pri interpretácii výsledkov nájdete v použitej literatúre.2, 10 Nepoužívajte túto pôdu na testovanie citlivosti baktérií iných ako S. pneumoniae a beta hemolytických streptokokov.

POUŽITÁ LITERATÚRA 1. Clinical and Laboratory Standards Institute. Approved Standard: M2. Performance standards for antimicrobial disk susceptibility tests. CLSI, Wayne, PA, USA.Search for latest version at www.clsi.org 2. Washington, J.A., and G.L. Woods. 1995. Antibacterial susceptibility tests: dilution and disk diffusion methods, p. 1327-1341. In P.R. Murray, E.J. Baron, M.A. Pfaller, F.C. Tenover, and R.H. Yolken (ed.), Manual of clinical microbiology, 6th ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C. 3. Baker, C.N., C. Thornsberry, and R.W. Hawkinson. 1983. Inoculum standardization in antimicrobial susceptibility testing: evaluation of overnight agar cultures and the rapid inoculum standardization system. J. Clin. Microbiol. 17:450-457. 4. Swenson, J.M., B.C. Hill, and C. Thornsberry. 1986. Screening pneumococci for penicillin resistance. J. Clin. Microbiol. 24:749-752. PA-254030.07

-4-

5. Hindler, J.F., and J.M. Swenson. 2003. Susceptibility test methods: fastidious bacteria. In: In: Murray, P. R., E. J. Baron, J.H. Jorgensen, M. A. Pfaller, and R. H. Yolken (ed.). Manual of clinical microbiology, 8thed. American Society for Microbiology, Washington, D.C. 6. National Committee for Clinical Laboratory Standards. 1993. Approved Standard: M2-A5. Performance standards for antimicrobial disk susceptibility tests, 5th ed. National Committee for Clinical Laboratory Standards, Villanova, Pa. 7. National Committee for Clinical Laboratory Standards. 1995. Sixth informational supplement: M100-S6. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing. National Committee for Clinical Laboratory Standards, Wayne, Pa. 8. Data on file at Becton Dickinson Microbiology Systems. 9. Jorgensen, J.J. 1994. Detection of antimicrobial resistance in Streptococcus pneumoniae by use of standardized susceptibility testing methods and recently developed interpretive criteria. Clin. Microbiol. Newsl. 16(13)97-104. 10. Neumann, M.A., D.F. Sahm, C. Thornsberry, J.E. McGowan, Jr. 1991. Cumitech 6A, New developments in antimicrobial agent susceptibility testing: a practical guide. Coordinating ed., J.E. McGowan, Jr. American Society of Microbiology, Washington, D.C.

BALENIE/DOSTUPNOSŤ BD Mueller Hinton Agar with 5% Sheep Blood (90 mm Petriho misky Stacker) Kat. č. 254030 Pôda v Petriho miskách pripravená na použitie, 20 ks Kat. č. 254080 Pôda v Petriho miskách pripravená na použitie, 120 ks BD Mueller Hinton Agar with 5% Sheep Blood (150 mm) Kat. č. 255080 Pôda v Petriho miskách pripravená na použitie, 20 ks BD Mueller Hinton Agar with 5% Sheep blood, Square (120 x 120 mm) Kat. č. 254517 Pôda v Petriho miskách pripravená na použitie, 20 ks

ĎALŠIE INFORMÁCIE Ak máte záujem o ďalšie informácie, kontaktujte miestneho zástupcu firmy BD.

Becton Dickinson GmbH Tullastrasse 8 – 12 D-69126 Heidelberg/Germany Phone: +49-62 21-30 50 Fax: +49-62 21-30 52 16 [email protected] http://www.bd.com http://www.bd.com/europe/regulatory/ Prompt is a trademark of 3M. ATCC is a trademark of the American Type Culture Collection BD, BD Logo and all other trademarks are the property of Becton, Dickinson and Company. © 2013 BD

PA-254030.07

-5-