Acta Sc Sci. Pol., Medicina Veterinaria 7(3) 2008, 15-24

WYSOKIE CI NIEN ENIA HYDROSTATYCZNE JAKO METODA INA NAKTYWACJI CAMPYLOBACTER R JJEJUNI W "YWNO CI POCHODZENIA ZW WIERZ!CEGO1 Agnieszka Jackowska--Tracz, Michał Tracz Szkoła Główna Gospodarst arstwa Wiejskiego w Warszawie Streszczenie. Okre lono wp wpływ ró!nych parametrów wysokiego ci nienia hydrostatyczznego na prze!ywalno " Cam ampylobacter jejuni w mi#sie wieprzowym. Sterylne 10 g próbki bki zmielonego mi#sa wieprzow zowego (karkówka) umieszczano w torebkach poliamidowo--polietylenowych (PA/PE)) i zaszczepiano mieszanin% trzech szczepów Campylobacter ter jejuni w stacjonarnej fazie ie wzrostu (inoculum 5.36 x106 jtk x g-1). Nast#pnie próbki bki zamykano szczelnie przy uu!yciu zamykarki pró!niowej i poddawano obróbce wysoko-ci nieniowej (UHP) o nast#p t puj%cych parametrach: 200, 300 i 400 MPa przez okres 5, 10 i 15 minut w temperaturzee 44°C. Bezpo rednio po ci nieniowaniu wykonywano kolejne, ne, 10-krotne rozcie$czenia i po posiewy na podło!e Karmali agar, które inkubowano w temp. p. 42°C przez 48±3h w atmosf osferze mikroaerofinej (85% N2, 10% CO2, 5% O2). Okre lono no zakres redukcji liczby Camp mpylobacter jejuni w mi#sie wieprzowym poprzez wyliczenie nie dawek D10 metod% regresjii li liniowej. Wykazano, !e do dziesi#ciokrotnej redukcji C. jejuni uni w pakowanym pró!niowoo mi#sie wieprzowym niezb#dne jest zastosowanie ci nienia nia o warto ci 200 MPa przez 46 46.15 min lub 300 MPa przez 4.27 min. Słowa kluczowe: Campylob lobacter, obróbka wysokoci nieniowa (UHP), bezpiecze$stwo wo !ywno ci, inaktywacja drob obnoustrojów

WST!P Zapewnienie bezpiecznej ej !ywno ci jest strategicznym celem działa$ podejmo owanych przez organizacje handlo dlowe, rz%dy i organizacje pozarz%dowe. Jednym z zagro ro!e$, jakie mo!e stanowi" !ywnoo " zwierz#cego pochodzenia, jest obecno " w niej pato atogenów. S% to głównie takie dro drobnoustroje, jak Salmonella sp., Escherichia coli, Yersi rsinia enterocolitica, Shigella sp., Vibrio sp., Aeromonas sp., Plesiomonas sp., Clostrid ridium botulinum i Clostridium pe perfringens, Bacillus cereus oraz Staphylococcus aure ureus. Adres do korespondencji – Corr orresponding author: Agnieszka Jackowska-Tracz, Katedra Higi igieny &ywno ci i Ochrony Zdrowia wia Publicznego, Wydział Medycyny Weterynaryjnej SG GGW w Warszawie, ul. Nowoursynow owska 159, 02-776 Warszawa.

16

A. Jackowska-Tracz, M. Tracz

Jednak, w stosunku do patogenów zwi%zanych z produkcj% !ywno ci pochodzenia zwierz#cego, w literaturze wiatowej pojawia si# okre lenie „new emerging pathogens” – jest to grupa „nowych” czynników etiologicznych zaka!e$ pokarmowych u ludzi, w ród których najcz# ciej wymienia si# Campylobacter sp., Listeria monocytogenes oraz Escherichia coli O157: H7. Wła nie te drobnoustroje s% obecnie jednym z najnowszych wyzwa$ dla Inspekcji Weterynaryjnej oraz Pa$stwowej Inspekcji Sanitarnej. W odniesieniu do wiatowych danych epidemiologicznych najcz#stsz% przyczyn% zatru" pokarmowych w wi#kszo ci krajów zachodnioeuropejskich s% obecnie pałeczki z rodzaju Campylobacter, w tym gatunek Campylobacter jejuni. W wielu krajach, gdzie prowadzone s% regularne badania epidemiologiczne, cz#sto " izolacji pałeczek Campylobacter znacznie przewy!sza cz#sto " izolacji pałeczek Salmonella. Według raportów Europejskiego Urz#du do spraw Bezpiecze$stwa &ywno ci – EFSA, dotycz%cych wyst#powania chorób odzwierz#cych u ludzi, liczba przypadków kampylobakteriozy, wynosz%ca ok. 150 tys. w 2002 r., wzrastała z roku na rok, osi%gaj%c w krajach Unii Europejskiej ponad 200 tys. przypadków zachorowa$ w roku 2005 [Osek 2008]. Nazwa rodzajowa Campylobacter wywodzi si# z j#zyka greckiego, campylo oznacza zakrzywiony, a bacter – pałka lub pr#t. I faktycznie, Campylobacter jejuni to stosunkowo mała (0,5–5 µm x 0,2–0,8 µm) Gram-ujemna pałeczka wykazuj%ca, dzi#ki polarnie umiejscowionej rz#sce lub rz#skom, charakterystyczny korkoci%gowy ruch [Snelling i in 2005]. Kształt jej opisywany jest jako skrzydło mewy, przecinek, spirala czy litera S. Campylobacter sp. to bakteria mikroaerofilna, niezdolna do wzrostu w atmosferze o normalnym 21% st#!eniu tlenu, które działa na ni% bakteriostatycznie. Do wzrostu wymaga modyfikowanej atmosfery z obni!on% zawarto ci% tlenu [Altekruse i in. 1999]. Campyloabter sp. jest bakteri% termofiln%, najlepszy wzrost wykazuje w temperaturze około 37–42°C [Doyle 2001]. Głównym rezerwuarem zarazka s% ptaki, w tym drób, których temperatura ciała wynosi 41–42°C. Bakterie kolonizuj% głównie jelito lepe, jelito grube i kloak# [Berry i in. 1988]. Pałeczki Campylobacter s% cz# ci% mikroflory przewodu pokarmowego wielu gatunków zwierz%t. Izolowano je z przewodu pokarmowego zwierz%t towarzysz%cych (psy, koty), od zwierz%t egzotycznych w ogrodach zoologicznych, a tak!e od zwierz%t rze'nych, takich jak bydło, kozy, owce oraz trzoda chlewna. W ród zwierz%t rze'nych drób jest głównym 'ródłem Campylobacter w rodowisku – zdrowe ptaki mog% wydala" ok. 102–107 komórek na 1 g kału. Zdaniem Daczkowskiej-Kozon [2004] bardzo du!a ilo " odchodów, uzyskiwanych przy obecnej skali hodowli trzody chlewnej, sprawia, !e trzoda chlewna równie! stanowi istotne 'ródło wyst#powania Campylobacter w rodowisku. Najcz#stsz% przyczyn% zatru" pokarmowych u ludzi wywołanych przez pałeczki Campylobacter jest spo!ycie nieodpowiednio przygotowanego drobiu. Jednak odnotowywano tak!e przypadki zatru" po spo!yciu wieprzowiny, wołowiny i jagni#ciny [Wilson i Moore 1996]. Minimalna dawka wywołuj%ca ostre zapalenie jelit u ludzi to 500 komórek Campylobacter [Black i in. 1988, Popowski 1994, Nachamkin i in. 2000]. Zwierz#ta, które s% najcz# ciej nosicielami Campylobacter, zwykle nie wykazuj% !adnych objawów chorobowych, w zwi%zku z tym nie s% eliminowane podczas rutynowych bada$ przedi poubojowych przeprowadzanych w rze'ni przez lekarza weterynarii. W zakładach przetwórstwa spo!ywczego podczas zabiegów technologicznych cz#sto dochodzi do ska!enia powierzchni tusz pałeczkami Campylobacter bytuj%cymi w jelitach zwierz%t, a tak!e w powłoce zewn#trznej, np. na szczecinie trzody chlewnej. Sytuacja ta wymusza

Acta Sci. Pol.

Wysokie ci nienia hydrostatyczne…

17

na producentach !ywno ci pochodzenia zwierz#cego konieczno " stosowania zabiegów technologicznych zapewniaj%cych inaktywacj# drobnoustrojów chorobotwórczych obecnych w surowcach i gotowych produktach. Podstawowym sposobem inaktywacji szkodliwych czynników mikrobiologicznych w !ywno ci, w tym równie! pałeczek Campylobacter, jest obróbka termiczna, której efekty zale!% głównie od wysoko ci temperatury i czasu ogrzewania. Do „nowych” alternatywnych metod inaktywacji drobnoustrojów zaliczy" mo!na promieniowanie jonizuj%ce, mikrofalowe i UV, oraz wysokie ci nienie hydrostatyczne (ang. Ultra High Pressure – UHP lub High Pressure Processing – HHP). Szczególnie du!y potencjał posiada pasteryzacja wysokoci nieniowa, która mo!e by" wykorzystana zarówno do bezpo redniej inaktywacji patogenów w surowcach zwierz#cych, jak i do niszczenia patogenów w gotowych produktach, które w procesie przetwarzania poddane były obróbce termicznej, a nast#pnie doszło do wtórnego ska!enia produktu podczas procesu plasterkowania i pakowania. MATERIAŁ I METODY Podczas badania oceniono wpływ wysokiego ci nienia hydrostatycznego na prze!ywalno " Campylobacter jejuni w mi#sie wieprzowym zamykanym pró!niowo. Badanie obejmowało trzy do wiadczenia, podczas których próbki mi#sa wieprzowego, sztucznie zaka!one Campylobacter jejuni, poddawano działaniu wysokiego ci nienia hydrostatycznego o warto ci 200, 300 i 400 MPa. Inoculum stanowiła mieszanina trzech szczepów Campylobacter jejuni. Szczepy Campylobacter jejuni 34 i Campylobacter jejuni 6, otrzymane z laboratorium Katedry Weterynaryjnej Ochrony Zdrowia Publicznego, Wydziału Medycyny Weterynaryjnej, Uniwersytetu Warmi$sko-Mazurskiego w Olszynie, zostały wyizolowane z kloaki kurcz%t. Szczep Campylobacter jejuni 10/06, otrzymany z laboratorium Instytutu Naukowo-Badawczego Pa$stwowego Zakładu Higieny w Warszawie, został wyizolowany z materiałów klinicznych od hospitalizowanego dziecka z biegunk%. Wszystkie szczepy przechowywane były w temperaturze –80°C na podło!u z wyci%giem mózgowo-sercowym BHI (Oxoid®, CM 0225) z 20% dodatkiem glicerolu. Przed przyst%pieniem do do wiadczenia szczepy zostały przepasa!owane na podło!u Karmali Agar Base (Oxoid®, CM 0935) z suplementem Modified Karmali Selective Supp. (Oxoid®, SR 0205E). Inkubacja trwała 48h±3h w temperaturze 42°C w atmosferze mikroaerofilnej przy u!yciu komercyjnych systemów do inkubacji BD GasPakTM EZ. Po trzech pozytywnych pasa!ach szczepy zostały przesiane na podło!e płynne Nutrient Broth (Oxoid®, CM 0067) z dodatkiem suplementu Preston Campylobacter Selective Suplement (Oxoid®, SR 0117), z dodatkiem 5% odwłóknionej krwi ko$skiej (Oxoid®, SR 0048) i inkubowane 48h±3h w temperaturze 42°C w atmosferze mikroaerofilnej. Nast#pnie 48-godzinne hodowle C. jejuni zmieszano w równych proporcjach, co dało mieszanin# trzech szczepów.

Medicina Veterinaria 7(3) 2008

Rys. 1. Zale no!" czasu i temperatury mierzona w komorze roboczej aparatury wysokoci!nieniowej podczas do!wiadczenia Fig. 1. Pressure and temperature time dependence measured in high pressure vessel during pressurisation of pork samples

18 A. Jackowska-Tracz, M. Tracz

Acta Sci. Pol.

Wysokie ci nienia hydrostatyczne…

19

Mi#so wieprzowe zostało zakupione w komercyjnych punktach handlowych. Dziesi#ciogramowe porcje zmielonego mi#sa zapakowano w torebki z foli PA/PE i poddano dekontaminacji za pomoc% promieniowania jonizuj%cego o mocy 2 kGy w celu inaktywacji Campylobacter jejuni powszechnie wyst#puj%cego w mi#sie. Nast#pnie do próbek mi#sa dodawano 0,2 ml mieszaniny z hodowli Campylobacter jejuni. Po pró!niowym zamkni#ciu próbek i transporcie w warunkach chłodniczych – próbki poddawano działaniu wysokiego ci nienia, stosuj%c nast#puj%ce parametry obróbki: 200 MPa przez 5, 10 i 15 min, 300 MPa przez 5, 10 i 15 min oraz 400 MPa przez 5,10 i 15 min. Kontrol# stanowiły próbki mi#sa wieprzowego zaka!one C. jejuni ale nie poddane obróbce wysokoci nieniowej. Pasteryzacja wysokoci nieniowa została przeprowadzona przy współpracy z Polskim Centrum Bada$ Wysokoci nieniowych PAN w Warszawie. Obj#to " komory roboczej aparatury wysokoci nieniowej wynosiła 1,5 l, medium stanowiła mieszanina wody destylowanej i glikolu propylenowego w proporcjach 1:1. Czas potrzebny do wygenerowania ci nienia niezb#dnego do do wiadczenia wynosił ok. 15–20 s. Czas potrzebny do powrotu ci nienia do pocz%tkowej warto ci był dwukrotnie dłu!szy. Wahania temperatury w komorze roboczej podczas pasteryzacji wysokoci nieniowej wynosiły ok. 3°C (rys. 1). W celu okre lenia liczby przetrwałych komórek C. jejuni – z poszczególnych próbek przygotowano szeregi dziesi#ciokrotnych rozcie$cze$. Z ka!dego rozcie$czenia wysiewano po 0,5 ml na podło!e Karmali agar. Posiewy inkubowano w warunkach mikroaerofilnych w temp. 42°C przez 48±3 h. Do wiadczenie zostało powtórzone trzykrotnie, a posiewy prowadzone były w duplikacie.

WYNIKI Powstałe kolonie Campylobacter jejuni liczono, a ko$cowy wynik przedstawiono jako liczb# j.t.k. C. jejuni w przeliczeniu na 1 g mi#sa. Obliczenia statystyczne przeprowadzono na warto ciach zlogarytmowanych. Analiz# statystyczn% przeprowadzono za pomoc% programu SPSS® 14.0 dla Windows®, stosuj%c jednoczynnikow% ANOVA oraz test Tukey’a. Analiza wariancji wykazała, !e zarówno ci nienie, jak i czas obróbki maj% statystycznie istotny wpływ na stopie$ redukcji C. jejuni w mi#sie wieprzowym (p