AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS A PARTIR DE SUELOS CONTAMINADOS CON HIDROCARBUROS Francisco DE LA GARZA, Yessica ORTIZ, Blanca CASTRO, Patricio RIVERA, Lorenzo HEYER Unidad Academica Multidisciplinaria Agronomia y Ciencias, Laboratorio Ambienta Universidad Autonoma de Tamaulipas Cd. Victoria Tamaulipas, Mexico, Codigo Postal 87149. Correo electrónico: [email protected] Palabras clave: bioremediación, disel, levadura, cuenca de Burgos RESUMEN En la Cuenca de Burgos la cual abarca al norte de Tamaulipas, se está extrayendo gas natural, resultando alrededor de 144,000 toneladas por año de lodos impregnados con disel y otros hidrocarburos. Estos materiales reciben un tratamiento físico siendo insuficiente ya que deja residuos de entre el 2 y 3 % de hidrocarburos. Una alternativa viable para resolver este problema, puede ser la biorremediación. Este trabajo pretendió aislar microorganismos capaces de utilizar suelos contaminados con hidrocarburos específicamente del municipio de Reynosa. Este ensayo se llevo a cabo bajo condiciones de laboratorio; se muestreo según la NOM138-SEMARNAT/SS-2003. La composición del medio de cultivo utilizado fue: (NH4)2SO4 7.0 g, KH2PO4 5.7g, K2HPO4 2.3g, MgSO4.7H2O 2.2g con y sin levadura, usándose como caldo y medio sólido; el aislamiento de los microorganismos fue: a) siembra en caldo con levadura, incubación a 37 oC durante 48 horas a 200 rpm b) resiembra en caldo sin levadura, incubación a 37 oC durante 48 horas a 200rpm c) siembra en medio sólido, incubación a 37 oC por 48 horas. Del crecimiento de cada siembra se hicieron frotis para determinar la composición microbiana presente. En las dos primeras siembras se detectó la presencia de levaduras y bacterias Gram negativas. En el medio sólido se desarrollaron colonias color beige, de diámetro de 7.5 mm a 1 mm, solo en los medios con hidrocarburos, en los medios sin hidrocarburos no se observo ningún crecimiento microbiano. En el suelo analizado existen microorganismos capaces de utilizar hidrocarburos como fuente de carbono. INTRODUCCIÓN La Cuenca de Burgos es una zona de explotación de gas natural en el noreste de México, en la cual la perforación de pozos genera alrededor de 144,000 toneladas por año de residuos o lodos impregnados con diesel y otros hidrocarburos a los cuales hay que darles una salida medioambiental. Se sabe que la disposición no controlada de estos materiales puede crear problemas tales como la contaminación de aguas subterráneas y contaminación atmosférica (Clark, 1995).

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La agencia de protección ambiental europea, sensibilizada cada vez más por la problemática que éstos pueden llegar a ocasionar, incluyó 16 hidrocarburos en la lista de contaminantes prioritarios (Ferrari, 1996). En la zona, estos materiales son sometidos a tratamiento físico para reducir la concentración de tales sustancias (REECOTEC, 2004) para confinarlos posteriormente en un relleno sanitario, sin embargo dicho tratamiento deja residuos de entre el 2 y el 3 % de hidrocarburos. Entre las técnicas de recuperación de los suelos contaminados con hidrocarburos se pueden citar: a la extracción de hidrocarburos por vacío, incineración, y la recuperación electrocinética (Clark, 1995). Debido al elevado costo de las técnicas mencionadas, se buscan alternativas viables para la eliminación de los hidrocarburos contenidos en estos suelos. Se pretende que estas alternativas sean ambientalmente correctas, simples y económicas. Se tienen así técnicas de tratamiento que se aplican a deshechos peligrosos o materiales contaminados, y que persiguen alterar su estado en forma permanente por medios químicos, biológicos o físicos. Una alternativa viable para resolver este tipo de problemas, puede ser la biorremediación (Atlas y Pramer 1990) en la cual se utilizan una variedad de organismos vivos, principalmente microorganismos como las bacterias y levaduras, para degradar, transformar o remover compuestos orgánicos tóxicos a productos metabólicos inocuos o menos tóxicos (Grady, 1985; Thomas y Ward, 1989; Van Deuren et al., 1997). En el caso de los microorganismos estos eliminan el contaminante por biodegradación proceso mediante el cual los microbios son capaces de aceptar como sustrato sustancias orgánicas y transformarlas en compuestos menos tóxicos o inocuos o, mejor aún, eliminarlos de forma total produciendo CO2, agua y biomasa microbiana. Los hidrocarburos en el medio ambiente son degradados principalmente por bacterias y hongos. Ambos son relativamente abundantes en el suelo (Bossert y Bartha., 1984), aunque las bacterias asumen un rol predominante en medios marinos, mientras que los hongos lo hacen en ecosistemas terrestres. Las bacterias con capacidad degradadora de hidrocarburos en ambos medios, acuático y terrestre, son: Achromobacter, Acinetobacter, Alcaligenes, Arthrobacter, Bacillus, Flavobacterium, Nocardia, Pseudomonas spp y Coryneforms. Entre los hongos encontramos Aureobasidium, Candida, Rhodotorula, y Sporobolomyces spp, como los más comunes en medio acuático, y Trichoderma y Mortierella spp. en suelos. El conocimiento de los diversos aspectos de la ecología microbiana y su relación con la fisiología es esencial para estudiar el potencial que presentan los microorganismos para degradar petróleo en ambientes acuáticos y terrestres (Soto et al., 1996). La presencia de microorganismos a la hora de diseñar un proceso de biorremediación es esencial, ya que son los responsables de eliminar el contaminante. Por otro lado, los suelos contaminados con hidrocarburos requieren de una concentración mínima de microorganismos degradadores específicos así como de microorganismos heterótrofos no específicos (Ercoli et al., 2000). Si esta masa crítica no es suficiente se pueden incorporar microorganismos al suelo mediante inoculación, a través del proceso conocido como "bioaumentación".

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Se sabe que microorganismos individuales sólo son capaces de metabolizar un rango limitado de hidrocarburos (Briton, 1984), haciéndose necesario usar una mezcla de poblaciones que posean una amplia capacidad enzimática a fin de poder degradar grupos complejos de hidrocarburos en suelo (Bosscrt y Bartha, 1984). El Objetivo de este trabajo fue el de detectar la presencia de microorganismos capaces de utilizar hidrocarburos como fuente de carbono en suelos contaminados provenientes de la cuenca de Burgos, los cuales puedan ser utilizados para degradar, mediante la inoculación, a estos compuestos derivados del petróleo. MATERIALES Y MÉTODOS Este trabajo de investigación se llevó a cabo en el Laboratorio Ambiental de la Unidad Académica Multidisciplinaría Agronomía y Ciencias de la Universidad Autónoma de Tamaulipas. El suelo utilizado en este ensayo fue colectado en la cuenca de Burgos, particularmente en la zona de perforación ubicada en el municipio de Reynosa Tamaulipas, en un sitio contaminado y otro sitio sin contaminar en la misma zona como lo marca la NOM-138-SEMARNAT/SS-2003. Una vez en el laboratorio se procedió a su análisis, utilizando el método para el aislamiento de microorganismos degradadores de petróleo del Manual de Ecología Microbiana del Instituto Politécnico Nacional (Félix et. al., 1996) Los medios de cultivo usados para el aislamiento de microorganismos que estuvieran presentes en los suelos contaminados, y que tuvieran la capacidad de utilizar a los hidrocarburos como fuente de carbono, fueron dos principalmente: un medio basal para degradadores de hidrocarburo con o sin extracto de levadura al 0.4% (Tabla I). Compuesto Cantidad (NH4)2SO4 7.0 g KH2PO4 5.7 g K2HPO4 2.3 g MgSO4.7H2O 2.2 g Agua destilada 1000 ml Tabla I. Medio de cultivo usado para el aislamiento de lo microorganismos presentes en los suelos contaminados con hidrocarburos. El caldo con y sin levadura, disuelto en agua destilada fue distribuido en matraces de 250ml colocándose 100ml por matraz para ser esterilizado en autoclave a 15 libras de presión durante 15 minutos. Se preparó una serie de 6 matraces conteniendo el medio basal más levadura a dos de ellos se les añadió, a cada uno, 1ml de aceite para lubricación de motor y a otros dos 1ml de diesel, dándoles los siguientes tratamientos (Tabla II):

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Tabla II. Diferentes tratamientos usados : Tratamientos 1 Medio Basal + Levadura 2 Medio Basal + Levadura 3 Medio Basal + Levadura + Aceite 4 Medio Basal + Levadura + Diesel 5 Medio Basal + Levadura + Aceite 6 Medio Basal + Levadura + Diesel

Suelo Intacto Contaminado Intacto Intacto Contaminado Contaminado

Como se menciono anteriormente los suelos utilizados en este ensayo provenían del municipio de Reynosa, Tamaulipas. Para la inoculación de los matraces conteniendo el medio basal más levadura y los diferentes tratamientos se le agregó un gramo de suelo, incubándose a temperatura ambiente en agitación a 200 rpm durante 48 horas (Fig. 1).

Figura1. Matraces conteniendo el medio basal más levadura y los diferentes tratamientos, en agitación a 200 rpm. Una vez que hubo crecimiento microbiano en los matraces, notado por la turbidez del caldo y corroborado a través de frotis que mostraban la presencia de microorganismos, se transfirió 1ml de este cultivo a 100 ml de medio basal sin levadura esterilizado (Fig. 2) colocándose en incubación en la mesa de agitación a 200 rpm durante 48 horas. Tres matraces contenían solo el medio basal, otros 3 se les añadió 1ml de aceite y a otra serie de 3 1 ml de diesel.

Figura 2. Transferencia del cultivo microbiano inicial.

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Transcurrido el tiempo de incubación se observó crecimiento microbiano en los matraces que contenían, además del medio basal, aceite o diesel. Se prepararon cajas petri con este medio basal solidificado con agar. Como el objetivo en esta etapa del ensayo era observar el crecimiento de microorganismos que utilicen a los hidrocarburos o sus derivados como fuente de carbono, se incorporó separadamente al medio de cultivo tanto aceite como diesel en una concentración del 1%. Se sembró por estría a partir de los cultivos microbianos obtenidos en la etapa anterior, se incubó a 37 oC durante 48 horas. RESULTADOS Y DISCUSIÓN En los matraces que contenían el medio basal más levadura mas aceite o diesel e inoculados con suelo contaminado se presentó, a las 48 horas, turbidez que manifestaba crecimiento microbiano. En los frotis realizados a este cultivo se observó la presencia de un gran número de levaduras y de bacterias Gram negativas en menor número. Estos microorganismos son los más comúnmente encontrados en suelos contaminados con hidrocarburos (Bossert y Bartha., 1984) y denotan la capacidad que tienen para degradar a estos compuestos utilizándolos como fuente nutricia. Cabe mencionar que no se determinó el número más probable de microorganismos. Los microorganismos alóctonos como los que utilizan a los hidrocarburos como fuente de carbono, pueden existir en suelos no contaminados en poblaciones pequeñas las cuales son estimuladas por la presencia de estos compuestos (Mark et al., 2004), esto se pudo observar en este ensayo ya que se presentó una ligera turbidez en los matraces con medio basal + levadura + aceite o diesel + suelo intacto de la vecindad de los suelos contaminados. En los frotis realizados aparecen levaduras y hongos como los causantes de esa turbidez. En la resiembra que se hizo utilizando como inóculo a los cultivos microbianos obtenidos en la primera parte del ensayo, está vez con el caldo sin levadura, se observó a las 48 horas una gran turbidez del medio de cultivo. Los microorganismos encontrados en estos matraces eran levaduras y bacilos Gram negativos. Se pudo corroborar con una siembra en placa del crecimiento microbiano detectado en el medio basal + agar + levadura + aceite o diesel e inoculados con suelo contaminado. Se observo en el microscopio crecimiento de colonias color beige, consistencia cremosa, colonias distribuidas a lo largo de la estría y también crecieron en forma aislada, de forma ovalada, diámetro de entre 7.5 mm a 1 mm solo en los medios con hidrocarburos (Fig. 3 4 y 5), en los medios con medio basal + agar + levadura + aceite o diesel + suelo intacto no se observo ningún crecimiento de bacterias o levaduras, al parecer el medio sólido no fue apropiado para el desarrollo de las bacterias que estaban presentes en los cultivos presentes en los caldos.

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Figuras 3 4 y 5. Muestran el crecimiento y la forma de las colonias en las estrías, así como en forma aislada CONCLUSIONES Se detectó en los suelos provenientes de la Cuenca de Burgos en el municipio de Reynosa, Tamaulipas, la presencia de levaduras y bacilos Gram negativos capaces de utilizar a los hidrocarburos como fuente de carbono; estos microorganismos forman parte de las poblaciones normales de estos suelos, ya que se detectó su presencia tanto en suelos intactos como en suelos contaminados. REFERENCIA Atlas, R.M. y Pramer, D. (1990). Focus on Bioremediation of Oil Spills. Journal Chemical Technology Biotechnology. 52: 149-156. Clark, L. (1995). Hydrocarbon pollution control and remediation of groundwater: a brief review. Quarterly Journal of Engineering Geology. 28: 93-100 Empresa REECOTEC. (2004). Félix J. N., Gutiérrez T. C, Lemos A. P., Ortiz M. J., Pescador N. E., Varela L. F., (1996) Manual de laboratorio de ecología microbiana. Instituto Politécnico Nacional, México Ferrari, M.D. (1996). Biodegradación de hidrocarburos aromáticos policíclicos y su aplicación en la biorremediación de suelos y lodos contaminados. Revista Argentina de Microbiología. 28: 83-98 Mark Ibekwe A., Sharon K. Papiernik and Ching-Hong Yang. 2004. Enrichment and molecular characterization of chloropicrin- and metam-sodium-degrading microbial communities. Applied Microbiology and Biotechnology Issue: Volume 66, Number 3. Pages: 325 - 332 Soto J., Gutiérrez T., Lemos A., Ortiz M., Pescador N., Varela L. (1996). Biodegradación y biotransformación de moléculas orgánicas. Manual de Laboratorio de Ecología Microbiana. Instituto Politécnico Nacional. Van Deuren, J., Z. Wang, Z. y J. Ledbetter (1997). Remediation Technologies Screening Matrix and Reference Guide. 3ª Ed. Technology Innovation Office, EPA. http://www.epa.gov/tio/remed.htm.

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