Amplified Fragment Length Polymorphism

Vos et al. 1995 AFLP: a new technique for DNA fingerprinting. Nucleic Acids Research 23: 4407-4414

RAPD

Molecular Ecology: Policy on the use of RAPD markers: The appropriateness of RAPD markers for population genetic inference is increasingly questioned by our reviewers and editors because of concernes about reproducibility, dominance, and homology. Given these worries, and the ready availability of other kinds of markers that do not suffer from all of these problems, studies based primarily on RAPDs only rarely pass the scrutiny of peer review in Molecular Ecology

AFLP 1. Restrikcija ukupne stanične DNA s dva različita restrikcijska enzima

2. Ligacija adaptera

T4 DNA ligase, ATPs

3. Preamplifikacija

4. Selektivna amplifikacija

*

*

detekcija pomoću florescencijski označenih početnica i automatskih sekvencera

Taksonomija i filogenija: Milla SR. Isleib TG. Stalker HT. Taxonomic relationships among Arachis sect. Arachis species as revealed by AFLP markers. [Article] Genome. 48(1):1-11, 2005 Feb. Chao CCT. Devanand PS. Chen JJ. AFLP analysis of genetic relationships among Calathea species and cultivars. [Article] Plant Science. 168(6):1459-1469, 2005 Jun. Koopman WJM. Phylogenetic signal in AFLP data sets [Review]. [Review] Systematic Biology. 54(2):197-217, 2005 Apr. Jang CG. Mullner AN. Greimler J. Conflicting patterns of genetic and morphological variation in European Gentianella section Gentianella. [Article] Botanical Journal of the Linnean Society. 148(2):175-187, 2005 Jun. Zerega NJC. Ragone D. Motley TJ. Systematics and species limits of breadfruit (Artocarpus, Moraceae). [Article] Systematic Botany. 30(3):603-615, 2005 Jul-Sep. Kyndt T. Romeijn-Peeters E. Van Droogenbroeck B. Romero-Motochi JP. Gheysen G. Goetghebeur P. Species relationships in the genus Vasconcellea (Caricaceae) based on molecular and morphological evidence. [Article] American Journal of Botany. 92(6):1033-1044, 2005 Jun

Filogeografija: Still DW. Kim DH. Aoyama N. Genetic variation in Echinacea angustifolia along a climatic gradient. [Article] Annals of Botany. 96(3):467-477, 2005 Sep. Schonswetter P. Tribsch A. Vicariance and dispersal in the alpine perennial Bupleurum stellatum L. (Apiaceae). [Article] Taxon. 54(3):725-732, 2005 Aug. Mant J. Bower CC. Weston PH. Peakall R. Phylogeography of pollinator-specific sexually deceptive Chiloglottis taxa (Orchidaceae): evidence for sympatric divergence?. [Article] Molecular Ecology. 14(10):3067-3076, 2005 Sep. Portis E. Acquadro A. Comino C. Mauromicale G. Saba E. Lanteri S. Genetic structure of island populations of wild cardoon [Cynara cardunculus L. var. sylvestris (Lamk) Fiori] detected by AFLPs and SSRs. [Article] Plant Science. 169(1):199-210, 2005 Jul.

Zaštita: Kim SC. Lee C. Santos-Guerra A. Genetic analysis and conservation of the endangered Canary Island woody sowthistle, Sonchus gandogeri (Asteraceae). [Article] Journal of Plant Research. 118(2):147-153, 2005 Apr. Grassi F. Cazzaniga E. Minuto L. Peccenini S. Barberis G. Basso B. Evaluation of biodiversity and conservation strategies in Pancratium maritimum L. for the NorthernTyrrhenian Sea. [Article] Biodiversity & Conservation. 14(9):21592169, 2005 Aug.

Li Q. Xiao M. Guo L. Wang L. Tang L. Xu Y. Yan F. Chen F. Genetic diversity and genetic structure of an endangered species, Trillium tschonoskii. [Article] Biochemical Genetics. 43(7-8):445-458, 2005 Aug. Kremer A. Caron H. Cavers S. Colpaert N. Gheysen G. Gribel R. Lemes M. Lowe AJ. Margis R. Navarro C. Salgueiro F. Monitoring genetic diversity in tropical trees with multilocus dominant markers [Review]. [Review] Heredity. 95(4):274280, 2005 Oct

Mapiranje: Al-Chaarani GR. Gentzbittel L. Wedzony M. Sarrafi A. Identification of QTLs for germination and seedling development in sunflower (Helianthus annuus L.). [Article] Plant Science. 169(1):221-227, 2005 Jul. Ke LP. Sun YQ. Hong DF. Liu PW. Yang GS. Identification of AFLP markers linked to one recessive genic male sterility gene in oilseed rape, Brassica napus. [Article] Plant Breeding. 124(4):367-370, 2005 Aug. Belaj A. Satovic Z. Cipriani G. Baldoni L. Testolin R. Rallo L. Trujillo I. Comparative study of the discriminating capacity of RAPD, AFLP and SSR markers and of their effectiveness in establishing genetic relationships in olive. [Article] Theoretical & Applied Genetics. 107(4):736-744, 2003 Aug.

Utvrđivanje hibridizacije: Houghton-Thompson J. Prince HH. Smith JJ. Hancock JF. Evidence of hybridization between Lythrum salicaria (Purple Loosestrife) and L-alatum (winged loosestrife) in North America. [Article] Annals of Botany. 96(5):877-885, 2005 Oct. Hegarty MJ. Jones JM. Wilson ID. Barker GL. Coghill JA. Sanchez-Baracaldo P. Liu GQ. Buggs RJA. Abbott RJ. Edwards KJ. Hiscock SJ. Development of anonymous cDNA microarrays to study changes to the Senecio floral transcriptome during hybrid speciation. [Article] Molecular Ecology. 14(8):2493-2510, 2005 Jul.

Ostalo: Pafundo S. Agrimonti C. Marmiroli N. Traceability of plant contribution in olive oil by amplified fragment length polymorphisms. [Article] Journal of Agricultural & Food Chemistry. 53(18):6995-7002, 2005 Sep 7. Coyle HM. Palmbach T. Ladd C. Lee HC. Tracking clonally propagated marijuana using amplified fragment length polymorphism (AFLP) analysis. [Article] FORENSIC BOTANY: PRINCIPLES AND APPLICATIONS TO CRIMINAL CASEWORK. PG. 185-196. 2005.

Genetska raznolikost stenoendemične vrste Degenia velebitica (Degen) Hayek (Brassicaceae) Laboratorij za Sistematiku bilja (PMF-Zagreb) i DNA laboratorij Medicinskog fakulteta u Osijeku

T T T T T T T T T T T T T T S2 T S2 PB PB PB PB PB S1 S2 S2 S1 S2 PB PB PBPB PB PB PB PB PB PB PB S1 S1 S2 S2 S1 S1 S1 S1 S2 S2 S2 S2 S2 S2 S1 S1 S1 S1 S1 S1 S2 0.11

0.31

0.50

Coefficient

0.69

0.89

Degenia je nazočna na 3 lokaliteta: • • •

Tomišina Draga (Kapela), Prikinuto Brdo (Srednji Velebit) i Šugarska Duliba (Južni Velebit)

No

Ime lokaliteta

Obim (km)

Površina (ha)

Ndm min

Ndm max

Svrha 1. Ustanoviti točnu rasprostranjenost 2. Ustanoviti brojnost populacija 3. Utvrditi genetsku varijabilnost 4. Sugerirati mjere zaštite

1

Krug hrbat (južni Velebit)

0,094

0,013

1297

1313

2

Krug (južni Velebit)

0,300

0,180

1241

1289

3

Kriv kuk (južni Velebit)

0,120

0,086

1260

1279

4

Prikinuto brdo (srednji Velebit)

0,142

0,117

1167

1185

5

Tomišina draga (manje nalazište)

0,073

0,028

301

305

6

Tomišina draga (veće nalazište)

1,603

4,432

313

461

Ukupno

2,332

4,856

Na 38 ploha ukupne površine 950 m2 nađeno je 1418 primjeraka degenije

Ñ #

Ñ ÑÑ

Ñ

#

#

Ñ Ñ

# #

Ñ

br.

Ime nalazišta

1

Prikinuto brdo, srednji Velebit

Datum

02.08.2004 .

Br. plohe PLOHA 1.1

x centroid

5507691,80

y centroid

4936320,00

ndm

1182,80

Ñ

Ñ

broj jedin ki

Prikinuto brdo, srednji Velebit

02.08.2004 .

PLOHA 1.2

4936328,10

1179,83

#

#

# 101 Ñ ÑÑ Ñ Ñ Ñ Ñ

Ñ Ñ Ñ

Ñ

5507702,70

#

Ñ Ñ Ñ Ñ Ñ Ñ ÑÑ Ñ Ñ Ñ Ñ Ñ Ñ Ñ Ñ ÑÑ ÑÑ

141

Ñ ÑÑ

# ÑÑ

Ñ

#

#

#

#

Ñ

Ñ

Ñ

#

Ñ

Ñ

Ñ

Ñ Ñ Ñ Ñ

#

Ñ Ñ

Ñ

Ñ Ñ

Ñ

Ñ

Ñ

#

#

#

#

Ñ

Ñ

# #Ñ Ñ

#

#

1

Ñ

#

#

Ñ

Ñ

#

ÑÑ Ñ

ÑÑ Ñ Ñ

Ñ

#

Ñ

Ñ

Ñ

Ñ ÑÑ

#

Ñ Ñ Ñ Ñ Ñ Ñ Ñ

ÑÑ

#

ÑÑ ÑÑÑ

Ñ

Ñ

1 2 3

Prikinuto brdo, srednji Velebit Tomišina draga - manji lokalitet, sjeverni Velebit

02.08.2004 . 03.08.2004 .

PLOHA 1.3 PLOHA 2.1

5507717,50

4936325,00

1176,04

158

Ñ

5490759,60

4990979,50

303,12

Ñ

Ñ Ñ

Ñ

Ñ

#

81

Ñ

Ñ Ñ

Ñ

Ñ

Ñ

Ñ Ñ Ñ

Tomišina draga - veći lokalitet, sjeverni Velebit

20.04.2005 .

PLOHA 3.1

5491369,20

Tomišina draga - veći lokalitet, sjeverni Velebit

20.04.2005 .

PLOHA 3.2

5491328,70

Tomišina draga - veći lokalitet, sjeverni Velebit

20.04.2005 .

PLOHA 3.3

5491316,00

4991187,90

455,31

11

Ñ

# #

Ñ Ñ

Ñ Ñ

Ñ

Ñ Ñ

Ñ Ñ

3

4991159,10

446,38

12

ÑÑ Ñ

Ñ

Ñ Ñ

Ñ

#

Ñ

Ñ

Ñ

Ñ

Ñ

# # # Ñ

ÑÑ ÑÑ Ñ

Ñ

Ñ

ÑÑ

Ñ Ñ

Ñ

Ñ Ñ Ñ Ñ

#

3

4991139,00

437,19

0

Procjena je da na Zemlji živi oko 37000 jedinki degenije, najveći broj jedinki najmanje gustoće je na lokalitetu Tomišina draga, a najmanji broj jedinki najveće gustoće je na lokalitetu Prikinuto brdo

ÑÑ

Genetska varijabilnost degenije Male populacije su genetski konzervativnije i neotpornije na promjene Uzorkovanje: 15-30 jedinki sa svakog lokaliteta, cca 200 mg tkiva sa svake jednike pohranjeno u silika-gel DNA izolacija Dneasy® Plant Mini Kit (Qiagen), cca 500 ng ukupne stanične DNA upotrebljeno za AFLP analizu (AFLP Plant Mapping kit), dobiveni rezultati su detektirani upotrebom florescencijski označenih selektivnih primera te ABI PRISM 310 sekvencera (Applied Biosystems).

ABI PRISM 310 electropherogram of DNA sample No. 1 from the population Tomišina draga

ABI PRISM 310 electropherogram of DNA sample No. 28 from the population Prekinuto brdo

ABI PRISM 310 electropherogram of DNA sample No. 50 from the population Šugarska duliba

Genetska varijabilnost degenije Zaključci: •

•

•

•

•

Degenia ima malenu genetsku varijabilnost što je čini osjetljivom i nesposobnom da se prilagodi fluktuacijama u okolišu/staništu (klima, sukcesije, migracije, indiretkni ljudski utjecaj i dr.) Populacija s lokaliteta Šugarska duliba ima najvišu razinu genetske varijabilnosti unutar cijelog uzorka, te zahtijeva posebnu pažnju i može poslužiti u programima propagacije Populacija s lokaliteta Prekinuto brdo je najmanja populacija s izrazito malom genetskom varijabilnošću pa prema tome i potencijalno najugroženija Populacija s lokaliteta Tomišina draga genetski je najspecifičnija, te je donekle izdvojena od bliže srodnih velebitskih populacija Nastavak slijedi!!! Pop n SSWP

Tom. Draga

Prekinut o Brdo

T T T T T T T T T T T T T T S2 T S2 PB PB PB PB PB S1 S2 S2 S1 S2 PB PB PBPB PB PB PB PB PB PB PB S1 S1 S2 S2 S1 S1 S1 S1 S2 S2 S2 S2 S2 S2 S1 S1 S1 S1 S1 S1 S2 0.11

0.31

0.50

0.69

Coefficient

Analysis of Molecular Variance Among Pops.

Sugarska duliba I

Sugarska duliba II

15

15

14

14

9,867

10,000

13,500

16,500

Within Pops. 53%

47%

0.89

Preporuke u zaštiti

1.

2.

3.

4.

5.

Na svim lokalitetima proglasiti jasno prostorno definirane Botaničke rezervate sa zaštitnim zonama Obilježiti područja znakovima upozorenja i regulirati pristup, osobito na lokalitetu Prikinuto brdo, genetski najfragilnijoj populaciji Pristupiti aktivnom sprečavanju napredovanja prirodne potencijalne vegetacije uklanjanjem drvenastih eu- i sub-mediteranskih svojti na lokalitetu Tomišina draga, te jesenje šašike s velebitskih nalazišta Na ovdje definiranim plohama i procedenoj metodologiji provoditi djelatnost nadgledanja promjena (u skladu s točkom 3) Genetski najraznolikiju populaciju sa Šugarske dulibe koristiti u programima ex-situ zaštite i za pohranu sjemenki u banku sjemenki

Utvrđivanje srodstvenih odnosa među svojtama roda Ocimum L. Zavod za sjemenarstvo Agronomski fakultet Zagreb Laboratorij za Sistematiku bilja PMF Zagreb Biotehnički fakultet u Ljubljani

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 26 27 28 29 30 31 30:00

60:00

90:00

120:00

150:00

180:00

210:00

240:00

min

ALFwin Fragmant Analyser

Allel Locator

0.1

88

100

14 O. basilicum var. purpurascens 1 O. basilicum cv. Sweet Basil 3 O. basilicum cv. Sweet Basil 26 O. minimum 55 25 O. minimum 4 O. basilicum cv. Genovese 7 O. basilicum cv. Genovese 10 O. basilicum cv. Genovese 2 O. basilicum cv. Sweet Basil 8 O. basilicum cv. Genovese 4,0 – 4.7 pg 5 O. basilicum cv. Genovese 19 O. basilicum cv. Dark Opal 99 84 21 O. basilicum cv. Dark Opal 59 18 O. basilicum cv. Dark Opal 20 O. basilicum cv. Dark Opal 17 O. basilicum cv. Dark Opal 11 O. basilicum cv. Genovese 58 57 9 O. basilicum cv. Genovese 6 O. basilicum cv. Genovese 100 13 O. basilicum var. difforme 12 O. basilicum var. difforme 22 O. basilicum var. thyrsiflorum 24 O. x citriodorum 7 pg 66 23 O. americanum 100 6,5 pg 16 O. basilicum var. purpurascens 79 7 pg 15 O. basilicum var. purpurascens 27 O. gratissimum 4.1 pg

0,7 pg 28 O. tenuiflorum

Veličina genoma kod kritosjemenjača varira i do 500x (npr. 1C Arabidopsis thaliana 0,16 pg ili 157 Mbp, a u vrste Fritilaria davisii 90 pg ili 88 000 Mbp)!!! Izuzetno veliki genom stvaraju probleme u dobivanju vjerodostojnih i dovoljno varijabilnih AFLP podataka!!!

1C = 0,20 pg

1C = 0,32 pg

1C = 0,65 pg

1C = 0,843 pg

Bixa orellana 1C = 16,80 pg

1C = 23,62 pg

1C = 24,00 pg

1C = 32,35 pg

Damasonium alisma

ZAKLJUČAK - kod poliploida treba obratiti pažnju na “genome size”, a ne na 1C vrijednost -kvaliteta dobivenih profila za Damasonium alisma (heksaploid) je superiorna ne samo nad vrstom Tulipa sprengeri (diploid sa sličnom 1C vrijednosti) nego i nad vrstom Cephalantera longifolia (diploid s 71 % 1C vrijednosti) -standardni AFLP protokol moguće je koristiti u rasponu “genome size” 0,3 – 12 pg -povećanje broja baza pri selektivnoj amplifikaciji daje vjerodostojne rezultate do “genome size” vrijednosti od 15 pg -za genome iznad 15 pg preporučljiva je upotreba markera koji su usmjereni na točno određeni dio genoma

Peak

Inde x

Mean

O. basilicum var basilicum cv sweet basil

2

2,129

232,16

2675

31,07

3,75

0,8

4,141783253

O. tenuifolium

2

1,748

81,55

3376

43,34

5,62

1,42

0,719099042

O. basilicum var. purpurascens

2

1,648

193,39

1930

35,78

5,29

0,91

7,17162573

Area

Area%

CV%

ChiSqu.

pg

Trifolium repens standard for all (2.07 pg)

Rod Alstroemeria = Peruanski ljiljani 1C = 20–40 pg

Trifolium repens standard for all Ocimum taxa (2.07 pg)

Campanula

rotundifolia

2.65

Mowforth, 1986 (Ref. 158)

1991

Limonium

vulgare

2.65

Zonneveld et al., 2005 (Ref. 466)

2005b

Limonium

purpuratum

9.68

Morgan et al., 1995 (Ref. 315)

2000

Iris

siberica

2.10

Olszewska and Osiecka, 1982

1991

Iris

germanica

12.45

Zonneveld et al., 2005 (Ref. 466)

2005b

Iris

pumila

13.20

Zonneveld et al., 2005 (Ref. 466)

2005b

Betula

Salvia

Pinus

pubescens

splendens

nigra

0.75

Mowforth, 1986 (Ref. 158)

1991

0.85

Olszewska and Osiecka, 1983 (Ref. 156)

1991

26.93

Grotkopp et al., 2004 (Ref. 35)

2004