中国农业科学 2005:38(8):1636-1644 Scientia Agricultura Sinica

农杆菌介导的双价抗盐基因转化番茄的研究 刘 晶 1,2， 周树峰 1，陈 华 1，韩和平 1，李银心 1 （1 中国科学院植物研究所光合作用与环境分子生理学重点实验室，北京 100093；2 中国科学院研究生院，北京 100039 ）

摘要：植物的耐盐性是一个多基因控制的复杂性状，将多个耐盐相关基因导入同一植物更有助于提高植物的 耐盐能力。运用农杆菌介导法向转 AtNHX1（拟南芥 Na+/H+逆向运输蛋白编码基因）的番茄（Lycopersicum esculentum L. Moneymaker’）株系 X1OEA1 自交二代植株（T2）中转入山菠菜甜菜碱醛脱氢酶基因（BADH）。PCR、Southern、 RT-PCR 和甜菜碱含量分析结果表明，BADH 已经整合到番茄基因组中，并在转基因植株中转录和翻译表达。叶绿素 荧光（Fv/Fm）、相对电导率（Rc/Rc’）、叶绿素含量（Chla+b）、叶绿素 a/b 比（Chla/b）、光合速率（Pn）测定结 果表明，200 mmol·L-1 NaCl 胁迫下，双转化的番茄植株各项生理指标均优于单转化 AtNHX1 的番茄。转双基因植 株 TT0-2 随着 NaCl 浓度的增加，Fv/Fm 值下降幅度最小；相对电导率与非胁迫条件下相比增加了 3.6 倍，而单转 化 AtNHX1 的 T2 增加了 4.2 倍；与转单基因植株 T2 相比，茎部干重、鲜重分别增加 12.5％、19.8％；叶部干重、 鲜重分别增加 22.5％、14.0％，差异达显著水平。初步证明双基因转化有助于增强番茄的耐盐性。同时对番茄的 转化系统进行优化的结果表明，使用抗生素特美汀的转化效率明显高于头孢霉素的。 关键词：农杆菌；BADH；AtNHX1；双基因转化；耐盐性；番茄

Agrobacterium Mediated Transformation of BADH to the AtNHX1 Transgenic Tomato (Lycopersicum esculentum L. ‘Moneymaker’) LIU Jing1,2, ZHOU Shu-feng1, CHEN Hua1, HAN He-ping1, LI Yin-xin1 （1 Key Laboratory of Phytosynthesis and Environmental Molecular Physiology, Institute of Botany, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100093; 2 The Graduate School of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100039）

Abstract: To evaluate the effects of combined salt tolerant mechanisms, BADH gene from Atriplex hortensis was introduced into the T2 generation of transgenic tomato (L. esculentum ‘Moneymaker’) line X1OEA1 containing AtNHX1 by Agrobacterium tumefaciens mediated transformation. PCR, Southern blot, RT-PCR and betaine measurement indicated that BADH was integrated into the genome of X1OEA1 and functioned properly. Physiological responses of the double transformant to 200 mmol·L-1 NaCl treatment, reflected by photochemical efficiency of PSⅡ(Fv/Fm), relative electronic conductivity (Rc/Rc’), chlorophyll content (Chla+b, Chla/b) and net photosynthetic rate (Pn), were better than those in X1OEA1. The double gene transformed tomato TT0-2 showed the least decrease of Fv/Fm value while the salt concentration increased gradually, and the relative electronic conductivity of TT0-2 and X1OEA1 line T2 plant were 3.6 and 4.2 times higher under 200 mmol·L-1 NaCl treatment compared with normal condition. The stem’s dry weight and fresh weight of TT0-2 were 12.5% and 19.8% higher than that of X1OEA1 line T2 plant, respectively, at the same time, the leaves’ dry weight and fresh weight of which were 22.5% and 14.0% higher. The results indicated that multigene transformation could further improve salt tolerance of plant. Furthermore, the transformation system of tomato was optimized. The results have proved that Timentin is a better antibiotic than cefotaxim for the effective transformation of tomato. Key words: Agrobacterium tumefaciens; BADH; AtNHX1; Double-gene transformation; Salt-tolerance; Tomato

收稿日期：2005-03-15 基金项目：国家“863”计划（2003AA627010）和转基因专项（JY03-A-20-01）资助 作者简介：刘 晶（1981-），女，山西临汾人，硕士，主要从事植物耐盐分子机理的研究。李银心为通讯作者，Tel：010-62836258; Fax: 010-82596139； E-mail: [email protected];

8期

刘

晶等：农杆菌介导的双价抗盐基因转化番茄的研究

土壤盐渍化是影响农业生产和生态环境的严重问 题。在人口不断增加，耕地日趋减少和淡水资源不足 的严重压力下，如何利用大面积的盐碱地、荒漠化土 地和丰富的咸水资源发展农业，已成为生物科学迫切 需要解决的重大课题[1]。而提高作物的耐盐性是开发 [2]

利用盐碱地最根本、最经济和最有效的方法 。

1637

通过采用抗生素特美汀（Timentin）抑制农杆菌，以 期提高番茄的转化效率。

1

材料与方法

1.1 材料 1.1.1 植物材料 转 AtNHX1 基因‘Moneymaker’

植物的耐盐机理十分复杂，包括形态适应、碳代

番茄株系 X1OEA1 自交第一代种子（T1）由原加拿大

谢途径的改变、渗透调节、活性氧的清除以及盐胁迫

多伦多大学植物系 Eduardo Blumwald 惠赠，外源基因

蛋白等。而在高渗条件下，盐生植物主要通过渗透调

在番茄中已稳定遗传。本研究中所用的材料为

节的方式来降低盐胁迫。植物渗透调节的方式主要有

X1OEA1 的自交二代植株（T2）。番茄种子在 70%乙

2 种：一是在细胞中吸收和积累无机盐，如通过离子

醇中浸泡 30 s 后在 10%的次氯酸钠溶液中浸泡 15

+

+

+

通道、Na /H 逆向运输蛋白和 ATP 酶/H 泵；二是在

min，灭菌水冲洗 3～5 次，置于 1/2MS 培养基上萌发

细胞中合成有机溶质，如脯氨酸和甘氨酸甜菜碱。

（温度 24°C ± 2°C，每日光培养 16 h，暗培养 8 h）。

BADH 是甜菜碱合成途径中的 2 个关键酶之一，

播种 8～10 d 后，取番茄幼苗子叶及下胚轴作为转化

其催化产物甜菜碱是一种很重要的渗透调节物质，其

的外植体。得到的转双基因再生植株标记为 TT0，不

在细胞中的积累有利于调节细胞的渗透压，还有助于

同株系标记为 TT0-1，TT0-2。

保护抗氧化酶系统。从山菠菜中克隆的 BADH 基因已

1.1.2 菌株、质粒和抗生素

[3]

[4]

[5]

[6]

[7]

被转入烟草 、水稻 、小麦 、豆瓣菜 、番茄 等 [8]

质粒 pBin438、农杆菌

菌株(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404 由中国科学

农作物及木本植物刺槐 中，增强了这些植物的耐盐

院遗传发育研究所陈受宜提供[6]。抗生素 Timentin（商

性。Jia[7]等将山菠菜 BADH 基因导入番茄，获得的转

品名为特美汀，全称注射用替卡西林钠-克拉维酸钾，

-1

NaCl 的环境中正常生

由 SmithKline Beecham Pharmaceuticals , UK 生产, 购

长，并且在自交第一代保持稳定。离子逆向转运蛋白

自北京大学第三附属医院；头孢霉素购自鼎国生物公

Na+/H+ antiporter 能够逆着 Na+浓度梯度运输，将细胞

司，编号为 DH050-1。

内过高浓度的有害离子排除，或在液泡中区隔化集中，

1.2 方法

从而减少盐离子对细胞质中细胞器的毒害。Zhang 和

1.2.1

基因植株能在含 120 mmol·L

Blumwald 将 AtNHX1 基因转入‘Moneymaker’番茄， -1

转基因番茄能在 200 mmol·L

NaCl 胁迫下生长、开 [9]

花和结实，耐盐性得到显著提高 。

抗生素特美汀对番茄外植体再生的影响 [14]

茄的转化参照吴昌银等

番

的方法进行，将番茄外植体

在 PCM 培养基（表 1） 上预培养 2 d，用农杆菌 LBA4404 侵染后在 CCM 培养基上、28℃ 黑暗条件下共培养 2

植物的耐盐性是一个多基因控制的复杂性状，将

d，转入 SIM 培养基（SIM1-SIM4）上筛选转化体。3

2 个甚至多个耐盐相关基因转入同一植物（即所谓的

周后统计不同 SIM 培养基上产生再生芽的外植体数、

“复合基因转化”）将会大大提高转基因植物的耐盐

再生频率和每块外植体上平均再生芽点数。各个 SIM

能力

[10,11]

。为此，笔者通过农杆菌二次介导法将山菠

培养基的处理设置 3 个重复，每个重复设 60～70 块外

菜甜菜碱醛脱氢酶基因（BADH）导入转 AtNHX1 基

植体，每瓶接种 8～10 个外植体。

因番茄（Lycopersicum esculentum L. ‘Moneymaker’）

1.2.2 再生植株的获得

株系 X1OEA1 的自交二代植株中，以期通过双基因导

茄再生频率的差异，选用再生率最高的 SIM4 培养基

入进一步提高转基因番茄植株的耐盐性。

作为转化后 0～3 周的筛选培养基，3 周后将产生再生

根据不同 SIM 培养基上番

番茄作为世界上最重要的蔬菜作物之一，具有很

芽的外植体移至 SIM5 培养基上继续培养，待转化再

高的经济价值，亦是利用基因工程进行遗传转化的模

生植株长至 1～2 cm 时，切下转到 RM 培养基上诱导

式植物之一。然而目前在番茄遗传转化中还存在许多

生根。3 周后当根系较发达时移至温室中生长。

问题有待解决。例如在农杆菌介导的转化系统中，头

1.2.3 转基因植株的 PCR 检测 采用 CTAB 方法[15]，

孢霉素和羧苄青霉素是用来抑制农杆菌生长的普遍使

分别从转化植株和非转化植株叶片中提取 DNA 模扳，

用的抗生素，但它们在抑菌的同时，对芽的分化也有

BADH 基因的 PCR 检测采用肖岗等[16]设计的一对引

很明显的抑制作用，使转化频率显著降低[12,13]。本文

物 ， 序 列 为 5´-AGAATGGCGTTCCCAATTCCT

中

1638

国

农

业

科

学

38 卷

GCTC-3´(P1) ， 5´-TTCAAGGAGACTTGTACCATCC

AAGC-3´(P4)，扩增片断大小应为 690 bp，由上海生

CCA-3´(P2)，扩增片断大小应为 1.5 kb，由上海生工公司

工公司合成。反应程序：94℃变性 4 min 后进入循环，

合成； 根据 NCBI 数据库中 AtNHX1 基因序列设计 AtNHX1

94℃变性 30 s，54℃复性 30 s，72℃延伸 1.5 min，35

基因的 PCR 检测引物，序列为 5´-ATGTTGGATTCT

个循环，72℃延伸 10 min，PCR 扩增产物用 1.0％琼

CTAGTGTGG-3´(P3)，5´-TCAGACCGGTTGCAGCACC

脂糖凝胶电泳检测。

表1

番茄转化系统中各培养基的组成

Table 1 Composition of culture media in tomato transformation experiments 萌发培养基

Item

Germination medium

预培养基

分化筛选培养基 Shoot induction medium

共培养基

Preculture medium

Co-culture medium

生根培养基

1

2

3

4

5

MS

50%

100%

100%

100%

100%

100%

100%

100%

IAA (mg·L-1)

－

0.1

0.1

0.1

0.1

0.1

0.1

0.5

Zeatin (mg·L-1)

－

1.0

1.0

1.0

1.0

1.0

1.0

0.5

Kanamycin (mg·L-1)

－

Cefotaxim (mg·L-1) Timentin (mg·L-1) Agar (g·L-1)

Rooting medium 50% － －

－

－

50

－

－

－

500

－

－

－

－

－

－

－

－

－

150

300

450

450

150

8

8

8

8

8

8

8

8

8

1.2.4 Southern 杂交 取 20 µg 番茄 DNA，分别用 [17]

50

50

50

50

50

LI-COR, American)测定叶片的光合速率。

BamHⅠ和 Hind III 酶切后，参照分子克隆实验指南

1.2.8

进行 Southern 杂交， 所用探针为 BADH 基因扩增产物，

光 度 计 (UV-160A, Shimadzu Scientific Instrument,

32

叶绿素含量(Chla+b, Chla/b)测定

采用分光

用α- P-dCTP 标记探针。

Japan)，按李合生等[18]的方法测定叶绿素含量。

1.2.5 RT-PCR 检测 取阳性植株的幼嫩叶片 0.1 g，

1.2.9

采用 Invitrogen 公司 Trizol Reagent 试剂盒提取叶片总

TSP, American)，按陈少良等[19]反相 HPLC 离子对色

RNA。反转录采用 invitrogen 公司的 SuperscriptIII 反

谱法测定甜菜碱含量。

甜菜碱含量测定

采用液相色谱系统(HPLC,

转录酶及 OligdT，反转录出 mRNA 的 cDNA 第一链，

1.2.10 叶片相对电导率的测定

然后以此为模板，分别用 1.2.3 中所使用的两对引物及

叶片，每份 0.5 g，各加 30 ml 超纯水。一份于 25℃、

PCR 反应程序进行扩增，扩增产物用 1.0％琼脂糖凝

100 r/min 振荡 4 h，另一份煮沸 30 min。之后分别用

胶电泳检测。

电导率仪（Hi-9033, HANNA, Italy）测定两份溶液的

1.2.6

不同转基因类型番茄植株的耐盐性鉴定

将

每棵植株称取 2 份

电导率。前者定义为 Rc，后者定义为 Rc’，相对电导

检 测 为 阳 性 的 再 生 苗 及 转 AtNHX1 基 因 株 系

率＝Rc/Rc’×100%。

X1OEA1、‘Moneymaker’番茄无菌苗通过无性扦插

1.2.11

的方式扩繁，得到克隆群体。待扩繁苗长到 5～6 cm

（PAM-2000, walz, Germany）在室温下测定 Fv/Fm，

后移栽到 1/2 Hoagland 营养液中水培，待叶片充分展

测定前叶片暗适应 20 min。

开，根系发达后，选取长势良好、生长一致的各类型

1.2.12 统计分析方法 多重比较采用 SPSS10.0 (for

植 株 进 行 盐 分 胁 迫 处 理 。 其 中 一 组 培 养 于 1/2

Windows)软件包进行统计分析。

Hoagland 营养液作为对照，另一组培养于加有 200 mmol·L-1 NaCl 的 1/2 Hoagland 营养液中，盐浓度按照 每 5 天增加 50 mmol·L-1 的方式递增至 200 mmol·L-1。 采用随机区组设计，各处理设置 3 个重复，每个重复 6 株。每次加盐后的第 5 d 测定叶绿素荧光，待 200 -1

2

叶绿素荧光的测定

采用便携式荧光仪

结果与分析

2.1 转基因番茄植株的获得 外植体用土壤农杆菌感染 2～3 周后，伤口处能分 化出淡黄色愈伤（图 1A） ，继续培养能长出绿色芽点，

mmol·L NaCl 持续 2 周后测定光合速率、叶绿素含量、

并再生出小芽（图 1B）。切下转到 RM 培养基上，3

甜菜碱含量、叶片相对电导率、鲜重、干重。

周后根系较发达（图 1C），移至温室中生长（图 1D） 。

1.2.7

2.2 抗生素特美汀对番茄外植体再生频率的影响

光 合 速 率 (Pn) 测 定

采 用 光 合 仪 (LI-6400,

8期

刘

晶等：农杆菌介导的双价抗盐基因转化番茄的研究

1639

在番茄抗性分化筛选培养基中添加不同种类及浓

特美汀（SIM4）比 500 mg·L-1 头孢霉素（SIM1），外

度的抗生素（表 1），外植体接种 3 周后统计其在各

植体再生芽频率提高 6 倍以上，同时每块外植体上平

种培养基上的再生频率。结果表明（表 2），450 mg·L-1

均再生芽点数目增加 2 倍。

表2

抗生素特美汀对番茄外植体再生频率的影响

Table 2

Effect of Timentin on regeneration frequency of tomato explants

培养基

外植体数 1)

产生再生芽的外植体数

再生频率 2)

每块外植体上平均再生芽点数

Culture medium

Number of explants

Number of regenerated explants

Regeneration frequency (%)

Average number of shoots on every regenerated

SIM1

64.4

SIM2

66.5

SIM3 SIM4

7.0±0.57a

10.9±0.30a

2.3±0.58a

24.8±1.2b

37.3±0.93b

5.3±1.5b

63.1

34.9±1.2c

55.3±1.2c

6.3±0.58c

61.9

44.9±1.5d

72.6±1.3d

6.3±1.5c

1)

外植体数为 3 个重复的平均值 Number of explants is the average of three repeats

2)

再生频率＝产生再生芽的外植体数/外植体数 Regeneration frequency= Number of regenerated explants/ Number of explants

表中所示数据是 3 个重复的平均值并计算标准误，每组数据中相同字母表示差异不显著（P≤0.05, n=3）。下同 Data represent the mean values ± SE of three independent experiments. The same letter for each column is not different statistically at 5% probability, by LSD multiple comparisons. (n=3) . The same as below

A. 愈伤的分化；B. 抗性芽的再生；C. 再生芽生根；D. 再生植株的移栽 A. Selection of antibiotic-resistant calli; B. Regeneration of antibiotic-resistant shoots; C. The rooting of seedling; D. The seedling was transferred to soil

图1

转双基因番茄植株的获得

Fig. 1 Obtaining of double-gene transformed tomato plants

2.3 转双基因番茄的 PCR 检测 分别用两对引物 P1、P2；P3、P4 对得到的两个 转双基因株系 TT0-1、TT0-2 进行 PCR 扩增。均得到 了预期分子量 1.5 kb 和 690 bp 的条带，与阳性对照扩

有条带，证明外源 BADH 基因已经整合到目标植物基 因组中。 2.5 BADH、AtNHX1 基因在转基因番茄中的转录表达 选取 TT0-1、TT0-2 两个株系的转基因番茄植株，

增出的条带完全相同，而未转化的番茄 DNA 则未扩

提取叶片总 RNA，然后以 mRNA 反转录出的 cDNA

增出相应的条带（图 2A、2B），说明外源目的基因

为模板，分别用 P1、P2；P3、P4 两对引物进行 PCR

BADH 已插入番茄基因组中。

扩增，扩增出 1.5 kb 和 690 bp 大小的条带，而对照

2.4 BADH 基因在转基因番茄基因组中的整合 选取 TT0-1、TT0-2 两个株系的转基因番茄植株， 提取叶片总 DNA，分别用 Hind III、BamHⅠ完全酶切 后进行 Southern 杂交。结果表明，两个株系均检测到 了杂交带（图 2C）。其中 TT0-1 有 2 条带，推测其基 因组中插入 2 个拷贝的目的基因；TT0-2 有 1 条带， 推测其基因组中插入 1 个拷贝的目的基因。对照中没

WT 没有（图 2D），说明这两个基因在转录水平上进 行了表达。 2.6 转基因番茄甜菜碱含量的测定 在 200 mmol·L-1 NaCl 胁迫下，转基因番茄植株 TT0-2 的甜菜碱含量明显增加，由胁迫前的 0.503 µg·g-1FW 增加至 2.314 µg·g-1FW；而单转 AtNHX1 基 因的 T2 番茄植株中甜菜碱含量分别为 0.197 µg·g-1

中

1640

M

WT

P TT0-1 TT 0-2 M

WT T2

国

农

M

TT0-1 TT 0-2

业

科

学

38 卷

WT TT0-1 TT 0-2 TT0-1 TT 0-2 WT

1

2

3

4

5

6

1.5 kb 690 bp A

C

B

D

A. 转双基因植株 BADH 基因 PCR 检测；B. 转双基因植株 AtNHX1 基因 PCR 检测；C. 转双基因植株 RT-PCR 检测；D. 转双基因植株 BADH 基因 Southern 检测，1～3 分别为 WT、TT0-1、TT 0-2，4～6 分别为 TT0-1、TT 0-2、WT；M. DL2000 marker；WT. 野生型植株；P. 质粒 pBin438；T2. 转 AtNHX1 番茄株系 X1OEA1 T2 代植株；TT0-1、TT 0-2. 转 AtNHX1、BADH 双基因植株 A. PCR analysis of BADH gene; B. PCR analysis of AtNHX1 gene; C. RT-PCR analysis of double-gene transformed plants; D. Southern hybridization result of BADH transgenic plants, 1-3 are WT, TT0-1, TT 0-2 respectively, 4-6 are TT0-1, TT 0-2, WT respectively; M. DL2000 marker; WT. Wild type plant; P. Plasmid pBin438; T2. T2 individual of transgenic tomato line X1OEA1; TT0-1, TT 0-2. BADH and AtNHX1 double-gene transformed plants

图2 Fig.2

转双基因植株分子检测

Molecular analysis of double-gene transformed tomato plants

FW、0.281 µg·g-1FW，几乎检测不到（图 3），多重 比较统计分析表明，它们之间甜菜碱含量的差异达显 著水平。

图4

200 mmol·L-1 NaCl 胁迫对转基因和非转基因番茄表型 的影响

Fig. 4

Effects of 200 mmol·L-1 NaCl on phenotype of wild type and transgenic tomato lines

2.7.2 盐胁迫下转基因番茄鲜重、干重测定 盐胁迫 下，转基因番茄根、茎、叶各部分的鲜重、干重明显 图中所示数据是 3 个重复的平均值并计算标准误，每组数据中相同字母 表示差异不显著（P≤0.05, n=3）。下同 Data represent the mean values ± SE of three independent experiments. The same letter for each line is not different statistically at 5% probability, by LSD multiple comparisons (n=3) . The same as below

高于对照野生型番茄，呈显著性差异（表 3）。转双 基因植株 TT0-2 与转单基因植株 T2 相比，茎部干重、 鲜重分别增加 12.5%、19.8%；叶部干重、鲜重分别增 加 22.5%、14.0%，差异达显著水平；而根部干重、鲜

图3

200 mmol·L-1 NaCl 胁迫对转基因和非转基因番茄甜菜

重分别增加了 2.8%、2.2%，差异不显著。

碱含量的影响

2.7.3

Fig. 3

Betaine content of wild type and transgenic tomato -1

叶绿素荧光的测定(Fv/Fm)

Fv/Fm 代表 PS

Ⅱ的原初光能转换效率。盐胁迫会使 PSⅡ反应中心受 到伤害，同时提高系统热耗散，从而降低 Fv/Fm 值[20]。

lines under 200 mmol·L NaCl stress

因此，盐胁迫对 Fv/Fm 值减幅的影响越小，说明抵抗 2.7 转基因番茄的耐盐性分析

盐胁迫的能力越强。在盐胁迫下野生型植株 Fv/Fm 下 -1

降的幅度最大（图 5） ，说明其受伤害严重，抗盐能力

NaCl 胁迫下，转单、双基因番茄 T2、TT0-2 均可正常

差；转单基因 AtNHX1 的 T2 代植株 Fv/Fm 下降幅度

生长、开花结果，而野生型叶片变黄，基部叶片脱落

较小，说明 PSⅡ反应中心受到的伤害较小，抗盐能力

并伴有坏死；盐胁迫对野生型植株根的影响也远大于

有所提高；转双基因植株 TT0-2 的 Fv/Fm 下降幅度最

转单、双基因番茄植株，200 mmol·L-1 NaCl 明显抑制

小，说明它在盐胁迫下所受到的伤害最小，抗盐性提

了其根部的伸长和须根的生长（图 4）。

高幅度最大。

2.7.1

盐胁迫下转基因番茄的表型

200 mmol·L

8期

刘

晶等：农杆菌介导的双价抗盐基因转化番茄的研究

1641

2.7.5 叶绿素含量(Chla+b, Chla/b)、光合速率（Pn） 的测定

叶绿素在植物光合作用中起吸收光能的作

用，叶绿素 a 和叶绿素 b 分别是光合作用的主要色素 和辅助色素，其含量在一定程度上体现了植物光合能 力的大小，叶绿素 a/b 的值反映了与光合作用相关的 各种酶类活性的高低[22]；光合速率（Pn）的大小直接 反映光合作用的强弱。植物受到盐胁迫时，会直接或 间接地影响到叶绿素的含量。因此，叶绿素含量下降 可以看成是植株受害后的重要生理反应，从其下降幅 度，可以比较其受害程度[23]。从表 4 可以看出，盐处 理下转双基因番茄植株 TT0-2 叶绿素 a+b 含量、叶绿 素 a/b 的值和光合速率明显高于野生型，多重比较统 图 5

Fig. 5

不同浓度 NaCl 胁迫对转基因和非转基因番茄叶片

计分析表明它们之间的差异达显著水平。说明转基因

Fv/Fm 的影响

番茄植株在盐胁迫下所受伤害较小，耐盐性显著提高。

Effects of different concentration NaCl on Fv/Fm of tomato leaves

2.7.4

转基因植株的相对电导率(Rc/Rc’) 相对电导

率反映细胞膜在渗透胁迫下受到伤害的程度，是细胞 膜在逆境胁迫下是否具有生理活性的重要指标之一。 相对电导率越低，表明细胞质电解液外渗的越少，细 胞膜受到破坏的程度越低，细胞受到的伤害越小[21]， 抗盐胁迫能力越强。如图 6 所示，与转基因植株在未 受 NaCl 胁 迫 下 相 对 电 导 率 基 本 相 同 ； 而 在 200 mmol·L-1 NaCl 胁迫后，野生型植株的相对电导率显 著增加（是原来的 6 倍）；转单基因 AtNHX1 的植株 T2 和转双基因植株 TT0-2 中相对电导率分别增加了 4.2 倍和 3.6 倍，多重比较统计分析表明，两者与野生

图 6

型植株的相对电导率相比具有显著性差异。表明外源 基因的导入提高了植株的耐盐性，使细胞受伤害程度

电导率的影响 Fig. 6

较野生型小。 表3

200 mmol·L-1NaCl 胁迫对转基因和非转基因番茄相对 Effects of 200 mmol·L-1 NaCl on Rc/Rc’ of wild type and transgenic tomato lines

200 mmol·L

-1

NaCl 胁迫下转基因番茄的鲜重、干重（g/株）

Table 3 The fresh weight and dry weight of transgenic tomato lines under 200 mmol·L-1 NaCl stress 植物材料 Plant material

鲜重 FW

TT0-2 T2 WT

40.07±2.47a 33.42±2.08b 11.29±0.80c

表4

茎 Stem 干重 DW 5.31±0.15a 4.72±0.13b 1.31±0.09c

鲜重 FW 4.81±0.33a 4.22±0.27b 1.21±0.20c

叶 Leaf 干重 DW

鲜重 FW

2.61±0.21a 2.13±0.18b 0.64±0.15c

根 Root 干重 DW

8.16±0.21a 7.99±0.17a 1.79±0.12b

200 mmol·L-1 NaCl 胁迫对转基因和非转基因番茄叶绿素含量、光合速率的影响

Table 4

Effects of 200 mmol·L-1 NaCl on Chla+b, Chla/b, and Pn of wild type and transgenic tomato lines

植物材料 Plant material WT T2 TT0-2

总叶绿素含量 Chla+b (mg·g-1) 0.79±0.14 b 1.55±0.14a 1.61±0.15a

叶绿素 a/叶绿素 b Chla/b 1.83±0.29b 2.32±0.15a 2.44±0.33a

光合速率 Pn (µmol ·CO2·m-2·s-1) 0b 3.33±0.27 a 3.74±0.25 a

0.73±0.08a 0.71±0.15a 0.13±0.07b

中

1642

3

国

农

业

科

学

38 卷

茄‘Moneymaker’中，并对野生型、转 AtNHX1 单基

讨论

因 T2 植株、转双基因植株 TT0-2 三种类型的番茄进

抗生素特美汀（Timentin）是一种具有广谱杀菌

行了盐胁迫下叶绿素荧光、相对电导率、光合速率、

作用的抗生素，其主要成分是替卡西林钠（ticarcillin

叶绿素含量及甜菜碱含量等 s 多方面的测定。分子鉴

sodium）及克拉维酸钾（potassium clavulanate）。替卡

定结果表明， 在转双基因植株 TT0-2 中 AtNHX1、BADH

西林钠是盘尼西林家族的β-内酰胺类抗生素，有类似

基 因 均 获 得 转 录 表 达 。 耐 盐 性 鉴 定 表 明 ， 在 200

植物激素的结构特征，当它们分解的时候就能够起到

mmol·L-1 NaCl 胁迫下，转单、双基因番茄 T2、TT0-2

与植物生长激素类似的作用，因此能够在组织培养中

均可正常生长，而野生型叶片变黄，基部叶片脱落并

[24]

。研究表明，当特美汀浓度

伴有坏死，根部生长受到严重影响（图 4）；转双基

为 150 mg·L 时能有效抑制农杆菌的生长；在浓度为

因番茄植株 TT0-2 在盐胁迫下的各项生理指标优于转

提高外植体的再生频率 -1

-1

200～500 mg·L 时，对烟草和榆树芽的再生有促进作 [25]

[26]

研究表明，使用特美汀能够促进

随着 NaCl 浓度的增加，转双基因植株 TT0-2 的 Fv/Fm

番茄芽的再生，同时转化频率比使用头孢的高 40%以

值下降幅度最小，即在盐胁迫下所受到的伤害最小（图

上。本试验中，使用 450 mg·L-1 特美汀（SIM4，表 1）

5） 。这是由于转双基因番茄中 AtNHX1 基因的超表达，

用

。H-Q Ling 等

单基因番茄植株 T2。在叶绿素荧光测定中，盐处理下

-1

比使用 500 mg·L 头孢霉素（SIM1），外植体再生芽

使得 Na+/H+逆向转运蛋白更高效地将 Na+区隔化，减

频率和每块外植体上平均再生芽点数目分别增加 6 倍

小 Na+毒害并调节渗透势；同时 BADH 基因的表达受

和 2 倍。进一步说明了抗生素特美汀对番茄芽的再生

盐胁迫诱导，使得植物体内甜菜碱含量明显增加（图

有促进作用，是番茄转化过程中效果较好的抑菌抗生

3），甜菜碱可以保护盐胁迫下玉米线粒体复合物Ⅱ，

素类。

避免 NaCl 的伤害[29],并稳定蓝藻光系统Ⅱ（PSⅡ）外

目前，植物耐盐基因工程主要集中在两个方面，

周多肽和锰簇[30]，因此对 PSⅡ有较强的保护能力。盐

即无机离子区域化集中和有机相容性物质的合成。无

胁迫下转双基因番茄植株 TT0-2 的相对电导率低于野

机离子和有机溶质对植物的渗透调节作用是相辅相成

生型植株，且有显著差异,但与转单基因植株 T2 相比，

的。无机离子被植物吸收后，通过逆向运输蛋白被运

差异不显著（图 6）。同时,转双基因番茄植株 TT0-2

入液泡内与细胞质隔离，而有机溶质主要存在于细胞

的叶绿素含量、叶绿素 a/b 的值和光合速率明显高于

质中调节渗透压。只有无机离子而缺少了有机溶质，

野生型，亦呈显著差异,而与转单基因植株 T2 相比,差

细胞质的渗透势难以得到平衡；相反，如果只依靠有

异不显著（表 4）。推测可能原因是由于液泡在整个植

机溶质进行渗透调节，则细胞需要消耗大量的物质和

物细胞中所占体积极大，所以离子区隔化在渗透调节

能量来合成有机溶质降低渗透势，对细胞的生长也是

中起主要作用，而有机溶质的合成和积累对调渗的影

极其不利的。因此，同时提高离子区域化能力和有机

响相对弱之。

溶质的合成能力才会大大提高植物的耐盐性。 研究表明，过量表达编码液泡膜 Na+/H+ antiporter

4

结论

的基因 NHX1 和编码细胞质膜 Na+/H+ antiporter 的基

通过农杆菌二次介导法将山菠菜甜菜碱醛脱氢酶

因 SOS1，能够使植物的耐盐性得到较显著提高[9,27]；

基 因 （ BADH ） 导 入 转 AtNHX1 基 因 的 番 茄

通过导入 CMO、BADH 等甜菜碱合成途径的关键基因

（Lycopersicum esculentum L. ‘Moneymaker’）株系

[7]

也能改善植物的耐盐性 。但耐盐性属于多基因控制

X1OEA1 的自交二代植株中，通过对再生植株的分子

的复杂性状，单个基因的导入难以从根本上解决植物

检测以及表型观察和叶绿素荧光、相对电导率、光合

+

+

的耐盐性问题。Na /H antiporter 的逆向运输能力依然

速率、叶绿素含量等多项生理指标的测定表明，在 200

有限；已转化成功的甜菜碱基因工程植株尽管在盐胁

mmol·L-1 NaCl 胁迫下，转基因番茄植株的表型及各

迫下体内的甜菜碱含量显著增加，但没有一种转基因 植物的甜菜碱含量能超过 1 µmol·g-1FW，这个水平比

项生理指标均优于野生型番茄，且转双基因番茄植株

起许多能够自身合成并积累甜菜碱的物种来低 10～

基因工程方法能够改善番茄植物的耐盐性；相对于单

[28]

100 倍

。

本试验通过二次转化方式将 BADH 基因导入番

各项生理指标及表型均优于转单基因番茄植株。说明 基因转化，双基因的导入能够更进一步增强耐盐性提 高的效果。

8期

刘

晶等：农杆菌介导的双价抗盐基因转化番茄的研究

1643

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(责任编辑 曲来娥)