UNIVERSIDAD DE SAN CARLOS DE GUATEMALA CENTRO UNIVERSITARIO METROPOLITANO FACULTAD DE CIENCIAS MÉDICAS UNIDAD DE INMUNOLOGÍA Y MICROBIOLOGÍA MÉDICA TERCER AÑO

BASES CELULARES Y MOLECULARES EN EL DESARROLLO DE LINFOCITOS B Dr. Mario Roberto Pinto INTRODUCCIÓN El ser humano tiene que enfrentar para sobrevivir en un medio ambiente adverso, a los microorganismos que lo rodean. Continuamente se interrelacionan, estableciendo una serie de luchas biológicas. Para lo cual ha desarrollado una respuesta inmune innata y adquirida, por lo que posee una serie de células y moléculas entre las cuales se encuentran los anticuerpos que pertenecen a la inmunidad adquirida. Las células que producen los anticuerpos son las plasmáticas, que a su vez se originan en los linfocitos B maduros que se han originado en la médula ósea, a partir de células madres hematopoyéticas. Las inmunoglobulinas son moléculas de naturaleza glicoproteína y tienen su origen en los linfocitos B inmaduros. Las inmunoglobulinas tienen cuatro cadenas polipeptídicas: dos ligeras (L) con dominios constituidos por una variable y una constante y dos cadenas pesadas (H), que tienen una región variable y una región constante, a las regiones se les denominan dominios que tienen aproximadamente 110 aminoácidos. Tienen 2 sitios donde se une al antígeno (FAB) y una región que se denomina FC (Factor cristalizable) que le da las características biológicas a las inmunoglobulinas. Los genes que participan en la síntesis de una inmunoglobulina son: por la cadena ligera una de variable y uno de constante, por la cadena pesada son un gen de variable y 4 o 5 de la constante. La diversidad de las inmunoglobulinas hacia los diferentes antígenos es de aproximadamente 108 y el mecanismo utilizado para la misma es el rearreglo genético que se produce en las regiones variables tanto de la cadena pesada como de la ligera. Los segmentos de genes que participan en la región variable de la cadena ligera son dos: 1) el de variable y 2) el de unión, formando un único exón (segmento codificado). (VJ) En la cadena pesada, participan 3 segmentos que conforman el gen de la variable: variable, diversidad y unión. (VDJ). El estadio de maduración del linfocito B, en el que se expresan la cadena pesada son: el pro-B y el de la cadena ligera es el pre-B, inicialmente la inmunoglobulina que sintetiza el linfocito B, es IgM y es expresada como inmunoglobulina de membrana en el estadio de Linfocito B inmaduro y la expresión de la IgD adicional en la membrana es característica del linfocito B maduro.

En el ADN las cadenas de las inmunoglobulinas están codificadas: las ligeras en el cromosoma 2, la Kappa y en el cromosoma 22 la Lambda y las cadenas pesadas están codificadas en el cromosoma 14. Los anticuerpos ya elaborados tienen algunos cambios genéticos en el Linfocito B maduro, para mejorar la afinidad hacia el antígeno y es la hipermutación somática y también cambian las regiones constantes de IgM a IgG, IgA e IgE, a lo que se denomina cambio de isotipo.

CÉLULAS MADRES PLURIPOTENCIALES HEMATOPOYÉTICAS Las células del sistema inmunitario son los leucocitos y las células titulares relacionadas con ellos. Estas células tienen un origen en una célula progenitora común llamada células madre pluripotencial hematopoyética (Stern Cell – CMPH), de la que también derivan los eritrocitos y los megacaricitos (plaquetas). A este grupo de células se les denomina en conjunto células hematopoyéticas y al proceso por el que las células madre hematopoyéticas producen esta variedad de células se denomina hematopoyesis. Además de generar distintos tipos celulares, tienen capacidad de autorenovarse. El sitio anatómico de la hematopoyesis cambia con la edad. En el embrión, las células sanguíneas se producen en el saco vitelino y aparecen en la tercera semana de vida. A medida que el feto se desarrolla, algunas de estas células migran al hígado y bazo, a partir del cuarto y quinto mes de vida fetal, los huesos y la médula ósea empiezan a desarrollarse y la hematopoyesis empieza a desplazarse a la médula ósea y en el momento del nacimiento prácticamente toda la hematopoyesis tiene lugar allí. En los adultos, la mayoría de las CMPH se encuentran en la médula ósea, sin embargo estas células tienen capacidad de migrar hacia la circulación, por lo que se encuentra en bajas cantidades de la sangre periférica. A partir de las CMPH, se generan distintos progenitores. a) Progenitor mieloide, que dan lugar a la célula de estirpe mieloide. b) Progenitor Linfoide común (PLC) a partir del cual se generan los linfocitos B y T. No se sabe como el PLC se diferencia al linaje B o T. La señalización a través de un receptor presente en la membrana de los PLC, denominado NOTCH 1, inducirían la diferenciación hacia el linaje T, mientras la ausencia de esta señal permite el desarrollo y diferenciación B. Los PLC que no expresan receptores NOTCH, expresan moléculas de adhesión celular (CAM), que se unen a receptores del estroma y también la molécula VLA-4, que se une a la molécula de adherencia de célula vascular 1 (VCAM-1) de las células del estroma de la médula ósea y empieza a diferenciarse en la primera célula de linaje B que se reconoce en la médula ósea que es la Pro-B temprana, cuya característica más importante es expresar en la membrana celular el receptor C-Kit que recibe la citoquina producida por las células del estroma Factor de Célula Madre (SCF) y posiblemente sea el factor principal para expresar el receptor para IL-7 que también expresan la línea de linfocitos T y células NK. En este momento, se expresan los factores de transcripción PU-1, encargados de controlar la diferenciación, proliferación y supervivencia del linaje de células B. Los

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niveles intermedios de PU-1, son decisivos para el desarrollo en la médula ósea del linaje de linfocitos B. Se han identificado otros factores de transcripción que cumplen un papel fundamental en las etapas tempranas de la maduración linfocitaria, agrupados con el nombre de Ikaros y que incluye los factores Helios y Aiolos. Ikaros pertenece a la familia “dedos de Zinc” y se asocia con el compromiso temprano de la serie linfoidea, siendo fundamental su coexistencia con PU-1 para generar las células Pro-B. Otros factores involucrados en la maduración de los linfocitos B, en su transcripcional temprana, son dos factores pertenecientes a la familia hélice-bucle-hélice. a) La proteína E2A b) La proteína EBF (early B-cell factor) La ausencia de cualquiera de estos factores en el desarrollo de las células B, se bloquea en una etapa temprana, antes del rearreglo DH-JH de la cadena pesada de las inmunoglobulinas. Estos dos factores son imprescindibles en la síntesis de: Las cadenas sustitutas λ5 y V pre B La molécula de señalización Ig (Alfa) e Ig β (Beta) Los genes de recombinación Rag-1 y Rag-2 El repertorio de anticuerpos es generado por sucesivos rearreglos de los genes de la cadena pesada y liviana, durante la etapa Pro-B y Pre-B.

LINFOCITOS PRO-B La recombinación V(D)J de genes de inmunoglobulina depende de la actividad de proteína específica, como las recombinasas Rag-1 y Rag-2, que reconocen específicamente secuencia de señales de recombinación (SSR). Este proceso se halla controlado por los factores de transcripción E2A y EBF, que regulan la expresión espacio temporal de Rag-1 y Rag-2 y lo hacen en forma secuencial. La activación del programa de genes específicos de los linfocitos B y la recombinación V(D)J por E2A y EBF no es suficiente por lo que es necesaria la participación del Factor de Transcripción Pax 5 que es de tipo secuencial en la activación de estos factores de transcripción. El Pax 5, es un regulador crítico en el desarrollo de los Linfocitos B y actúa en forma subsecuente a E2A y EBF. Los Linfocitos Pro-B tienen 2 etapas, el Pro-B temprano en el que se establece la primera recombinación (o rearreglo) del ADN y es entre los genes D-J en los dos cromosomas de la cadena pesada (H), luego en la etapa de Pro-B tardío, se recombina el gen de la variable (V) con los genes D-J, en el primer cromosoma (14), si falla, utiliza el segundo cromosoma, si hay fallo en ambos cromosomas, el linfocito Pro-B entra en apoptosis.

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La diversidad de unión es de 65 segmentos de genes variables (V), 27 de diversidad (D) y 6 de unión (J), para un total de 10,530 dominios variables posibles de la cadena pesada (H). El dominio de la cadena pesada, está conformada por los genes V/D/J. El proceso de recombinación somático que produce su dominio variable de la cadena pesada, se produce por corte y empalme del ARN mensajero. Hay un sistema que asegura el ensamblado correcto de los distintos fragmentos génicos durante el proceso de recombinación somática de manera que un fragmento V se asocie a uno D, pero no con otro gen V. La recombinación solo ocurre entre fragmentos génicos, que se encuentran en un mismo cromosoma y está guiado por secuencias conservadas de ADN no codificante, denominado secuencias señales de recombinación (SSR). Las SSR se encuentran adyacentes a los puntos donde se lleva a cabo la recombinación. La unión entre los fragmentos recombinados (VH-DH-JH) es imprecisa y puede ser un fuerte adicional de variabilidad para la porción variable de las inmunoglobulinas. El complejo enzimático que actúa para producir la recombinación (VDJ), se conoce con el nombre de recombinasa VDJ. Los productos de los genes RAG-1 y RAG-2, forman parte de esa recombinasa y solo se expresan en los linfocitos B en desarrollo (Pro – y Pre-B).

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Estas enzimas poseen actividad endonucleasas y son responsables del corte de la cadena ADN. El resto de las enzimas que forman parte de la recombinasa, como ligasa IV o la enzima ADN-PK, están involucradas en la separación, modificación y plegado del ADN. El complejo RAG- se une al espaciador de 23pb (pares de bases) y otro al espaciador de 12pb, de tal forma que una secuencia de SSR que contiene un espaciador de 12pb es adosado a una que contiene un espaciador de 23pb. Esto se conoce como la regla 12/23 y asegura que los segmentos génicos se unen en el orden correcto. Las moléculas de ADN se cortan en los extremos de las secuencias heptameras y luego se unen con topologías diferentes. La región del ADN que estaba originalmente entre los segmentos V y DJ se eliminan como un círculo pequeño que no tiene ninguna función. La unión constituida para formar este círculo se llama unión de señal. Dentro del ADN cromosómico, los segmentos V y DJ, se unen para formar una unión codificante. La formación de esta unión implica la apertura de las horquillas que se formaron en el punto original de corte en cada segmento de V y DJ y la reparación del ADN de una manera que introduce variabilidad adicional en la secuencia de nucleótidos alrededor de la unión. Las enzimas de separación de la cadena de ADN incrementan aun más la diversidad, ya que son capaces de agregar o eliminar nucleótidos al azar en los sitios de unión de los fragmentos génicos. Los nucleótidos adicionados, se conocen con los nombres de nucleótidos P y N. Los nucleótidos P, se adicionan por las enzimas responsables de la separación del ADN y reciben este nombre, ya que generan secuencias poliandrómcias. Los nucleótidos N, son adicionales sin templado por la enzima TdT (Deoxinucleotidil Transferasa Terminal) y se encuentran principalmente en la unión VH- DH y DH – JH. La presencia de nucleótidos N en la cadena L es rara, debido a que la enzima TdT, en los linfocitos B, solo se expresa durante los rearreglos de la cadena H que es previo al de la cadena L.

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Los dominios variables de las inmunoglobulinas presentan tres regiones hipervariables denominadas CDR1, CDR2 y CDR (región de diversidad complementaria). Tantos en las cadenas L como H, los CDR1 y CDR2, están codificados dentro de los genes V. En la cadena H el CDR3 está ubicado en la unión del segmento VH y DH – JH.

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En ambas cadenas el CDR3 es la que presenta mayor variabilidad debido a la adición y sustracción de nucleótidos que se producen durante la unión de los segmentos génicos.

LINFOCITOS PRE-B Tiene 2 etapas, la célula Pre-B grande, la cual ya tiene reordenada la cadena pesada (H) que forma una proteína asociada a la membrana llamada Mn. Las cadenas pesadas no pueden transportarse y expresarse en la membrana celular a menos que formen un complejo con las cadenas ligeras. Al final de las células Pro-B, empiezan a sintetizarse dos proteínas conocidas con el nombre de cadenas ligeras, sustitutas o subrogadas, que pueden fijarse a las cadenas pesadas, toman el lugar de las cadena aligeras y mostrarse transitoriamente en la membrana celular. Estas no son proteínas de inmunoglobulinas verdaderas, solo se expresan durante este breve periodo, derivan de genes que no sufren rearreglo somático y no desempeñan ninguna función inmune. Una vez en la membrana, ambas cadenas se asocian con el heterodímero Ig Alfa e Ig Beta para formar el denominado Pre-BCR, este complejo identifica el siguiente estadio de maduración. El pre-BCR traduce señales de supervivencia. La segunda etapa de este período es la células Pre-B pequeña, deja de expresarse las cadenas ligeras subrogadas e inicia una etapa de proliferación hasta que comienza el reordenamiento de los genes que codifican la cadena L. El inductor de esta proliferación es la IL-7 producida por las células del estroma y se deja de expresar la TdT y para que pueda producirse este rearreglo vuelven a expresar los genes RAg-1 y RAG-2. Los rearreglos de la porción variable de la cadena ligera (L), también están dirigidos por el fenómeno de la exclusión alelica e involucra la asociación de fragmentos VL y JL. Existen dos locus distintos para la cadena L: Kappa (κ) y Lambda (λ). Los genes de la cadena Kappa, son los más simples y están codificados en el cromosoma 2 y la Lambda está codificada en el cromosoma 22. La recombinasa primeramente intentará un rearreglo productivo de la cadena Lκ y en caso que no lo consiga, intentará rearreglar esa misma cadena en el alelo presente en el otro cromosoma. Si estos intentos no fueran exitosos, comienzan los rearreglos en la cadena Lλ, primero en un cromosoma y luego en el otro, normalmente un 65% de los linfocitos B logra un rearreglo exitoso en la cadena κ y el restante 35% en la cadena Lambda. El primer gen denominado gen VL codifica el dominio variable y está contenido por 2 segmentos de gen separados, llamado segmento variable (V) y segmento de unión (J). Una vez que se produjo la asociación VL – JL, este segmento queda separado de la región constante de la cadena liviana (CL) por un intrón y esta configuración, la que se transcribe al ARNm. Para producir la cadena liviana completa, luego de la transcripción, el intrón se separa del fragmento VL – JL del CL, se elimina por un proceso denominado corte y empalme (Splicing) del ARNm.

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LINFOCITO B INMADURO Una vez que los genes de la cadena L se reordenan con éxito, la cadena empieza a sintetizarse y se combina con la cadena HM, que se encontrará anclada en el retículo endoplásmico rugoso junto al heterodímero Ig - Igβ y entonces empieza a expresarse el BCR característico del estadio B inmaduro en la membrana celular. Una vez que el linfocito alcanza el estadio B inmaduro, los mecanismos de control se orientan hacia la

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especificidad del receptor y se activan mecanismos capaces de controlar a los linfocitos cuyos BCR puedan reconocer moléculas propias en el ambiente de la médula ósea. Los linfocitos B inmaduros que no reciben señales a través de su BCR, salen de la médula ósea hacia el bazo, para continuar su proceso de maduración. La ausencia de señales a través del BCR del linfocito B inmaduro induce disminución de la expresión de proteína RAG y el cese de los reordenamientos. Las proteínas RAG continúan disminuyendo hasta desaparecer cuando el linfocito B alcanza la madurez en el bazo. Los linfocitos B inmaduros generados en la médula ósea que son capaces de reconocer antígenos propios, tienen dos destinos, si perciben una señal interna a través del BCR (ejemplo reconocimiento de moléculas multivalentes) producen entrelazamiento extensivo con los BCR de membrana y mueren por apoptosis en la médula ósea. Antes de morir el linfocito B puede reemplazar el BCR autorreactivo por otro que no lo sea, a través de reactivar la proteína RAG, a este mecanismo se le conoce con el nombre de Edición de BCR. Los linfocitos B inmaduros que en la médula ósea entrecruzan levemente su BCR con antígenos propios solubles, se inactivan y entran en un estado irreversible de no respuesta a la que se denomina anergia. Estos linfocitos B autoreactivos, si bien emigran de la médula ósea, no son capaces de activarse en la periferia y mueren pronto. Los linfocitos B que no reconocieron antígenos propios en la médula ósea, porque no fueron expuestos a los mismos, pueden en la periferia exponerse y entrar en anergia y luego apoptosis.

LINFOCITOS B MADUROS Los linfocitos que tienen BCR una inmunoglobulina M y que han sobrevivido en la médula ósea de la selección central, un reconocimiento de antígenos propios pasan al Bazo y tiene un periodo corto de tiempo cuando empiezan a expresar la IgD de membrana y se les conoce como linfocitos B transicionales (BTr) que tiene 2 subpoblaciones, el tipo 1 (BTr 1) tiene IgM alto e IgD bajo, se encuentran en la circulación, en la vaina linfoide periarterial del Bazo y el tipo 2 (BTr 2) con expresión de IgM alto e IgD alto que se ubican preferentemente en los folículos esplénicos y luego pasan a linfocitos B maduros, para lo cual son necesarias señales de sobrevivencia a través del BCR y al parecer el factor activador de los linfocitos B (BAFF), es fundamental en esta etapa, utiliza receptores de la familia del FNT y es producido por macrófagos, células dendríticas y linfocito T activado y es capaz de activar los factores de transcripción NF – KB y AP – 1 y es un factor importante de sobrevivencia del linfocito B maduro. En los linfocitos B maduros existen tres poblaciones: las células B1, B2 y las células B de la zona marginal del Bazo. Los linfocitos B1, son las primeras células B que se generan durante el desarrollo embrionario y el hígado fetal que es el principal productor, se encuentran raramente en órganos linfoideos secundarios y sangre, pero prevalecen en las cavidades peritoneales y pleural. Son capaces de autorenovarse localmente o sea expandirse sin el estímulo antigénico. La quimiocina CXCL 13 cumple un papel fundamental en la migración y la residencia de los linfocitos B1, estos expresan niveles altos de IgM y bajos de IgD y su principal función es la producción de anticuerpos dirigida contra antígenos bacterianos no proteicos como polisacáridos, fosfotidilcolina y lipopolisacáridos, a estos antígenos se les denomina antígenos T independientes de tipo 2 (Ti-2), presentan epítopos repetidos que producen entrecruzamiento marcado con el BCR, probablemente son estos tipos de antígenos los que marcan a este grupo de linfocitos y no la influencia del sistema T. Estos linfocitos producen cantidades

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importantes de anticuerpos IgM que reciben el nombre de anticuerpos naturales. Ejemplo las aglutininas de los grupos sanguíneos A, B, O. Los linfocitos B de la zona marginal del Bazo (BZM) están especialmente adaptados para producir grandes cantidades de IgM específica en los primeros 3 a 4 días después de la estimulación antigénica. En la zona marginal esplénica, donde residen estos linfocitos, se reduce el flujo sanguíneo y permite el contacto íntimo entre los antígenos y los linfocitos BZM, lo que posibilita que estos linfocitos sean los primeros en entrar en contacto con antígenos que circulan en la sangre, dado el flujo sanguíneo que pasa a través del Bazo. Una vez activados, los linfocitos BZM se transforman en plasmoblastos, se dirigen a la periferia de la lámina periarterial linfocítica y proliferan activamente, formando focos de células plasmáticas productoras de anticuerpos IgM, no recibiendo señales coestimuladas de los linfocitos TH2 y responden preferentemente a antígenos polisacáridos de bacterias capsulares. El complemento y sus receptores representan un papel crucial en los linfocitos BZM. El receptor 2 para el complemento (CR2 o CD21) al formar un complejo con CCD1 y TAPA-1, constituye el correceptor del receptor de los linfocitos B para el antígeno (BCR). El receptor CD21 une el componente C3d, fracción del complemento activado, sin las fracciones estas del complemento, los linfocitos BZM no pueden unirse al antígeno eficientemente, lo que reduce sus anticuerpos necesarios para opsonizar bacterias con cápsula y que puedan ser fagocitadas. Los Linfocitos B2 Constituyen el 90% de los linfocitos B de la sangre y de órganos linfoideos y su función principal es reconocer antígenos proteicos y diferenciarse en células productora de anticuerpos (células plasmáticas), gracias a la colaboración de los linfocitos TH2. El primer paso en la activación de los linfocitos B consiste en el reconocimiento de antígenos solubles por su receptor de membrana (BCR). El cual puede ser en la sangre o bien en los folículos linfoideos de los órganos linfoideos secundarios. El entrecruzamiento del BCR de la membrana del linfocito induce la activación de proteincinasa de la familia Src, que median la fosforilación de tirosina de los dominios ITAM (motivo de activación de Tirosina por el inmunoreceptor), del heterodímero Ig Alfa – Ig Beta. La fosforilación de los dominios ITAM, permite el reclutamiento de otra tirosincinasa denominada Syk, que fosforila a la proteína adaptada BNLK, esta última favorece el reclutamiento de las Tec cinasas, las cuales fosforilan y activan a la enzima fosfolipasa C-Gamma (PLC – γ), que escide a los fosfolípidos de membrana PIP 2 y da lugar a la formación de IP3 y diacilglicerol (DAG). El IP3 induce la liberación de calcio de los reservorios intracelulares, mientras el DAG activa la Protein Cinasa C (PKC). Una tercera vía transduccional se pone en marcha que involucra la activación de proteína G de bajo peso molecular, como Ras y Rac, por factores llamados GEF (Guanin Exchange Factors), que conduce a la activación de los MAP cinasas (MAPK). Las distintas vías de señalización conducen en última instancia a la activación de los factores de transcripción NKkB, NFAT y AP-1 capaces de regular la transcripción de diversos genes que conducen a la expresión de receptores para IL-2, IL-4, IL-5, Gamma Interferón, CCR2, así como expresión de CD40, Cd80, Cd86 y CMH tipo II, que se traducirá en división celular y presentación de antígenos a linfocitos TH2 y a recibir la cooperación T a través de citoquinas, que inducirán cambio del isotipo en las inmunoglobulinas y maduración a células plasmáticas a través de activar factores de transducción.

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El sólo reconocimiento del antígeno por el BCR no es suficiente para inducir proliferación del linfocito B, para lo cual el linfocito B actúa como una célula presentadora de antígeno, capta el antígeno con su receptor de membrana, lo introduce en una vacuola endocítica, lo procesa y lo convierte en pequeños péptidos que introduce en las hendiduras de su CMH tipo II y se los presenta a los linfocitos TH2 tipo II, especialmente en las áreas de folículos primarios a donde acuden a través de quimiocinas como el CXCL13 por la célula folicular dendrítica, aumentado la expresión del CCR7 específico para las quimiocinas CCL19 y CCL21 predominantes en esas zonas. Una vez en el interior del folículo primario, siguen proliferando y dan lugar al centro germinal, a estos linfocitos B se les conoce como Centroblastos, los centros germinales se desarrollan una semana después de la estimulación antigénica, por linfocitos TCD4, que se encuentran en los folículos, son parecidos a los TH0, producen

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CXCL13 y pueden producir IL-4 y Gamma Interferón e IL-2, cuando los Centroblastos dejan de proliferar, se convierten en los centrocitos. Los linfocitos TH0 por acción de citoquinas como IL-4, se unen estrechamente a través de las moléculas CD40 y CD40L de los linfocitos T, así como otras moléculas de CD80 y Cd86 con el CD28. En el centro germinal, los genes que codifican las cadenas pesadas y livianas de la Ig, sufren una serie de modificaciones que darán como resultado la producción de anticuerpos de mayor afinidad por el antígeno y de isotipo diferente de la IgM. Estas modificaciones moleculares comprenden: 1. 2.

Hipermutación somática que altera la porción variable de la Ig El cambio o switch del isotipo que reemplaza la porción constante de una cadena pesada por otra de una clase diferente.

Hipermutación somática Es un mecanismo por el cual la porción variable de las cadenas pesadas y livianas de las Ig sufren mutaciones puntuales con una tasa muy alta. Como consecuencia, luego de cada mitosis, las células hijas expresan porciones V(D)J diferentes del linfocito B que les dio origen. Se da una mutación por cada generación de linfocitos B. Al proceso de la hipermutación somática se le llama maduración de la afinidad de los anticuerpos. Los linfocitos B que han reconocido antígenos por el BCR e inician su proceso metabólico de activación, expresan receptor para la IL-2, lo que inicia la generación de clonas de los linfocitos B en el folículo linfoideo, pero también la activación de una enzima, la citidina desaminasa, inducida por activación (AID), una enzima que convierte los residuos de citidina del ADN en uracilo. A su vez los residuos de uracilo son cortados por la enzima uracilo – ADN glucosilasa (UNG) y en la siguiente replicación del ADN de la célula B, se introducen nucleótidos no reconocidos por un molde (Nontemplated) en estos sitios. Hay ruptura del ADN y la incorporación posterior de “errores” durante la reparación. Las mutaciones son al azar, muchas de ellas son perjudiciales para las células B, ejemplo: pueden impedir la expresión de la Ig de membrana, lo que conduce a la apoptosis de la célula, otras veces disminuyen la capacidad de reconocimiento del epitopo antigénico, al no reconocer el antígeno que hay que procesar para presentar al linfocito T y entonces no se producen las moléculas cooperadoras que producen señales de supervivencia para los linfocitos B, por lo tanto hay muchas muertes por apoptosis en los centros germinales y los macrófagos de estas áreas los eliminan. La región donde se producen la mayoría de cambios de la hipermutación somática son en las regiones hipervariables de las regiones variables, que son las regiones de determinación de complementariedad (CDR) y se designan CDR1, CDR2 y CDR3 a partir de la más cercana al extremo amino Terminal. La CDR3 es la más larga y variable de las tres.

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Cambio de Isotipo Es un proceso que ocurre luego del contacto antigénico. Los primeros anticuerpos producir en una respuesta humoral son siempre de isotipo M, pero a medida que progresa la respuesta comienzan a observarse anticuerpos de igual especificidad antigénica, pero de distintos isotipos. Esto es consecuencia de la asociación de la porción CDJ de la cadena H con una porción constante diferente de la cadena M. A nivel genómico, se observa una región con secuencias GAGCT y GGGGGT altamente repetidas a la izquierda (Upstream) de los genes que codifican cada una de las porciones constantes. Estas regiones llamadas regiones de switch, son imprescindibles para que se produzca la recombinación del ADN, aunque no se han identificado con exactitud cuales son las enzimas responsables de la ruptura y religamiento del ADN, Se sabe que las citoquinas Gamma Interferón inducen el cambio a IgG, la IL4 a IgE y el Factor de transformación de Crecimiento Beta a IgA. La citidina desaminasa inducida por activación (AID), es una enzima capaz de modificar el ARN al convertir la citidina en Uracilo por desaminación, este proceso se llama edición de ARN, es una enzima que edita el ARN mensajero. En el cambio de isotipo la desaminación del ARNm por la AID daría lugar a la ruptura del ADN. Cuando no se expresa la AID, se produce el síndrome de Hiper IgM, no hay cambio de isotipo y no hay hipermutación somática.

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Diferenciación de Centrocitos en Linfocitos B de memoria o en células plasmáticas. Los centrocitos que han sobrevivido en el centro germinal, dan lugar a dos tipos de células: Plasmoblastos que abandonan el centro germinal para completar una diferenciación a células plasmática productoras de Ig de alta afinidad y linfocitos B de memoria. Los factores que inciden en uno u otro destino son: la afinidad del BCR por el antígeno y la unión del Linfocito B a T, si se establece una unión muy fuerte entre CD40 y CD40L, favorece la formación del LB de memoria. En cambio la unión de la molécula OX40 y el OX40L de los linfocitos T, favorece la diferencia al fenotipo plasmocito, pues deja de expresarse el factor de transducción BCI-6 que reprime una batería de genes que incluye el factor Blimp-1 (B-Lymphocyte-induced maduration protein -1) un poderoso regulador de la diferenciación de linfocitos B hacia células plasmáticas. También la expresión de citoquina como IL-10, IL-4 e IL-5 favorece a la expresión de células plasmáticas y solo la expresión de IL-4 a un fenotipo de memoria. El Blimp 1 su expresión es suficiente para inducir la formación de células plasmáticas y si no se expresa este factor, la célula plasmática no produce anticuerpos. Los plasmocitos son dos: uno de vida media corta (pocos días) o de vida media larga (meses o años). Es una respuesta inmune secundaria, la mayor parte de los anticuerpos séricos provienen de estos plasmocitos de vida media larga, que siguen produciendo anticuerpos, aun cuando el antígeno ya no esté presente. Los plasmocitos generalmente residen en la médula ósea y las células del estroma les proveen de factores solubles y factores asociados a la membrana que aseguran la

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supervivencia de los plasmocitos. Entre los primeros, destacan la IL-6, mientras que la integrina VLA-4 expresada por las células plasmáticas es crucial para mantener el contacto con las células estromales de la médula ósea y aseguran la supervivencia. Dado que las células plasmáticas tienen como función principal la secreción de Ig, su fenotipo y su morfología se adaptan a ellos. Desaparecen de su membrana las moléculas responsables de mediar la activación antigénica del linfocito B, como el BCR, CD19, CD21 y Cd22, así como el CMH tipo II. Al mismo tiempo experimenta un aumento notable en la relación citoplasma-núcleo, ya que deben sintetizarse grandes cantidades de Ig, presentando un retículo endoplásmico rugoso prominente y vacuolas secretorias.

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