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˜ OFICINA ESPANOLA DE PATENTES Y MARCAS

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k kInt. Cl. : C12N 15/86

11 N´ umero de publicaci´on:

2 191 663

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˜ ESPANA

A61K 39/275 C12N 5/00

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TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA

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kN´umero de solicitud europea: 93904494.7 kFecha de presentaci´on: 13.01.1993 kN´umero de publicaci´on de la solicitud: 0 677 114 kFecha de publicaci´on de la solicitud: 18.10.1995

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54 T´ıtulo: Virus recombinante de la viruela porcina.

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73 Titular/es: SYNTRO CORPORATION

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72 Inventor/es: Cochran, Mark D. y

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74 Agente: Elzaburu M´ arquez, Alberto

30 Prioridad: 13.01.1992 US 820154

John Hopkins Court San Diego, CA 92121, US

45 Fecha de la publicaci´ on de la menci´on BOPI:

16.09.2003

45 Fecha de la publicaci´ on del folleto de patente:

ES 2 191 663 T3

16.09.2003

Aviso:

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Junker, David E.

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En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicaci´on en el Bolet´ın europeo de patentes, de la menci´on de concesi´on de la patente europea, cualquier persona podr´a oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposici´on deber´a formularse por escrito y estar motivada; s´olo se considerar´a como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposici´ on (art. 99.1 del Convenio sobre concesi´on de Patentes Europeas). Venta de fasc´ ıculos: Oficina Espa˜ nola de Patentes y Marcas. C/Panam´ a, 1 – 28036 Madrid

ES 2 191 663 T3 DESCRIPCION Virus recombinante de la viruela porcina. 5

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Dentro de esta solicitud se hace referencia a varias publicaciones por medio de n´ umeros ar´ abigos entre par´entesis. Las citas completas de estas publicaciones se pueden encontrar al final de la memoria descriptiva inmediatamente antes de las reivindicaciones. El virus de la viruela porcina (SPV) pertenece a la familia Poxviridae. Los virus que pertenecen a este grupo son virus grandes con DNA bicatenario, que se desarrollan de forma caracter´ıstica en el citoplasma de la c´elula hospedante. El SPV es el u ´nico miembro del g´enero Suipoxvirus. Varias caracter´ısticas diferencian al SPV de otros poxvirus. El SPV presenta especificidad de especie (18) en comparaci´ on con otros poxvirus tales como el virus vaccinia que presenta un amplio campo de hospedantes. La infecci´ on por SPV de las l´ıneas celulares en cultivo de tejidos se diferencia tambi´en en gran medida de otros poxvirus (24). Se ha demostrado tambi´en que el SPV no presenta reactividad antig´enica cruzada con el virus vaccinia y no muestra ninguna homolog´ıa importante detectable a nivel del DNA con los grupos de virus orthopox, leporipox, avipox o entomopox (24). Por tanto, lo que se conoce y se describe en la t´ecnica anterior en relaci´on con otros poxvirus no se aplica a priori al virus de la viruela porcina. El SPV es s´olo moderadamente pat´ ogeno, y est´a caracterizado por una infecci´ on que remite espont´ aneamente, con lesiones detectadas u ´ nicamente en la piel y en los n´ odulos linf´ aticos regionales. Aunque la infecci´ on por SPV es bastante limitada, los cerdos que se han recuperado del SPV son refractarios a las infecciones con SPV, lo que indica el desarrollo de una inmunidad activa (18). La presente invenci´on se refiere al uso del SPV como un vector para la administraci´ on de ant´ıgenos vacunales y agentes terap´euticos a los cerdos. Las siguientes propiedades del SPV apoyan esta justificaci´on: el SPV es s´olo moderadamente pat´ ogeno en los cerdos, el SPV es espec´ıfico de una especie, y el SPV provoca una respuesta inmunitaria protectora. Por tanto, el SPV es un excelente candidato para un sistema de administraci´ on con un vector viral, que tiene poco riesgo intr´ınseco, que se debe sopesar frente al beneficio aportado por la vacuna y las propiedades terap´euticas del vector. La t´ecnica anterior a esta invenci´on se basa en primer lugar en la capacidad para clonar y analizar el DNA, pero en los pl´ asmidos bacterianos. Las t´ecnicas que est´an disponibles se detallan en su mayor parte en Maniatis et al., 1983 y Sambrook et al., 1989. Estas publicaciones describen los u ´ltimos adelantos de la t´ecnica en los m´etodos generales de DNA recombinante. Entre los poxvirus, cinco (virus vaccinia, virus de la viruela aviar, virus de la viruela del canario, virus de la viruela de las palomas y virus de la viruela de los mapaches) han sido obtenidos por ingenier´ıa gen´etica, antes de esta descripci´on, para contener secuencias de DNA ex´ ogeno. El virus vaccinia ha sido usado ampliamente como vector de genes ex´ogenos (25) y es el objeto de las patentes de Estados Unidos 4.603.112 y 4.722.848. Similarmente, el virus de la viruela aviar ha sido usado como vector de genes ex´ogenos (25) y es el objeto de varias solicitudes de patentes EPA 0 284 416, PCT WO 89/03429, y PCT WO 89/12684. El virus de la viruela de los mapaches (10) y el virus de la viruela del canario (31) han sido utilizados para expresar ant´ıgenos del virus de la rabia. Estos ejemplos de inserciones de genes ex´ogenos en los poxvirus no incluyen ning´ un ejemplo del g´enero Suipoxvirus. Por tanto, no describen m´etodos para obtener por ingenier´ıa gen´etica los virus de la viruela porcina, esto es, d´onde hacer las inserciones y c´omo conseguir la expresi´on de los virus de la viruela porcina. La idea de usar virus vivos como sistemas de administraci´on de ant´ıgenos tiene una historia muy larga que se remonta a las primeras vacunas de virus vivos. Los ant´ıgenos administrados no eran ex´ogenos sino que eran expresados naturalmente por el virus vivo de las vacunas. El uso de los virus para administrar ant´ıgenos ex´ogenos en el sentido moderno se hizo evidente con los estudios del virus vaccinia recombinante. El virus vaccinia era el vector y los diferentes ant´ıgenos procedentes de virus que causan otras enfermedades eran los ant´ıgenos ex´ogenos, y se cre´o la vacuna por ingenier´ıa gen´etica. Aunque el concepto se hizo evidente con estas descripciones, lo que no fue evidente fue la respuesta a una cuesti´ on m´as pr´ actica, de c´omo elegir el mejor candidato para virus vector. Para contestar a esta cuesti´ on, los detalles de la patogenicidad del virus, su sitio de replicaci´ on, el tipo de respuesta inmunitaria que provoca, el potencial que tiene para expresar los ant´ıgenos ex´ogenos, su idoneidad para la ingenier´ıa gen´etica, su probabilidad de ser autorizado por las autoridades sanitarias, etc., son todos los factores que influyen en la selecci´on. La t´ecnica anterior no describe estas cuestiones de utilidad. La t´ecnica anterior relacionada con el uso de los poxvirus para administrar agentes terap´euticos se refiere al uso de un virus vaccinia para administrar interleuquina-2 (12). En este caso, aunque la 2

ES 2 191 663 T3 interleuquina-2 ten´ıa un efecto atenuante sobre el vector vaccinia, el hospedante no demostr´ o ning´ un beneficio terap´eutico.

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El agente terap´eutico que es administrado por un vector viral de la presente invenci´ on debe ser una mol´ecula biol´ogica que es un producto secundario de la replicaci´ on del virus de la viruela porcina. Esto limita el agente terap´eutico en el primer an´ alisis a cualquiera entre DNA, RNA o prote´ına. Hay ejemplos de agentes terap´euticos de cada una de estas clases de compuestos en la forma de DNA antisentido, RNA antisentido (16), ribozimas (34) los tRNA depresores (2), RNA bicatenario inductor del interfer´ on y numerosos ejemplos de compuestos terap´euticos prote´ınicos, procedentes de hormonas, por ejemplo, la insulina para las linfoquinas, por ejemplo, los interferones e interleuquinas para los opioides naturales. El descubrimiento de estos agentes terap´euticos y la aclaraci´on de su estructura y funci´ on no demuestra claramente su capacidad de ser usados en un sistema de administraci´ on con un vector viral. La presente invenci´on proporciona un virus recombinante de la viruela porcina que comprende un genoma del virus de la viruela porcina que contiene una secuencia de DNA ex´ ogeno insertada dentro del subfragmento m´ as grande de HindIII a BgIII del fragmento HindIII M del DNA gen´ omico, y en el que la secuencia del DNA ex´ogeno se expresa en una c´elula hospedante infectada con el virus recombinante de la viruela porcina. La presente invenci´on proporciona un vector de homolog´ıa para producir un virus recombinante de la viruela porcina por medio de insertar un DNA ex´ ogeno en el DNA gen´omico del virus de la viruela porcina, que comprende a) una secuencia de DNA ex´ogeno bicatenario

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b) est´a flanqueado en un extremo del DNA ex´ ogeno por un DNA del virus de la viruela porcina bicatenario hom´ ologo con el DNA gen´omico localizado en un lado de un sitio del DNA gen´ omico, en el que dicho sitio est´a localizado en el subfragmento m´as grande de HindIII a BgIII del fragmento HindIII M del DNA gen´ omico del virus de la viruela porcina, c) est´a flanqueado en el otro extremo del DNA ex´ ogeno por un DNA del virus de la viruela porcina bicatenario hom´ ologo con el DNA gen´omico localizado en el otro lado del mismo sitio del DNA gen´ omico. Figura 1: Detalles de la cepa Kasza del SPV. Diagrama del DNA gen´omico del SPV que muestra la regi´on larga u ´ nica y la regi´ on terminal repetida (TR). Se indica un mapa de restricci´ on para la enzima HindIII (23). Los fragmentos se han marcado con letras en orden decreciente de tama˜ no. N´ otese que las repeticiones terminales tienen un tama˜ no mayor que 2,1 kb pero menor que 9,7 kb. Figura 2: Secuencia de DNA del vector de homolog´ıa 515-85.1. Se muestra la secuencia de dos regiones del vector de homolog´ıa 515-85.1. La primera regi´on (Figura 2A) (SEQ ID NO: 1) cubre una secuencia de 599 pares de bases que flanquea el sitio u ´nico AccI como se indica en la Figura 3. El comienzo (Met) y el final (Val) de un ORF de 115 amino´ acidos se indica por la traducci´ on de los amino´ acidos debajo de la secuencia de DNA. La segunda regi´on (Figura 2B) (SEQ ID NO: 3) cubre los 899 pares de bases hacia arriba del sitio u ´nico HindIII como se indica en la Figura 3. El comienzo (Asp) y el final (Ile) de un ORF de 220 amino´ acidos se indica por la traducci´ on de los amino´ acidos debajo de la secuencia de DNA. Figura 3: Homolog´ıa entre el ORF 515-85.1 y el ORF 01L del virus Vaccinia. La primera l´ınea muestra un mapa de restricci´on del fragmento HindIII M del SPV. El segundo mapa muestra un mapa de restricci´on de la inserci´ on del DNA en el pl´ asmido 515-85.1. En el mapa se indica la localizaci´on del ORF 515-85.1 (semejante al VV 01L). Las localizaciones de las secuencias del DNA mostradas en la Figura 2 se indican debajo del mapa por trazos gruesos. La tercera l´ınea muestra la homolog´ıa entre el ORF VV 01L (SEQ ID NO: 5) y el ORF 515-85.1 (SEQ ID NO: 6) en sus N-terminales respectivos. La cuarta l´ınea muestra la homolog´ıa entre el ORF VV 01L (SEQ ID NO: 7) y el ORF 515-85.1 (SEQ ID NO: 8) en sus C-terminales respectivos.

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Figura 4: Descripci´ on detallada de la inserci´ on de DNA en el vector de homolog´ıa 520-17.5. Diagrama que muestra la orientaci´on de los fragmentos de DNA ensamblados en el pl´ asmido 520-17.5. El origen de cada fragmento se indica en la tabla. Se muestran tambi´en las secuencias localizadas en cada una de ´ las uniones entre los fragmentos (SEQ ID NUMEROS: 9, 10, 13, y 16). Se describen para cada uni´ on los sitios de restricci´ on usados para generar cada fragmento as´ı como las secuencias sint´eticas de enlace que se usan para unir los fragmentos. Las secuencias sint´eticas de enlace est´an subrayadas con un trazo grueso. Se da tambi´en la localizaci´on de varias regiones que codifican los genes y elementos reguladores. 3

ES 2 191 663 T3 Se usan las dos convenciones siguientes: los n´ umeros entre par´entesis ( ) se refieren a amino´acidos, y los sitios de restricci´on entre corchetes [ ] indican los restos de los sitios que fueron destruidos durante la construcci´ on. Se usan las siguientes abreviaturas, virus de la viruela porcina (SPV), promotor 1 inicial (EP1), promotor 2 tard´ıo (LP2), gen Z oper´ on lactosa (LacZ), y Escherichia coli (E. coli). 5

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Figura 5: Descripci´ on detallada de la inserci´ on de DNA en el vector de homolog´ıa 538-46.16. Diagrama que muestra la orientaci´on de los fragmentos de DNA ensamblados en el pl´ asmido 538-46.16. El origen de cada fragmento se indica en la tabla. Se muestran tambi´en las secuencias localizadas en cada una de las ´ uniones entre los fragmentos (SEQ ID NUMEROS: 17, 18, 21, 26, y 28). Se describen para cada uni´ on los sitios de restricci´ on usados para generar cada fragmento as´ı como las secuencias sint´eticas de enlace que se usaron para unir los fragmentos. Las secuencias sint´eticas de enlace est´an subrayadas con un trazo grueso. Se da tambi´en la localizaci´on de varias regiones que codifican los genes y elementos reguladores. Se usan las dos convenciones siguientes: los n´ umeros entre par´entesis ( ) se refieren a amino´acidos, y los sitios de restricci´on entre corchetes [ ] indican los restos de los sitios que fueron destruidos durante la construcci´ on. Se usan las siguientes abreviaturas, virus de la viruela porcina (SPV), virus de la pseudorrabia (PRV), glucoprote´ına 50 (gp50), glucoprote´ına 63 (gp63), promotor 1 inicial (EP1), promotor 1 tard´ıo (LP1), promotor 2 tard´ıo (LP2), gen Z oper´ on lactosa (LacZ), y Escherichia coli (E. coli).

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Figura 6: Transferencia Western de los lisados procedentes de c´elulas infectadas con SPV recombinante con anti-suero frente al PRV. Pistas: (A) lisado de c´elulas Vero no infectadas, (B) lisado de c´elulas infectadas con S-PRV-000 (virus de la pseudorrabia cepa Cooper), (C) marcadores de peso molecular pre-te˜ nidos, (D) lisado de c´elulas EMSK no infectadas, (E) lisado de c´elulas infectadas con S-PRV-000, (F) lisado de c´elulas infectadas con S-PRV-003, (G) lisado de c´elulas infectadas con S-PRV-008. Se ´ DE LISADOS DE CELULAS ´ prepararon los lisados celulares como se describe en la PREPARACION INFECTADAS. Se cargaron en cada pista aproximadamente 1/5 de la muestra total del lisado.

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Figura 7: Secuencia del gen de hemaglutinina-neuroaminidasa (HN) del NDV (SEQ ID NO: 29). Se muestra la secuencia de 1907 pares de bases del clon de cDNA de NDV HN. El comienzo y la terminaci´on de la traducci´ on del gen HN se indica por la traducci´ on de los amino´ acidos debajo de la secuencia de DNA.

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Figura 8: Descripci´ on detallada de la inserci´ on de DNA en el vector de homolog´ıa 538-46.26. Diagrama que muestra la orientaci´on de los fragmentos de DNA ensamblados en el pl´ asmido 538-46.26. El origen de cada fragmento se indica en la tabla. Se muestran tambi´en las secuencias localizadas en cada una de las ´ uniones entre los fragmentos (SEQ ID NUMEROS: 31, 32, 34, 37, y 40). Se describen para cada uni´ on los sitios de restricci´ on usados para generar cada fragmento as´ı como las secuencias sint´eticas de enlace que se usaron para unir los fragmentos. Las secuencias sint´eticas de enlace est´an subrayadas con un trazo grueso. Se da tambi´en la localizaci´on de varias regiones que codifican los genes y elementos reguladores. Se usan las dos convenciones siguientes: los n´ umeros entre par´entesis ( ) se refieren a amino´acidos, y los sitios de restricci´on entre corchetes [ ] indican los restos de los sitios que fueron destruidos durante la construcci´ on. Se usan las siguientes abreviaturas, virus de la viruela porcina (SPV), virus de la enfermedad de Newcastle (NDV), hemaglutinina-neuraminidasa (HN), promotor 1 inicial (EP1), promotor 1 tard´ıo (LP1), promotor 2 tard´ıo (LP2), gen Z oper´ on lactosa (LacZ), y Escherichia coli (E. coli). La presente invenci´on proporciona un virus de la viruela porcina (SPV) recombinante capaz de replicarse en un animal en el que se introduce el virus recombinante de la viruela porcina, el cual comprende el DNA del virus de la viruela porcina y un DNA ex´ ogeno que codifica RNA que no aparece de forma natural en el animal en el que se introduce el virus recombinante de la viruela porcina, estando insertado el DNA ex´ogeno en el DNA del virus de la viruela porcina en un sitio de inserci´ on que no es esencial para la replicaci´on del virus de la viruela porcina y estando bajo el control de un promotor. M´ as espec´ıficamente, la invenci´on proporciona un virus recombinante de la viruela porcina que comprende un genoma de virus de la viruela porcina que contiene una secuencia de DNA ex´ ogeno insertada dentro del subfragmento m´ as grande de HindIII a BglII del fragmento HindIII M del DNA gen´ omico, y en el que la secuencia de DNA ex´ogeno se expresa en una c´elula hospedante infectada con el virus recombinante de la viruela porcina. Para los fines de esta invenci´ on, “un virus recombinante de la viruela porcina capaz de replicaci´ on” es un virus vivo de la viruela porcina que ha sido generado por los m´etodos recombinantes bien conocidos por los expertos en la t´ecnica, por ejemplo, los m´etodos descritos en el PROCEDIMIENTO DE RE´ HOMOLOGA ´ COMBINACION PARA GENERAR SPV RECOMBINANTE en el apartado Materiales y m´etodos y en el que no ha sido eliminado el material gen´etico esencial para la replicaci´on del virus 4

ES 2 191 663 T3 recombinante de la viruela porcina.

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Para los fines de esta invenci´ on, “un sitio de inserci´ on que no es esencial para la replicaci´on del virus de la viruela porcina” es una posici´ on del genoma en la que no es necesaria una secuencia de DNA para la replicaci´on viral, por ejemplo, las secuencias de uni´ on a prote´ınas complejas, las secuencias que codifican la transcriptasa inversa, o una glucoprote´ına esencial, las secuencias de DNA necesarias para el empaquetamiento, etc.

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Para los fines de esta invenci´ on, un “promotor” es una secuencia espec´ıfica de DNA sobre la mol´ecula de DNA a la cual se une la polimerasa del RNA ex´ogeno y en la cual se inicia la transcripci´ on del RNA ex´ogeno. La invenci´on proporciona adem´ as RNA ex´ogeno que codifica un polip´eptido. Preferiblemente, el polip´eptido es antig´enico en el animal.

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Preferiblemente, este polip´eptido antig´enico es un pol´ımero lineal de m´ as de 10 amino´acidos unidos por enlaces pept´ıdicos que estimula al animal a producir anticuerpos.

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La invenci´on proporciona un sitio de inserci´ on presente dentro del subfragmento m´ as grande de HindIII a BglII del fragmento HindIII M del DNA del virus de la viruela porcina. Preferiblemente, el sitio de inserci´on est´ a dentro de un marco de lectura abierta contenido en el subfragmento de HindIII a BglII. Preferiblemente, el sitio de inserci´on es el sitio de la endonucleasa de restricci´on AccI localizado en el subfragmento de HindIII a BglII. Para los fines de esta invenci´on, un “marco de lectura abierta” es un segmento de DNA que contiene codones que se puede transcribir al RNA que se puede traducir en una secuencia de amino´ acidos y que no contiene un cod´ on de terminaci´ on. La invenci´on proporciona adem´ as un virus recombinante de la viruela porcina que comprende un DNA ex´ ogeno que codifica RNA que codifica un polip´eptido antig´enico, que es o procede de la glucoprote´ına 50 del virus de la pseudorrabia (PRV), glucoprote´ına II del virus de la pseudorrabia (PRV), glucoprote´ına III del virus de la pseudorrabia (PRV), glucoprote´ına H del virus de la pseudorrabia (PRV), glucoprote´ına 195 de la gastroenteritis transmisible (TGE), prote´ına de la matriz de la gastroenteritis transmisible (TGE), glucoprote´ına 38 de rotavirus porcino, prote´ına de la c´ apsida de parvovirus porcino, ant´ıgeno protector de la Serpulina hyodysenteriae, glucoprote´ına 55 de la diarrea viral bovina (BVD), hemaglutinina-neuraminidasa del virus de la enfermedad de Newcastle (NDV), hemaglutinina de la gripe porcina o neuraminidasa de la gripe porcina. Preferiblemente, el polip´ eptido antig´enico es la glucoprote´ına 50 del virus de la pseudorrabia (PRV). Preferiblemente, la prote´ına antig´enica es la hemaglutinina-neuraminidasa del virus de la enfermedad de Newcastle (NDV).

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La invenci´on proporciona adem´ as un virus recombinante de la viruela porcina que comprende DNA ex´ogeno que codifica RNA que codifica un polip´eptido antig´enico, que es o procede de la Serpulina hyodysenteriae, virus de la enfermedad de la glosopeda, virus de la peste porcina, virus de la gripe porcina, virus de la fiebre porcina africana o Mycoplasma hyopneumoniae. 45

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La invenci´on proporciona tambi´en un virus recombinante de la viruela porcina en el que el DNA ex´ogeno codifica RNA que codifica un polip´eptido que es un marcador detectable. Preferiblemente, el marcador detectable es el polip´eptido β-galactosidasa de E. coli. Para los fines de esta invenci´ on, un “polip´eptido que es un marcador detectable” incluye las formas b´ımeras, tr´ımeras y tetr´ameras del polip´eptido. La β-galactosidasa de E. coli es un tetr´ amero compuesto de cuatro polip´eptidos o subunidades mon´ omeras. Preferiblemente, este virus recombinante de la viruela porcina se denomina S-SPV-003 (N◦ de acceso a ATCC, VR 2335). El virus de la viruela porcina S-SPV-003 ha sido depositado de acuerdo con el Tratado de Budapest sobre el Dep´ osito Internacional de Microorganismos para los fines del procedimiento de patentes ante el Patent Culture Depository of the American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 U.S.A. con el ATCC Accesion No. VR 2335. La invenci´on proporciona tambi´en un virus recombinante de la viruela porcina capaz de replicaci´ on que contiene un DNA ex´ogeno que codifica RNA que codifica el polip´eptido antig´enico glucoprote´ına 50 del virus de la pseudorrabia (PRV), y que comprende adem´ as un DNA ex´ogeno que codifica un polip´eptido que es un marcador detectable. Preferiblemente, este virus recombinante de la viruela porcina se denomina S-SPV-008 (N◦ de acceso a ATCC, VR 2339). El virus de la viruela porcina S-SPV-008 ha sido depositado de acuerdo con el Tratado de Budapest sobre el Dep´ osito Internacional de Microorganismos 5

ES 2 191 663 T3 para los fines del procedimiento de patentes ante el Patent Culture Depository of the American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 U.S.A. con el ATCC Accesion No. VR 2339. 5

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La invenci´on proporciona tambi´en un virus recombinante de la viruela porcina capaz de replicaci´ on que contiene un DNA ex´ogeno que codifica RNA que codifica el polip´eptido antig´enico hemaglutininaneuraminidasa del virus de la enfermedad de Newcastle (NDV), y que comprende adem´ as un DNA ex´ ogeno que codifica un polip´eptido que es un marcador detectable. Preferiblemente, este virus recombinante de la viruela porcina se denomina S-SPV-009 (N◦ de acceso a ATCC, VR 2344). El virus de la viruela porcina S-SPV-009 ha sido depositado de acuerdo con el Tratado de Budapest sobre el Dep´ osito Internacional de Microorganismos para los fines del procedimiento de patentes ante el Patent Culture Depository of the American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 U.S.A. con el ATCC Accesion No. VR 2344. La invenci´on proporciona tambi´en que el DNA ex´ogeno insertado est´e bajo el control de un promotor. Preferiblemente, el promotor es un promotor del virus de la viruela porcina. Preferiblemente, el promotor es un promotor pox-viral sint´etico. Para los fines de esta invenci´on, los promotores se generaron por m´etodos bien conocidos por los expertos en la t´ecnica, por ejemplo, como se indica en la ESTRATEGIA ´ DE PROMOTORES POX-VIRALES SINTETICOS ´ PARA LA CONSTRUCCION en el apartado Materiales y m´etodos. Para los fines de esta invenci´ on, un promotor pox-viral sint´etico incluye un promotor pox-viral tard´ıo sint´etico, un promotor pox-viral inicial sint´etico o un promotor pox-viral inicial/tard´ıo sint´etico. La invenci´on proporciona un vector de homolog´ıa para producir un virus recombinante de la viruela porcina por medio de insertar un DNA ex´ ogeno en el DNA gen´omico de un virus de la viruela porcina. El vector de homolog´ıa comprende una mol´ecula de DNA bicatenario que consta esencialmente de un DNA ex´ ogeno bicatenario que codifica RNA que no aparece de forma natural en el animal en el que se introduce el virus recombinante de la viruela porcina, que tiene en un extremo del DNA ex´ ogeno, un DNA del virus de la viruela porcina bicatenario hom´ ologo con el DNA gen´omico localizado en un lado de un sitio del DNA gen´ omico que no es esencial para la replicaci´on del virus de la viruela porcina, y en el otro extremo del DNA ex´ogeno, un DNA del virus de la viruela porcina bicatenario hom´ ologo con el DNA gen´ omico localizado en el otro lado del mismo sitio del DNA gen´ omico. M´ as espec´ıficamente, la invenci´on proporciona un vector de homolog´ıa para producir un virus recombinante de la viruela porcina por medio de insertar un DNA ex´ ogeno en el DNA gen´omico del virus de la viruela porcina, que comprende a) una secuencia de DNA ex´ogeno bicatenario

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b) est´a flanqueado en un extremo del DNA ex´ ogeno por un DNA del virus de la viruela porcina bicatenario hom´ ologo con el DNA gen´omico localizado en un lado de un sitio del DNA gen´ omico, en el que dicho sitio est´a localizado en el subfragmento m´as grande de HindIII a BgIII del fragmento HindIII M del DNA gen´ omico del virus de la viruela porcina,

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c) est´a flanqueado en el otro extremo del DNA ex´ ogeno por un DNA del virus de la viruela porcina bicatenario hom´ ologo con el DNA gen´omico localizado en el otro lado del mismo sitio del DNA gen´ omico.

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Preferiblemente, el DNA ex´ogeno codifica un polip´eptido. En una realizaci´ on, el polip´eptido es antig´enico en el animal. Preferiblemente, el polip´eptido antig´enico es o procede de la glucoprote´ına 50 del virus de la pseudorrabia (PRV), glucoprote´ına II del virus de la pseudorrabia (PRV), glucoprote´ına III del virus de la pseudorrabia (PRV), glucoprote´ına H del virus de la pseudorrabia (PRV), glucoprote´ına 195 de la gastroenteritis transmisible (TGE), prote´ına de la matriz de la gastroenteritis transmisible (TGE), glucoprote´ına 38 de rotavirus porcino, prote´ına de la c´apsida de parvovirus porcino, ant´ıgeno protector de la Serpulina hyodysenteriae, glucoprote´ına 55 de la diarrea viral bovina (BVD), hemaglutinina-neuraminidasa del virus de la enfermedad de Newcastle (NDV), hemaglutinina de la gripe porcina o neuraminidasa de la gripe porcina. Preferiblemente, el polip´eptido antig´enico es o procede de la Serpulina hyodysenteriae, virus de la enfermedad de la glosopeda, virus de la peste porcina, virus de la gripe porcina, virus de la fiebre porcina africana o Mycoplasma hyopneumoniae.

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ES 2 191 663 T3 En una realizaci´ on, el polip´eptido es un marcador detectable. Preferiblemente, el polip´eptido que es un marcador detectable es la β-galactosidasa de E. coli.

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El DNA del virus de la viruela porcina bicatenario es hom´ ologo con el DNA gen´omico presente dentro del subfragmento m´ as grande de HindIII a BgIII del fragmento HindIII M del virus de la viruela porcina. Preferiblemente, el DNA del virus de la viruela porcina bicatenario es hom´ ologo con el DNA gen´omico presente dentro del marco de lectura abierta contenido en este subfragmento de HindIII a BgIII. Preferiblemente, el DNA del virus de la viruela porcina bicatenario es hom´ ologo con el DNA gen´omico presente dentro del sitio de la endonucleasa de restricci´on AccI localizado en el subfragmento de HindIII a BglII.

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Para los fines de esta invenci´ on, un “vector de homolog´ıa” es un pl´ asmido construido para insertar el DNA ex´ ogeno en un sitio espec´ıfico del genoma de un virus de la viruela porcina.

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La invenci´on proporciona adem´ as un vector de homolog´ıa en el que el DNA ex´ogeno comprende tambi´en un promotor pox-viral sint´etico. La invenci´on proporciona tambi´en una vacuna que comprende una cantidad inmunizante efectiva de un virus recombinante de la viruela porcina de la presente invenci´ on y un veh´ıculo adecuado.

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Los veh´ıculos adecuados para el virus de la pseudorrabia son bien conocidos en la t´ecnica e incluyen prote´ınas, az´ ucares, etc. Un ejemplo de uno de tales veh´ıculos adecuados es un medio de cultivo fisiol´ ogicamente equilibrado que contiene uno o m´ as agentes estabilizantes tales como prote´ınas estabilizadas, hidrolizadas, lactosa, etc.

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Para los fines de esta invenci´ on, una “cantidad inmunizante efectiva” del virus recombinante de la viruela porcina de la presente invenci´on est´a dentro del intervalo de 103 a 109 PFU/dosis.

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La presente invenci´on describe un m´etodo para inmunizar a un animal, en el que el animal es un animal porcino, bovino, caprino u ovino. Para los fines de esta invenci´ on, dicho m´etodo incluye inmunizar al animal frente a los virus que causan la enfermedad o enfermedades de la pseudorrabia, gastroenteritis transmisible, rotavirus porcino, parvovirus porcino,Serpulina hyodysenteriae, diarrea viral bovina, enfermedad de Newcastle, gripe porcina, glosopeda, peste porcina, fiebre porcina africana o Mycoplasma hyopneumoniae. El m´etodo comprende administrar al animal una dosis inmunizante efectiva de la vacuna de la presente invenci´ on. Se puede administrar la vacuna por cualquiera de los m´etodos bien conocidos por los expertos en la t´ecnica, por ejemplo, por inyecci´on intramuscular, subcut´ anea, intraperitoneal o intravenosa. Alternativamente, se puede administrar la vacuna intranasalmente u oralmente. La presente invenci´on describe tambi´en un m´etodo para estudiar a un cerdo y determinar si el cerdo ha sido vacunado con la vacuna de la presente invenci´on, particularmente con la realizaci´ on que contiene el a infectado virus recombinante de la viruela porcina S-SPV-008 (N◦ de acceso a ATCC, VR 2339), o si est´ con un virus de la pseudorrabia de tipo natural que se presenta naturalmente. Este m´etodo comprende obtener del cerdo a ser analizado una muestra de un fluido corporal adecuado, detectar en la muestra la presencia de anticuerpos frente al virus de la pseudorrabia, indicando la ausencia de tales anticuerpos que el cerdo no ha sido ni vacunado ni infectado, y para el cerdo en el que est´an presentes los anticuerpos frente al virus de la pseudorrabia, detectar en la muestra la ausencia de anticuerpos frente a los ant´ıgenos del virus de la pseudorrabia que est´ an normalmente presentes en el fluido corporal de un cerdo infectado por el virus de la pseudorrabia que se presenta naturalmente pero que no est´ an presentes en un cerdo vacunado, lo que indica que el cerdo ha sido vacunado y no infectado.

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La presente invenci´on describe tambi´en una c´elula hospedante infectada con un virus recombinante de la viruela porcina capaz de replicaci´ on. En una realizaci´ on la c´elula hospedante es una c´elula de mam´ıfero. Preferiblemente, la c´elula de mam´ıfero es una c´elula Vero. Preferiblemente, la c´elula de mam´ıfero es una c´elula EMSK.

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Para los fines de esta invenci´ on, una “c´elula hospedante” es una c´elula utilizada para propagar un vector y su inserto. La infecci´ on de las c´elulas se llev´o a cabo por m´etodos bien conocidos por los expertos ´ ´ en la t´ecnica, por ejemplo, como se indica en el PROCEDIMIENTO DE INFECCION-TRANSFECCI ON en el apartado Materiales y m´etodos.

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Los m´etodos para construir, seleccionar y purificar los virus recombinantes de la viruela porcina, que incluyen S-SPV-003, S-SPV-008 y S-SPV-009, se detallan a continuaci´ on en Materiales y m´etodos.

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ES 2 191 663 T3 Materiales y m´etodos

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´ DE MUESTRAS DE RESERVA DEL VIRUS DE LA VIRUELA PORCINA. Se PREPARACION prepararon muestras de virus de la viruela porcina (SPV) infectando c´elulas embrionarias de ri˜ no´n de cerdo (EMSK) con una multiplicidad de infecci´ on de 0,01 PFU/c´elula en una mezcla 1:1 de medio de Dulbecco modificado por Iscove (IMDM) y medio RPMI 1640 que contiene glutamina 2 mM, 100 unidades/ml de penicilina, 100 unidades/ml de estreptomicina (estos componentes se obtuvieron de Sigma o de un proveedor equivalente, y de aqu´ı en adelante se denominan como medio EMSK negativo). Antes de la infecci´on, las monocapas de c´elulas se lavaron una vez con medio EMSK negativo para separar las trazas de suero fetal bovino. El SPV contenido en el in´ oculo inicial (0,5 ml por placa Petri de 10 cm; 10 ml por o entonces que se absorbiera sobre la monocapa de c´elulas durante dos horas, matraz T de 175 cm2 ) se dej´ siendo redistribuido cada media hora. Despu´es de este periodo, el in´oculo original se complet´ o hasta el volumen recomendado con la adici´on de medio EMSK completo (medio EMSK negativo m´ as 5 % de suero fetal bovino). Se incubaron las placas Petri a 37◦ C en 5 % de CO2 hasta que se complet´o el efecto citop´ atico. El medio y las c´elulas se recogieron y se congelaron en un tubo c´onico de 50 ml con tap´ on de o en al´ıcuotas en viales de rosca a -70◦C. Despu´es de descongelaci´on a 37◦ C, la reserva de virus se reparti´ 1,0 ml y se volvi´ o a congelar a -70◦C. Usualmente los t´ıtulos fueron aproximadamente 106 PFU/ml. ´ DEL DNA DE SPV. Para el aislamiento del DNA del virus de la viruela porcina, PREPARACION se infect´ o una monocapa confluente de c´elulas EMSK en un matraz T de 175 cm2 con una multiplicidad de infecci´on de 0,1 y se incub´ o durante 4-6 d´ıas hasta que las c´elulas presentaron el 100 % de efecto citop´ atico. Se recogieron entonces las c´elulas infectadas raspando las c´elulas al medio y centrifugando a 3000 rpm durante 5 minutos en una centr´ıfuga cl´ınica. Se decant´ o el medio, y el sedimento celular se resuspendi´ o suavemente en 1,0 ml de soluci´ on salina tamponada con fosfato (PBS: 1,5 g de Na2 HPO4 , o a dos suce0,2 g de KH2 PO4 , 0,8 g de NaCl y 0,2 g de KCl por litro de H2 O) (por T175) y se someti´ ´ ltima descongelaci´on, sivas operaciones de congelaci´on-descongelaci´on (-70◦C a 37 ◦ C). Despu´es de la u las c´elulas (sobre hielo) se sonicaron dos veces durante 30 segundos cada una con 45 segundos de tiempo de enfriamiento entre ellas. Se separaron entonces los deshechos celulares por centrifugaci´ on (centr´ıfuga super-r´apida Sorvall RC-5B) a 3000 rpm durante 5 minutos en un rotor HB4 a 4◦ C. Los viriones SPV, presentes en el sobrenadante, se sedimentaron entonces por centrifugaci´ on a 15.000 rpm durante 20 minuon tos a 4◦ C en un rotor SS34 (Sorvall) y se resuspendieron en Tris 10 mM (pH 7,5). Despu´es, esta fracci´ se coloc´o por capas sobre un gradiente de sacarosa al 36 % (p/v en Tris 10 mM pH 7,5) y se centrifug´o (ultracentr´ıfuga Beckman L8-70M) a 18.000 rpm durante 60 minutos en un rotor SW41 (Beckman) a o en 1,0 ml de Tris 10 mM pH 7,5 y se sonic´o sobre hielo 4◦C. El sedimento de viriones se resuspendi´ durante 30 segundos. Esta fracci´ on coloc´o por capas sobre un gradiente continuo de sacarosa de 20 % a 50 % y se centrifug´ o a 16.000 rpm durante 60 minutos en un rotor SW41 a 4◦C. Se recogi´o la banda de viriones SPV localizada aproximadamente a los tres cuartos del gradiente, se diluy´o con sacarosa al 20 % y se sediment´o por centrifugaci´ on a 18.000 rpm durante 60 minutos en un rotor SW41 a 4◦ C. El sedimento resultante se lav´o entonces una vez con Tris 10 mM pH 7,5 para separar las trazas de sacarosa y finalmente se resuspendi´ o en Tris 10 mM pH 7,5. Se extrajo entonces el DNA de PSV de los on de EDTA, SDS, y proteinasa K viriones purificados por lisis (4 horas a 60 ◦ C) inducida por la adici´ hasta concentraciones finales de 20 mM, 0,5 % y 0,5 mg/ml, respectivamente. Despu´es de la digesti´on, se realizaron tres extracciones con fenol:cloroformo (1:1) y se precipit´o la muestra por la adici´on de dos o entonces la muestra vol´ umenes de etanol absoluto e incubaci´ on a -20◦ C durante 30 minutos. Se centrifug´ en una minicentr´ıfuga Eppendorf durante 5 minutos a m´ axima velocidad. Se decant´o el sobrenadante, y el sedimento se sec´o por aire y se rehidrat´ o en Tris 0,01 mM pH 7,5, EDTA 1 mM a 4◦ C. ´ DE LOS LISADOS DE CELULAS ´ PREPARACION INFECTADAS. Para la preparaci´on de los lisados celulares, se us´o medio libre de suero. Una monocapa confluente de c´elulas (EMSK para SPV o con 100 µl de o VERO para PRV) en un frasco de 25 cm2 o en una placa Petri de 60 mm se infect´ muestra de virus. Una vez que se hubo completado el efecto citop´ atico, se recogieron el medio y las c´elulas y se sedimentaron las c´elulas a 3000 rpm durante 5 minutos en una centr´ıfuga cl´ınica. Se resuspendi´ o el sedimento celular en 250 µl de soluci´ on tamp´ on de disgregaci´on (dodecilsulfato de sodio al 2 %, β-mercapto-etanol al 2 %). Se sonicaron las muestras durante 30 segundos en hielo y se almacenaron a -20◦C. PROCEDIMIENTO DE TRANSFERENCIA WESTERN. Las muestras de los lisados y los est´andares de prote´ınas se ensayaron sobre un gel de poliacrilamida seg´ un el procedimiento de Laemnli (1970). Despu´es de la electroforesis en gel se transfirieron las prote´ınas y se trataron de acuerdo con Sambrook et al. (1982). El anticuerpo primario fue un suero porcino anti-PRV (cepa Shope; lote 370, PDV8201, NVSL, Ames, IA) diluido 1:100 con leche en polvo descremada al 5 % en Tris-cloruro de sodio, y aziduro de sodio (TSA: 6,61 g de Tris-HCl, 0,97 g de Tris-base, 9,0 g de NaCl y 2,0 g de aziduro de sodio por litro 8

ES 2 191 663 T3 de H2 O). El anticuerpo secundario fue un conjugado de fosfatasa alcalina de cabra anti-porcino diluido 1:1000 con TSA.

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´ TECNICAS DE BIOLOG´IA MOLECULAR. Las t´ecnicas para la manipulaci´on de las bacterias y el DNA, que incluyen procedimientos tales como la digesti´on con endonucleasas de restricci´on, electroforesis en gel, extracci´on del DNA desde los geles, ligaci´on, fosforilaci´on con quinasa, tratamiento con fosfatasa, crecimiento de cultivos bacterianos, transformaci´on de bacterias con DNA, y otros m´etodos de biolog´ıa molecular est´an descritos por Maniatis et al. (1982) y Sambrook et al. (1989). Excepto, cuando se indica, se usaron estos m´etodos con variaciones menores. ´ DEL DNA. Se realiz´ SECUENCIACION o la secuenciaci´on usando el kit USB Sequenase y 35 S-dATP (NEN). Se llevaron a cabo las reacciones usando tanto las mezclas dGTP como las mezclas dITP para clarificar las ´areas de compresi´on. Alternativamente, las a´reas comprimidas se resolvieron sobre geles de formamida. Los moldes fueron subclones de pl´ asmidos bicatenarios o subclones M13 monocatenarios, y los cebadores fueron preparados o bien en el vector justo fuera del inserto a ser secuenciado, o bien en la secuencia obtenida previamente. La secuencia obtenida se ensambl´o y se compar´o usando el programa inform´ atico Dnastar. Se realiz´ o la manipulaci´ on y comparaci´ on de las secuencias obtenidas con los programas SupercloneT M y SuperseeT M de Coral Software. ´ CON LA REACCION ´ EN CADENA DE LA POLIMERASA. Se us´ CLONACION o la reacci´on en cadena de la polimerasa (PCR) para introducir sitios de restricci´on convenientes para la manipulaci´on de diferentes DNA. Los procedimientos usados est´ an descritos por Innis, et al. (1990). En general, los fragmentos amplificados tuvieron un tama˜ no menor que 500 pares de bases y las regiones cr´ıticas de los fragmentos amplificados se confirmaron por la secuenciaci´ on del DNA. Los cebadores usados en cada caso se detallan en las descripciones de la construcci´on de los vectores de homolog´ıa m´ as adelante. ´ HOMOLOGA ´ PROCEDIMIENTO DE RECOMBINACION PARA GENERAR SPV RECOMBINANTE. Este m´etodo se basa en la recombinaci´on hom´ ologa entre el DNA del virus de la viruela porcina y el DNA del pl´ asmido vector de homolog´ıa que tiene lugar en las c´elulas del cultivo de tejidos que contiene tanto el DNA del virus de la viruela porcina como el pl´ asmido vector de homolog´ıa transfectado. Para que tenga lugar la recombinaci´ on hom´ ologa, las monocapas de c´elulas EMSK se infectan con S-SPV-001 (cepa SPV Kasza, 17) con una multiplicidad de infecci´ on de 0,01 PFU/c´elula para introducir el SPV replicante (esto es, la s´ıntesis de DNA) en las c´elulas. El DNA del pl´asmido vector de homolog´ıa se transfecta ´ ´ entonces a estas c´elulas de acuerdo con el PROCEDIMIENTO DE INFECCION-TRANSFECCI ON. La construcci´ on de los vectores de homolog´ıa usados en este procedimiento se describe m´as adelante. ´ ´ PROCEDIMIENTO DE INFECCION-TRANSFECCI ON. Placas Petri de 6 cm de c´elulas EMSK (confluentes en aproximadamente 80 %) se infectaron con S-SPV-001 con una multiplicidad de infecci´ on de 0,01 PFU/c´elula en medio EMSK negativo y se incubaron a 37◦ C en un ambiente humidificado con on usado es esencialmente el recomendado 5 % de CO2 durante 5 horas. El procedimiento de transfecci´ para el reactivo LipofectinT M (BRL). En resumen, para cada placa Petri de 6 cm, se diluyeron 15 µg de DNA plasm´ıdico hasta 100 µl con H2 O. Por separado, se diluyeron 50 microgramos de reactivo Lipofectin nadieron entonces gota a gota los 100 µl del reactivo Lipofectin diluido al hasta 100 µl con H2 O. Se a˜ DNA plasm´ıdico diluido contenido en un tubo de poliestireno de 5 ml con tap´ on de resorte y se mezclaron suavemente. Se incub´o entonces la mezcla durante 15-20 minutos a temperatura ambiente. Durante este tiempo, se separ´ o el in´oculo del virus de las placas Petri de 6 cm y las monocapas celulares se lavaron una vez con medio EMSK negativo. Se a˜ nadieron entonces 3 ml del medio EMSK negativo a la mezcla de DNA plasm´ıdico/lipofectin y se pipetearon los contenidos sobre la monocapa celular. Se incubaron las c´elulas durante toda la noche (aproximadamente 16 horas) a 37◦ C en un ambiente humidificado con 5 % de CO2 . Al d´ıa siguiente, se separaron los 3 ml de medio EMSK negativo y se reemplazaron con 5 ml de medio EMSK completo. Se incubaron las c´elulas a 37◦ C en 5 % de CO2 durante 3-7 d´ıas hasta que el efecto citop´atico del virus fue de 80-100 %. Se recogi´ o el virus como se ha descrito antes para la preparaci´ on de las reservas de virus. Esta reserva se denomin´ o como reserva de transfecci´on y a continuaci´on fue cribada para seleccionar el virus recombinante por medio del CRIBADO CON BLUOGAL DEL VIRUS RECOMBINANTE DE LA VIRUELA PORCINA O CRIBADO CON CPRG DEL VIRUS RECOMBINANTE DE LA VIRUELA PORCINA. CRIBADO DEL SPV RECOMBINANTE QUE EXPRESA β-GALACTOSIDASA (ENSAYOS CON BLUOGAL Y CPRG). Cuando se incorpor´ o el gen marcador de β-galactosidasa (lacZ) de E. coli a un virus recombinante se visualizaron las placas virales que contienen los recombinantes por uno de dos m´etodos sencillos. En el primer m´etodo, se incorpor´ o el compuesto qu´ımico BluogalT M (Bethesda Research Labs) (200 µg/ml) a la capa superior de agarosa durante el ensayo de las placas virales, y las 9

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placas virales que expresaban la β-galactosidasa activa se volvieron azules. Se a˜ nadieron entonces las placas virales azules sobre c´elulas frescas (EMSK) y se purificaron por aislamiento posterior de las placas virales azules. En el segundo m´etodo, se incorpor´ o CPRG (Boehringer Mannheim) (400 µg/ml) sobre la capa superior de agarosa durante el ensayo de las placas virales, y las placas virales que expresaban la β-galactosidasa activa se volvieron rojas. Se a˜ nadieron entonces las placas virales rojas sobre c´elulas frescas (EMSK) y se purificaron por aislamiento posterior de las placas virales rojas. En ambos casos se purificaron t´ıpicamente los virus con tres rondas de purificaci´ on de las placas virales. ´ DEL GEN EXOGENO ´ CRIBADO PARA LA EXPRESION EN SPV RECOMBINANTE USANDO LOS ENSAYOS DE LAS PLACAS VIRALES NEGRAS. Para analizar la expresi´ on de los ant´ıgenos ex´ogenos expresados por los virus recombinantes de la viruela porcina, se infectaron las monocapas de c´elulas EMSK con SPV recombinante, se cubrieron con una capa de medio nutriente de agarosa y se o incubaron durante 6-7 d´ıas a 37◦ C para que tuviera lugar el desarrollo de las placas virales. Se separ´ entonces de la placa Petri la capa cubriente de agarosa, se fijaron las c´elulas con metanol al 100 % durante 10 minutos a temperatura ambiente y se secaron al aire las c´elulas. La fijaci´on de las c´elulas da como resultado la detecci´on del ant´ıgeno citopl´ asmico as´ı como del ant´ıgeno de superficie mientras que la expresi´on del ant´ıgeno de superficie espec´ıfico se puede detectar usando c´elulas no fijadas. El anticuerpo primario se diluy´ o entonces hasta la diluci´ on apropiada con PBS y se incub´ o sobre la monocapa celular durante 2 horas a temperatura ambiente. Para detectar la expresi´ on de PRV gp50 a partir de S-SPV-008, se us´ o suero porcino anti-PRV (cepa Shope; lote 370, PDV8201, NVSL, Ames, IA) (diluido 1:100). Para detectar la expresi´ on de NDV HN a partir de S-SPV-009, se us´ o un antisuero de conejo espec´ıfico para la prote´ına HN (anti-NDV#2 de conejo) (diluido 1:1000). Se separ´ o entonces el anticuerpo no ligado lavando las c´elulas tres veces con PBS a temperatura ambiente. El anticuerpo secundario, ya sea uno anti-porcino de cabra (PRVgp50; S-SPV-008) o uno anti-conejo de cabra (NDV HN; S-SPV-009), y conjugado de peroxidasa de r´ abano se diluy´ o 1:250 con PBS y se incub´ o con las c´elulas durante 2 horas a temperatura ambiente. Se separ´ o entonces el anticuerpo secundario no ligado lavando las c´elulas tres veces con PBS a temperatura ambiente. Se incubaron entonces las c´elulas durante 15-30 minutos a temperatura ambiente con soluci´ on de sustrato recientemente preparada (100 µg/ml de 4-cloro-1-naftol, nen de negro. H2 O2 al 0,003 % en PBS). Las placas virales que expresan el ant´ıgeno correcto se ti˜ ´ DE PROMOTORES POX-VIRALES SINTETICOS. ´ ESTRATEGIA PARA LA CONSTRUCCION Para vectores del virus recombinante de la viruela porcina, los promotores pox-virales sint´eticos ofrecen varias ventajas que incluyen la capacidad de controlar la potencia y duraci´ on de la expresi´ on del gen ex´ogeno. Se ha elegido en esta invenci´on dise˜ nar tres casetes de promotores LP1, EP1 y LP2 basadas en promotores que han sido definidos en el virus vaccinia (1, 7 y 8). Cada casete fue dise˜ nada para contener las secuencias de DNA definidas en el virus vaccinia flanqueadas por los sitios de restricci´on que se pueden usar para combinar las casetes en cualquier orden o combinaci´ on. Se dise˜ naron tambi´en metioninas iniciadoras dentro de cada casete de tal modo que las fusiones dentro del marco se puedan realizar en cualquiera de los sitios EcoRI o BamHI. Se construyeron tambi´en por ingenier´ıa gen´etica, hacia abajo del sitio de fusi´ on dentro del marco, un conjunto de codones terminales de traducci´ on en los tres marcos de lectura y una se˜ nal inicial de terminaci´ on de la transcripci´ on (9). El DNA que codifica cada casete se sintetiz´o de acuerdo con t´ecnicas est´andar y se clon´ o en los apropiados vectores de homolog´ıa (v´eanse las figuras 4, 5 y 8). VECTOR DE HOMOLOG´IA 515-85.1. Se construy´o el pl´asmido 515-85.1 con el prop´ osito de insertar DNA ex´ ogeno en el SPV. Dicho pl´ asmido contiene un u ´nico sitio de la enzima de restricci´ on AccI en el que se puede insertar el DNA ex´ ogeno. Cuando se usa un pl´ asmido que contiene un inserto de DNA ex´ogeno ´ HOMOLOGA ´ en el sitio AccI, seg´ un el PROCEDIMIENTO DE RECOMBINACION PARA GENERAR SPV RECOMBINANTE resultar´ a un virus que contiene el DNA ex´ ogeno. En la figura 4 se da un mapa ´ de restricci´ on del inserto de DNA en el vector de homolog´ıa 515-85.1. Este se puede construir utilizando t´ecnicas est´andar (22 y 29) de DNA recombinante, uniendo dos fragmentos de restricci´ on procedentes de las siguientes fuentes. El primer fragmento es un fragmento de restricci´ on de aproximadamente 2972 pares de bases de HindIII a BamHI de pSP64 (Promega). El segundo fragmento es un subfragmento de restricci´on de aproximadamente 3300 pares de bases de HindIII a BglII del fragmento M de restricci´ on de SPV HindIII (23). VECTOR DE HOMOLOG´IA 520-17.5. Se construy´o el pl´asmido 520-17.5 con el prop´ osito de insertar DNA ex´ogeno en el SPV. Dicho pl´ asmido incorpora un gen marcador de β-galactosidasa (lacZ) de E. coli flanqueado por DNA de SPV. Hacia arriba del gen marcador hay un fragmento de DNA de SPV de aproximadamente 2015 pares de bases. Hacia abajo del gen marcador hay un fragmento de DNA de SPV de aproximadamente 1103 pares de bases. Cuando se usa este pl´ asmido seg´ un el PROCEDIMIENTO

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´ HOMOLOGA ´ DE RECOMBINACION PARA GENERAR SPV RECOMBINANTE resultar´a un virus que contiene el DNA que codifica el gen marcador. N´ otese que el gen marcador de β-galactosidasa (lacZ) est´a bajo el control de un promotor pox-viral inicial/tard´ıo sint´etico. En la figura 4 se da una descripci´ on ´ detallada del pl´ asmido. Este se puede construir utilizando t´ecnicas est´andar (22 y 30) de DNA recombinante, uniendo fragmentos de restricci´ on, procedentes de las siguientes fuentes, con las secuencias de DNA sint´etico indicadas en la figura 4. El pl´ asmido vector se deriva de un fragmento de restricci´ on de aproximadamente 2972 pares de bases de HindIII a BamHI de pSP64 (Promega). El fragmento 1 es un subfragmento de restricci´ on de aproximadamente 2015 pares de bases de HindIII a AccI del fragmento M de restricci´ on de SPV HindIII (23). El fragmento 2 es un fragmento de restricci´ on de aproximadamente 3010 pares de bases de BamHI a PvuII del pl´ asmido pJF751 (11). El fragmento 3 es un subfragmento de restricci´ on de aproximadamente 1103 pares de bases de AccI a BglII del fragmento M de SPV HindIII (23). VECTOR DE HOMOLOG´IA 538-46.16. Se construy´o el pl´ asmido 538-46.16 con el prop´ osito de insertar DNA ex´ ogeno en el SPV. Dicho pl´ asmido incorpora un gen marcador de β-galactosidasa (lacZ) de E. coli y el gen PRV gp50 flanqueado por DNA de SPV. Hacia arriba de los genes ex´ogenos hay un fragmento de DNA de SPV de aproximadamente 2015 pares de bases. Hacia abajo de los genes ex´ogenos hay un fragmento de DNA de SPV de aproximadamente 1103 pares de bases. Cuando se usa este pl´ asmido ´ HOMOLOGA ´ seg´ un el PROCEDIMIENTO DE RECOMBINACION PARA GENERAR SPV RECOMBINANTE resultar´a un virus que contiene el DNA que codifica los genes ex´ogenos. N´ otese que el gen marcador de β-galactosidasa (lacZ) est´a bajo el control de un promotor pox-viral tard´ıo sint´etico y que el gen gp50 est´a bajo el control de un promotor pox-viral inicial/tard´ıo sint´etico. En la figura 5 se da ´ una descripci´ on detallada del pl´ asmido. Este se puede construir utilizando t´ecnicas est´andar (22 y 30) de DNA recombinante, uniendo fragmentos de restricci´ on, procedentes de las siguientes fuentes, con las secuencias de DNA sint´etico indicadas en la figura 5. El pl´ asmido vector se deriva de un fragmento de restricci´ on de aproximadamente 2972 pares de bases de HindIII a BamHI de pSP64 (Promega). El fragmento 1 es un subfragmento de restricci´ on de aproximadamente 2015 pares de bases de HindIII a AccI del fragmento M de restricci´on de SPV HindIII (23). El fragmento 2 es un fragmento de restricci´ on de aproximadamente 3010 pares de bases de BamHI a PvuII del pl´ asmido pJF751 (11). El fragmento 3 es un subfragmento de restricci´ on de aproximadamente 1571 pares de bases de EcoRI a StuI del fragmento 7 de PRV BamHI (21). N´ otese que el sitio EcoRI se introdujo en este fragmento por clonaci´ on por PCR. En este procedimiento se usaron los cebadores descritos a continuaci´ on junto con un molde constituido por un fragmento PRV BamHI # 7 subclonado en pSP64. El primer cebador 87.03 (5’CGCGAATTCGCTCGCAGCGCTATTGGC-3’) (SEQ ID NO: 41) est´ a sobre la secuencia de PRV gp50 (26) en el amino´ acido 3 aproximadamente cebando hacia el extremo 3’ del gen. El segundo cebador 87.06 (5’-GTAGGAGTGGCTGCTGAAG-3’) (SEQ ID NO: 42) est´ a sobre la hebra opuesta en el amino´ acido 174 aproximadamente cebando hacia el extremo 5’ del gen. El producto de la PCR se puede digerir con EcoRI y SalI para producir un fragmento de aproximadamente 509 pares de bases. El subfragmento de SalI a StuI de aproximadamente 1049 pares de bases de PRV BamHI # 7 se puede ligar entonces al fragmento de EcoRI a SalI de aproximadamente 509 pares de bases para generar el fragmento 3 de EcoRI a StuI de aproximadamente 1558 pares de bases. El fragmento 4 es un subfragmento de restricci´ on de AccI a BglII de aproximadamente 1103 pares de bases del fragmento M de SPV HindIII (23). VECTOR DE HOMOLOG´IA 538-46.26. Se construy´o el pl´ asmido 538-46.26 con el prop´ osito de insertar DNA ex´ ogeno en el SPV. Dicho pl´ asmido incorpora un gen marcador de β-galactosidasa (lacZ) de E. coli y el gen de la hemaglutinina-neuraminidasa (HN) del virus de la enfermedad de Newcastle (NDV) flanqueado por DNA de SPV. Hacia arriba de los genes ex´ ogenos hay un fragmento de DNA de SPV de aproximadamente 2015 pares de bases. Hacia abajo de los genes ex´ ogenos hay un fragmento de DNA de SPV de aproximadamente 1103 pares de bases. Cuando se usa este pl´ asmido seg´ un el PROCEDIMIENTO ´ HOMOLOGA ´ DE RECOMBINACION PARA GENERAR SPV RECOMBINANTE resultar´a un virus que contiene el DNA que codifica los genes ex´ogenos. N´ otese que el gen marcador de β-galactosidasa (lacZ) est´a bajo el control de un promotor pox-viral tard´ıo sint´etico y el gen HN est´a bajo el control de un promotor pox-viral inicial/tard´ıo sint´etico. En la figura 8 se da una descripci´on detallada del pl´asmido. ´ Este se puede construir utilizando t´ecnicas est´andar (22 y 30) de DNA recombinante, uniendo fragmentos de restricci´ on, procedentes de las siguientes fuentes, con las secuencias de DNA sint´etico indicadas en la figura 8. El pl´ asmido vector se deriva de un fragmento de restricci´ on de aproximadamente 2972 pares de bases de HindIII a BamHI de pSP64 (Promega). El fragmento 1 es un subfragmento de restricci´ on de aproximadamente 2015 pares de bases de HindIII a AccI del fragmento M de restricci´on de SPV HindIII (23). El fragmento 2 es un fragmento de restricci´ on de aproximadamente 1810 pares de bases de AvaII a NaeI de un clon de cDNA de NDV HN. La secuencia del clon de cDNA de HN se da en la figura 7. El clon de cDNA se gener´o a partir de la cepa B1 de NDV usando t´ecnicas est´andar de clonaci´ on de cDNA 11

ES 2 191 663 T3 (14). El fragmento 3 es un fragmento de restricci´ on de aproximadamente 3010 pares de bases de BamHI a PvuII del pl´ asmido pJF751 (11). El fragmento 4 es un subfragmento de restricci´ on de AccI a BglII de aproximadamente 1103 pares de bases del fragmento M de SPV HindIII (23). 5

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VECTOR DE HOMOLOG´IA 520-90.15. Se construy´o el pl´ asmido 520-90.15 con el prop´ osito de insertar DNA ex´ ogeno en el SPV. Dicho pl´ asmido contiene un u ´nico sitio de la enzima de restricci´on NdeI en el que se puede insertar el DNA ex´ogeno. Cuando se usa un pl´ asmido que contiene un inserto de DNA ´ HOMOLOGA ´ ex´ogeno en el sitio NdeI, seg´ un el PROCEDIMIENTO DE RECOMBINACION PARA GENERAR SPV RECOMBINANTE resultar´ a un virus que contiene el DNA ex´ ogeno. El pl´ asmido 52090.15 se construy´o utilizando t´ecnicas est´andar (22 y 30) de DNA recombinante, uniendo dos fragmentos de restricci´ on procedentes de las siguientes fuentes. El primer fragmento es un fragmento de restricci´on de aproximadamente 2972 pares de bases de HindIII a BamHI de pSP64 (Promega). El segundo fragmento es un subfragmento de restricci´ on de aproximadamente 1700 pares de bases de HindIII a BamHI del fragmento G de restricci´on de SPV HindIII (23).

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Ejemplos Ejemplo 1 20

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Vector de homolog´ıa 515-85.1 El vector de homolog´ıa 515-85.1 es un pl´ asmido u ´ til para la inserci´ on de DNA ex´ogeno en el SPV. El pl´ asmido 515-85.1 contiene un u ´ nico sitio de restricci´ on AccI en el que puede ser clonado el DNA ex´ ogeno. Se puede usar un pl´ asmido que contiene dicho inserto de DNA ex´ ogeno seg´ un el PROCEDIMIENTO DE ´ HOMOLOGA ´ RECOMBINACION PARA GENERAR SPV RECOMBINANTE para generar un SPV que contiene el DNA ex´ogeno. Para que este procedimiento sea satisfactorio es importante que el sitio de inserci´on (AccI) est´e en una regi´ on no esencial para la replicaci´ on del SPV y que el sitio est´e flanqueado con DNA del virus de la viruela porcina apropiado para mediar en la recombinaci´ on hom´ ologa entre el virus y los DNA plasm´ıdicos. Se ha demostrado en esta invenci´ on que el sitio AccI del vector de homolog´ıa 515-85.1 se puede usar para insertar DNA ex´ ogeno en al menos tres SPV recombinantes (v´eanse los ejemplos 2-4). Para definir un sitio de inserci´ on apropiado, se gener´ o una genoteca de fragmentos de restricci´ on SPVHindIII. Varios de estos fragmentos de restricci´ on (fragmentos HindIII G, J, y M, v´ease la figura 1) se sometieron a an´alisis de cartograf´ıa de restricci´ on. Se identificaron dos sitios de restricci´ on en cada fragmento como potenciales sitios de inserci´on. Estos sitios inclu´ıan HpaI y NruI en el fragmento G, BalI y XbaI en el fragmento J, y AccI y PstI en el fragmento M. Se insert´ o un gen marcador de β-galactosidasa (lacZ) en cada uno de los sitios potenciales. Los pl´asmidos resultantes se utilizaron ´ HOMOLOGA ´ en el PROCEDIMIENTO DE RECOMBINACION PARA GENERAR SPV RECOMBINANTE. La generaci´on del virus recombinante se determin´ o por los ENSAYOS DE CRIBADO DEL SPV RECOMBINANTE QUE EXPRESA β-GALACTOSIDASA. Se encontr´ o que cuatro de los seis sitios generan virus recombinante, sin embargo la capacidad de cada uno de estos virus para ser purificado separado del SPV parental vari´ o grandemente. En un caso el virus no pudo ser purificado por encima del nivel del 1 %, en otro caso el virus no pudo ser purificado por encima del nivel del 50 %, y en un tercer caso el virus no pudo ser purificado por encima del nivel del 90 %. La incapacidad para purificar estos virus indica inestabilidad en el sitio de inserci´on. Esto hace que los correspondientes sitios sean inapropiados para la inserci´ on del DNA ex´ ogeno. Sin embargo, la inserci´ on en un sitio, el sitio AccI del vector de homolog´ıa 515-85.1, dio como resultado un virus que se purific´ o f´ acilmente hasta el 100 % (v´ease el ejemplo 2), definiendo claramente un sitio apropiado para la inserci´ on de DNA ex´ogeno. El vector de homolog´ıa 515-85.1 se caracteriz´o adem´ as por el an´ alisis de la secuencia de DNA. Se secuenciaron dos regiones del vector de homolog´ıa. La primera regi´ on cubre una secuencia de 599 pares de bases que flanquea el sitio u ´ nico AccI (v´ease la figura 2). La segunda regi´on cubre los 899 pares de bases hacia arriba del sitio u ´nico HindIII (v´ease la figura 2). La secuencia de la primera regi´ on codifica un marco de lectura abierta (ORF) que muestra homolog´ıa con los amino´acidos 1 a 115 del marco de lectura abierta 01L del virus vaccinia (VV) identificado por Goebel et al., 1990 (v´ease la figura 3). La secuencia de la segunda regi´ on codifica un marco de lectura abierta que muestra homolog´ıa con los amino´acidos 568 a 666 del mismo marco de lectura abierta 01L del virus vaccinia (v´ease la figura 3). Estos datos dan a entender que el sitio AccI interrumpe el presunto ORF similar al 01L de VV en el amino´ acido 41 aproximadamente, lo que sugiere que este ORF codifica un gen que no es esencial para la replicaci´on del SPV. Goebel et al. sugieren que el ORF 01L de VV contiene un motivo cremallera de leucina caracter´ıstico

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ES 2 191 663 T3 de ciertas prote´ınas eucari´ oticas reguladoras de la transcripci´ on, sin embargo, indican que no se conoce si este gen es esencial para la replicaci´on del virus.

5

Se podr´ıa esperar que la secuencia del DNA localizada hacia arriba del ORF similar al 01L de VV (v´ease la figura 2A) contenga un promotor del virus de la viruela porcina. Este promotor del virus de la viruela porcina ser´ au ´ til como el elemento control del DNA ex´ ogeno introducido en el genoma del virus de la viruela porcina. Ejemplo 2

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S-SPV-003

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El S-SPV-003 es un virus de la viruela porcina que expresa un gen ex´ ogeno. El gen de la β-galactosidasa (gen lacZ) de E. coli se insert´ o en el ORF 515-85.1 de SPV. El gen ex´ ogeno (lacZ) est´a bajo el control de un promotor inicial/tard´ıo sint´etico (EP1LP2). El S-SPV-003 se deriv´o del S-SPV-001 (cepa Kasza). Esto se consigui´o utilizando el vector de homolog´ıa 520-17.5 (v´ease Materiales y m´etodos) y el virus S-SPV-001 en el PROCEDIMIENTO DE RE´ HOMOLOGA ´ COMBINACION PARA GENERAR SPV RECOMBINANTE. La reserva de transfecci´on se crib´o por el CRIBADO DEL SPV RECOMBINANTE QUE EXPRESA β-GALACTOSIDASA (ENSAYOS CON BLUOGAL Y CPRG). El resultado final de la purificaci´ on de las placas virales rojas fue el virus recombinante denominado S-SPV-003. Este virus se ensay´ o en cuanto a la expresi´ on de βgalactosidasa, pureza, y estabilidad del inserto por medio de m´ ultiples pases monitorizados por el ensayo de las placas virales azules como se describe en Materiales y m´etodos. Despu´es de las tres rondas de purificaci´ on iniciales, todas las placas virales observadas eran azules, lo que indica que el virus era puro, estable y que expresaba el gen ex´ogeno. Los ensayos descritos aqu´ı se llevaron a cabo en c´elulas VERO as´ı como en c´elulas EMSK, indicando que las c´elulas VERO eran un sustrato adecuado para la producci´ on de vacunas de SPV recombinante. El S-SPV-003 ha sido depositado ante la ATCC con el N◦ de acceso VR 2335.

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Ejemplo 3 S-SPV-008 35

El S-SPV-008 es un virus de la viruela porcina que expresa al menos dos genes ex´ogenos. Se insertaron en el ORF 515-85.1 de SPV, el gen de la β-galactosidasa (gen lacZ) de E. coli y el gen gp50 del virus de la pseudorrabia (PRV) (26). El gen lacZ est´ a bajo el control de un promotor tard´ıo sint´etico (LP1) y el gen gp50 est´ a bajo el control de un promotor inicial/tard´ıo sint´etico (EP1LP2).

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El S-SPV-008 se deriv´o del S-SPV-001 (cepa Kasza). Esto se consigui´o utilizando el vector de homolog´ıa 538-46.16 (v´ease Materiales y m´etodos) y el virus S-SPV-001 en el PROCEDIMIENTO DE ´ HOMOLOGA ´ RECOMBINACION PARA GENERAR SPV RECOMBINANTE. La reserva de transfecci´on se crib´ o por el CRIBADO DEL SPV RECOMBINANTE QUE EXPRESA β-GALACTOSIDASA (ENSAYOS CON BLUOGAL Y CPRG). El resultado final de la purificaci´ on de las placas virales rojas fue el virus recombinante denominado S-SPV-008. Este virus se ensay´ o en cuanto a la expresi´on de βgalactosidasa, pureza, y estabilidad del inserto por medio de m´ ultiples pases monitorizados por el ensayo de las placas virales azules como se describe en Materiales y m´etodos. Despu´es de las tres rondas de purificaci´ on iniciales, todas las placas virales observadas eran azules, lo que indica que el virus era puro, estable y que expresaba el gen marcador.

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El S-SPV-008 se ensay´o en cuanto a la expresi´ on de ant´ıgenos espec´ıficos de PRV usando el CRIBADO ´ DE GENES EXOGENOS ´ DE LAS PLACAS VIRALES NEGRAS EN CUANTO A LA EXPRESION EN SPV RECOMBINANTE. Se demostr´ o que el suero porcino anti-PRV reacciona espec´ıficamente con las placas de S-SPV-008 y no con las placas del control negativo S-SPV-009. Todas las placas de S-SPV-008 observadas reaccionaron con el antisuero porcino lo que indica que el virus expresaba de forma estable el gen ex´ogeno de PRV. Se realiz´ o tambi´en el ensayo de las placas virales negras sobre monocapas no fijadas. Las placas de SPV sobre las monocapas no fijadas presentaron tambi´en reactividad espec´ıfica con el suero porcino anti-PRV lo que indica que el ant´ıgeno PRV es expresado en la superficie de las c´elulas infectadas. Para confirmar la expresi´on del producto g´enico PRV gp50, se infectaron las c´elulas con SPV y las

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ES 2 191 663 T3

5

muestras de los lisados de las c´elulas infectadas se sometieron a electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida. Se analiz´ o el gel usando el PROCEDIMIENTO DE TRANSFERENCIA WESTERN. El suero porcino anti-PRV se us´o para detectar la expresi´on de prote´ınas espec´ıficas de PRV. Como se muestra en la figura 6, el lisado de las c´elulas infectadas con S-SPV-008 presentaba una banda espec´ıfica de aproximadamente 48 kd, el tama˜ no descrito para el PRV gp50 (35).

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El PRV gp50 es el hom´ ologo gD de HSV-1 (26). Varios investigadores han demostrado que el VV (virus vaccinia) que expresa gD de HSV-1 proteger´a a los ratones frente a la infecci´on con HSV-1 (6 y 34). Por tanto el S-SPV-008 debe ser valioso como una vacuna para proteger a los cerdos frente a la enfermedad por PRV.

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Es de esperar que otras varias glucoprote´ınas de PRV ser´ an u ´ tiles en la creaci´on de vacunas recombinantes de la viruela porcina para proteger frente a la enfermedad por PRV. Estas glucoprote´ınas de PRV incluyen gpII (28), gpIII (27), y gpH (19). La regi´ on que codifica PRV gpIII ha sido construida detr´ as de varios promotores pox-virales sint´eticos. Las t´ecnicas utilizadas para la creaci´on de S-SPV-008 ser´ an usadas para crear virus recombinantes de la viruela porcina que expresan los cuatro genes de estas glucoprote´ınas de PRV. Tales virus recombinantes de la viruela porcina ser´ an u ´tiles como vacunas frente a la enfermedad por PRV. Puesto que las vacunas de PRV descritas aqu´ı no expresan ni gpX ni gpI R , de PRV, deber´ıan ser compatibles con los ensayos actuales de diagn´ ostico de PRV (gX HerdChek

R

R gpI HerdChek y ClinEase ) que se utilizan para distinguir a los animales vacunados de los animales infectados. El S-SPV-008 ha sido depositado ante la ATCC con el No. de acceso VR 2339. Ejemplo 4

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S-SPV-009

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El S-SPV-009 es un virus de la viruela porcina que expresa al menos dos genes ex´ogenos. Se insertaron en el ORF 515-85.1 de SPV, el gen de la β-galactosidasa (gen lacZ) de E. coli y el gen de la hemaglutinina (HN) del virus de la enfermedad de Newcastle. El gen lacZ est´a bajo el control de un promotor tard´ıo sint´etico (LP1) y el gen HN est´a bajo el control de un promotor inicial/tard´ıo sint´etico (EP1LP2).

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El S-SPV-009 se deriv´o del S-SPV-001 (cepa Kasza). Esto se consigui´o utilizando el vector de homolog´ıa 538-46.26 (v´ease Materiales y m´etodos) y el virus S-SPV-001 en el PROCEDIMIENTO DE ´ HOMOLOGA ´ RECOMBINACION PARA GENERAR SPV RECOMBINANTE. La reserva de transfecci´on se crib´ o por el CRIBADO DEL SPV RECOMBINANTE QUE EXPRESA β-GALACTOSIDASA (ENSAYOS CON BLUOGAL Y CPRG). El resultado final de la purificaci´ on de las placas virales rojas fue el virus recombinante denominado S-SPV-009. Este virus se ensay´ o en cuanto a la expresi´on de βgalactosidasa, pureza, y estabilidad del inserto por medio de m´ ultiples pases monitorizados por el ensayo de las placas virales azules como se describe en Materiales y m´etodos. Despu´es de las tres rondas de purificaci´ on iniciales, todas las placas virales observadas eran azules, lo que indica que el virus era puro, estable y que expresaba el gen marcador. El S-SPV-009 se ensay´o en cuanto a la expresi´ on de ant´ıgenos espec´ıficos de PRV usando el CRIBADO ´ DE GENES EXOGENOS ´ DE LAS PLACAS VIRALES NEGRAS EN CUANTO A LA EXPRESION EN SPV RECOMBINANTE. Se demostr´ o que el suero anti-NDV HN de conejo reacciona espec´ıficamente con las placas de S-SPV-009 y no con las placas del control negativo S-SPV-008. Todas las placas de S-SPV-009 observadas reaccionaron con el antisuero porcino lo que indica que el virus expresaba de forma estable el gen ex´ogeno de NDV. El S-SPV-009 ha sido depositado ante la ATCC con el No. de acceso VR 2344.

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Para confirmar la expresi´on del producto g´enico NDV HN, se infectaron las c´elulas con SPV y las muestras de los lisados de las c´elulas infectadas se sometieron a electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida. Se analiz´ o el gel usando el PROCEDIMIENTO DE TRANSFERENCIA WESTERN. El suero anti-NDV HN de conejo se us´o para detectar la expresi´on de la prote´ına HN. El lisado de las c´elulas infectadas con S-SPV-009 presentaba una banda espec´ıfica de aproximadamente 74 kd, el tama˜ no descrito para NDV HN (29). Ejemplo 5

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Se puede realizar por ingenier´ıa gen´etica el desarrollo de vacunas que utilizan el virus de la viruela porcina para expresar ant´ıgenos procedentes de microorganismos que causan diferentes enfermedades.

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ES 2 191 663 T3 Virus de la gastroenteritis transmisible

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Ha sido clonado el principal ant´ıgeno neutralizante del virus de la gastroenteritis transmisible (TGE), la glucoprote´ına 195, para uso en el vector de virus de la viruela porcina. El clon del ant´ıgeno neutralizante est´a descrito en el documento U.S. Serial No. 078.519, presentado el 27 de julio de 1987. Se contempla que los procedimientos que han sido usados para expresar la gp50 de PRV en SPV y que se describen aqu´ı son aplicables a la TGE. Parvovirus porcino

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Ha sido clonada la principal prote´ına de la c´ apsida del parvovirus porcino (PPV) para uso en el vector de virus de la viruela porcina. El clon de la prote´ına de la c´apsida est´ a descrito en la patente de Estados Unidos No. 5.068.192 expedida el 26 de noviembre de 1991. Se contempla que los procedimientos que han sido usados para expresar la gp50 de PRV en SPV y que se describen aqu´ı son aplicables al PPV. 15

Rotavirus porcino

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Ha sido clonado el principal ant´ıgeno neutralizante del rotavirus porcino, la glucoprote´ına 38, para uso en el vector de virus de la viruela porcina. El clon de la glucoprote´ına 38 est´a descrito en la patente de Estados Unidos No. 5.068.192 expedida el 26 de noviembre de 1991. Se contempla que los procedimientos que han sido usados para expresar la gp50 de PRV en SPV y que se describen aqu´ı son aplicables al SRV. Virus de la peste porcina

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El principal ant´ıgeno neutralizante del virus de la diarrea viral bovina (BVD) ha sido clonado como se describe en el documento U.S. Serial No. 225.032, presentado el 27 de julio de 1988. Puesto que los virus de BVD y de la peste porcina son protectores cruzados (31), el ant´ıgeno del virus de la BVD ha sido elegido para uso en el vector de virus de la viruela porcina. Se contempla que los procedimientos que han sido usados para expresar la gp50 de PRV en SPV y que se describen aqu´ı son aplicables al virus de BVD. Serpulina hyodysenteriae

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Ha sido clonado un ant´ıgeno protector de Serpulina hyodysenteriae (3), para uso en el vector de virus de la viruela porcina. Se contempla que los procedimientos que han sido usados para expresar la gp50 de PRV en SPV y que se describen aqu´ı son aplicables tambi´en a la Serpulina hyodysenteriae. Tambi´en se pueden utilizar ant´ıgenos procedentes de los siguientes microorganismos para desarrollar vacunas para animales: virus de la gripe porcina, virus de la glosopeda, virus de la fiebre porcina africana, virus de la peste porcina y Mycoplasma hyodysenteriae. Referencias 1. C. Bertholet, et al., EMBO Journal 5, 1951-1957 (1986).

45

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50

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55

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60

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ES 2 191 663 T3 REIVINDICACIONES

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1. Un virus recombinante de la viruela porcina que comprende un genoma del virus de la viruela porcina que contiene una secuencia de DNA ex´ogeno insertada dentro del subfragmento m´ as grande de HindIII a BgIII del fragmento HindIII M del DNA gen´ omico, y en el que la secuencia de DNA ex´ogeno se expresa en una c´elula hospedante infectada con el virus recombinante de la viruela porcina. 2. El virus recombinante de la viruela porcina de la reivindicaci´on 1, en el que la secuencia de DNA ex´ogeno est´a insertada dentro de un marco de lectura abierta contenido en el subfragmento de HindIII a BglII. 3. El virus recombinante de la viruela porcina de la reivindicaci´ on 2, en el que el DNA ex´ogeno est´a insertado en un u ´ nico sitio de la endonucleasa de restricci´on AccI localizado en el subfragmento de HindIII a BglII.

15

4. El virus recombinante de la viruela porcina de las reivindicaciones 1, 2 o´ 3, en el que la secuencia de DNA ex´ ogeno es una primera secuencia de DNA ex´ogeno, que comprende adem´ as una segunda secuencia de DNA ex´ ogeno insertada en un sitio de inserci´ on que no es esencial para la replicaci´on del virus de la viruela porcina. 20

5. Un vector de homolog´ıa para producir un virus recombinante de la viruela porcina por medio de insertar un DNA ex´ ogeno en el DNA gen´omico del virus de la viruela porcina, que comprende a) una secuencia de DNA ex´ogeno bicatenario 25

30

b) est´a flanqueado en un extremo del DNA ex´ ogeno por un DNA del virus de la viruela porcina bicatenario hom´ ologo con el DNA gen´omico localizado en un lado de un sitio del DNA gen´ omico, en el que dicho sitio est´a localizado en el subfragmento m´as grande de HindIII a BgIII del fragmento HindIII M del DNA gen´ omico del virus de la viruela porcina, c) est´a flanqueado en el otro extremo del DNA ex´ ogeno por un DNA del virus de la viruela porcina bicatenario hom´ ologo con el DNA gen´omico localizado en el otro lado del mismo sitio del DNA gen´ omico.

35

6. El vector de homolog´ıa de la reivindicaci´on 5, en el que el DNA del virus de la viruela porcina que flanquea la secuencia del DNA ex´ogeno bicatenario es hom´ ologo con el DNA gen´omico presente dentro del marco de lectura abierta contenido en el subfragmento de HindIII a BgIII.

40

7. El vector de homolog´ıa de la reivindicaci´on 6, en el que el DNA del virus de la viruela porcina bicatenario que flanquea la secuencia del DNA ex´ ogeno bicatenario es hom´ ologo con el DNA gen´omico localizado en cualquiera de los lados del sitio u ´ nico de la endonucleasa de restricci´ on AccI localizado en el subfragmento de HindIII a BglII.

45

8. El virus recombinante de la viruela porcina de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o el vector de homolog´ıa de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, en los que el DNA ex´ ogeno codifica un polip´eptido. 9. El virus recombinante de la viruela porcina o el vector de homolog´ıa de la reivindicaci´on 8, en los que el polip´eptido es un marcador detectable.

50

55

10. El virus recombinante de la viruela porcina o el vector de homolog´ıa de la reivindicaci´on 9, en los que el marcador detectable es la beta-galactosidasa de E. coli. 11. El virus recombinante de la viruela porcina de la reivindicaci´on 10, denominado S-SPV-003 (N◦ de acceso a ATCC, VR 2335). 12. El virus recombinante de la viruela porcina o el vector de homolog´ıa de la reivindicaci´on 8, en los que el polip´eptido es un polip´eptido antig´enico.

60

13. El virus recombinante de la viruela porcina o el vector de homolog´ıa de la reivindicaci´on 12, en los que el polip´eptido antig´enico es o procede de la glucoprote´ına 50 de PRV, glucoprote´ına II de PRV, glucoprote´ına III de PRV, glucoprote´ına H de PRV, glucoprote´ına 195 de la TGE, prote´ına de la matriz de la TGE, glucoprote´ına 38 de rotavirus porcino, prote´ına de la c´apsida de parvovirus porcino, ant´ıgeno 17

ES 2 191 663 T3 protector de la Serpulina hyodysenteriae, glucoprote´ına 55 de la BVD, hemaglutinina-neuraminidasa del NDV, hemaglutinina de la gripe porcina, neuraminidasa de la gripe porcina, Serpulina hyodysenteriae, virus de la enfermedad de la glosopeda, virus de la peste porcina, virus de la gripe porcina, virus de la fiebre porcina africana o Mycoplasma hyopneumoniae. 5

14. El virus recombinante de la viruela porcina de la reivindicaci´on 13, en el que el polip´eptido antig´enico es la glucoprote´ına 50 de PRV, designado S-SPV-008 (N◦ de acceso a ATCC, VR 2339).

10

15. El virus recombinante de la viruela porcina de la reivindicaci´on 13, en el que el polip´eptido antig´enico es la hemaglutinina-neuraminidasa del NDV, designado S-SPV-009 (N◦ de acceso a ATCC, VR 2344). 16. El virus recombinante de la viruela porcina de la reivindicaci´ on 8, en el que el DNA ex´ogeno comprende adem´ as un promotor del virus de la viruela porcina.

15

17. El virus recombinante de la viruela porcina o el vector de homolog´ıa de la reivindicaci´on 8, en los que el DNA ex´ogeno comprende adem´ as un promotor pox-viral sint´etico.

20

18. Una vacuna que comprende una cantidad inmunizante efectiva del virus recombinante de la viruela porcina de una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15 y un veh´ıculo adecuado. 19. Una c´elula hospedante infectada con el virus recombinante de la viruela porcina de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 u 8 a 17.

25

20. La c´elula hospedante de la reivindicaci´ on 19, en la que la c´elula hospedante es una c´elula de mam´ıfero. 21. La c´elula hospedante de la reivindicaci´ on 20, en la que la c´elula de mam´ıfero es una c´elula Vero.

30

22. La c´elula hospedante de la reivindicaci´ on 20, en la que la c´elula de mam´ıfero es una c´elula EMSK.

35

40

45

50

55

60

NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art. 167.2 del Convenio de Patentes Europeas (CPE) y a la Disposici´ on Transitoria del RD 2424/1986, de 10 de octubre, relativo a la aplicaci´ on del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a Espa˜ na y solicitadas antes del 7-10-1992, no producir´ an ning´ un efecto en Espa˜ na en la medida en que confieran protecci´ on a productos qu´ımicos y farmac´euticos como tales. Esta informaci´ on no prejuzga que la patente est´e o no inclu´ıda en la mencionada reserva.

18

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19

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38

ES 2 191 663 T3 LISTA DE SECUENCIAS ´ GENERAL: (1) INFORMACION 5

(i) SOLICITANTE: Cochran Ph. D., Mark D Junker M. S., David E ´ Virus recombinante de la viruela porcina (ii) T´ITULO DE LA INVENCION:

10

´ (iii) NUMERO DE SECUENCIAS: 42 ´ POSTAL: (iv) DIRECCION

15

(A) NOMBRE: John P. White (B) CALLE: 30 Rockefeller Plaza (C) CIUDAD: New York

20

(D) ESTADO: New York (E) PA´IS: USA

25

´ (F) CODIGO POSTAL: 10112 (v) FORMA DE LECTURA EN ORDENADOR: (A) TIPO DE MEDIO: Disco magn´etico flexible

30

(B) ORDENADOR: IBM PC compatible (C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

35

(D) SOFTWARE: PatentIn Release #1,0, Versi´ on #1,25 (vi) DATOS ACTUALES DE LA SOLICITUD: ´ (A) NUMERO DE SOLICITUD:

40

´ (B) FECHA DE PRESENTACION: ´ (C) CLASIFICACION:

45

´ DEL AGENTE/APODERADO: (viii) INFORMACION (A) NOMBRE: White, John P ´ SOBRE TELECOMUNICACION: ´ (ix) INFORMACION

50

´ (A) TELEFONO: (212) 977-9550 (B) TELEFAX: (212) 664-0525

55

(C) TELEX: 422523 ´ SOBRE LA SEQ ID NO: 1: (2) INFORMACION (i) CARACTER´ISTICAS DE LA SECUENCIA:

60

(A) LONGITUD: 599 pares de bases (B) TIPO: ´acido nucleico 1

ES 2 191 663 T3

(C) TIPO DE CADENA: doble (D) TOPOLOG´IA: lineal 5

´ (ii) TIPO DE MOLECULA: DNA (gen´ omico) ´ (iii) HIPOTETICO: NO

10

(iv) ANTISENTIDO: NO (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Virus de la viruela porcina

15

(B) CEPA: Kasza (C) AISLADO INDIVIDUAL: S-SPV-001 20

(vii) FUENTE INMEDIATA: (B) CLON: 515-85.1 ´ EN EL GENOMA: (viii) POSICION

25

´ EN EL MAPA: -23.2 (B) POSICION (C) UNIDADES: % G

30

(ix) CARACTER´ISTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS ´ (B) LOCALIZACION: 202..597

35

´ /parcial (D) OTRA INFORMACION: /inicio de los codones = 202

40

/funci´ on = “prote´ına potencial eucari´ otica reguladora de la transcripci´ on” /nombre est´ andar = “515-85.1 ORF” ´ DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1: (xi) DESCRIPCION

45

50

55

60

2

ES 2 191 663 T3

5

10

15

20

25

30

35

40

´ SOBRE LA SEQ ID NO: 2: (2) INFORMACION (i) CARACTER´ISTICAS DE LA SECUENCIA: 45

(A) LONGITUD: 132 amino´ acidos (B) TIPO: amino´ acido

50

(D) TOPOLOG´IA: lineal ´ (ii) TIPO DE MOLECULA: prote´ına ´ DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2: (xi) DESCRIPCION

55

60

3

ES 2 191 663 T3

5

10

15

20

25

30

´ SOBRE LA SEQ ID NO: 3: (2) INFORMACION (i) CARACTER´ISTICAS DE LA SECUENCIA: 35

(A) LONGITUD: 899 pares de bases (B) TIPO: ´acido nucleico

40

(C) TIPO DE CADENA: doble (D) TOPOLOG´IA: lineal ´ (ii) TIPO DE MOLECULA: DNA (gen´ omico)

45

´ (iii) HIPOTETICO: NO (iv) ANTISENTIDO: NO

50

(vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Virus de la viruela porcina (B) CEPA: Kasza

55

(C) AISLADO INDIVIDUAL: S-SPV-001 (vii) FUENTE INMEDIATA:

60

(B) CLON: 515-85.1 ´ EN EL GENOMA: (viii) POSICION

4

ES 2 191 663 T3 ´ EN EL MAPA: -23.2 (B) POSICION (C) UNIDADES: % G 5

(ix) CARACTER´ISTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS ´ (B) LOCALIZACION: 3..662

10

´ /parcial (D) OTRA INFORMACION: /inicio de los codones = 3

15

/funci´ on = “prote´ına potencial eucari´ otica reguladora de la transcripci´ on” /nombre est´ andar = “515-85.1 ORF” ´ DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3: (xi) DESCRIPCION

20

25

30

35

40

45

50

55

60

5

ES 2 191 663 T3

5

10

15

20

´ SOBRE LA SEQ ID NO: 4: (2) INFORMACION (i) CARACTER´ISTICAS DE LA SECUENCIA:

25

(A) LONGITUD: 220 amino´ acidos (B) TIPO: amino´ acido (D) TOPOLOG´IA: lineal

30

´ (ii) TIPO DE MOLECULA: prote´ına ´ DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4: (xi) DESCRIPCION

35

40

45

50

55

60

6

ES 2 191 663 T3

5

10

15

´ SOBRE LA SEQ ID NO: 5: (2) INFORMACION (i) CARACTER´ISTICAS DE LA SECUENCIA:

20

(A) LONGITUD: 129 amino´ acidos (B) TIPO: amino´ acido (C) TIPO DE CADENA: doble

25

(D) TOPOLOG´IA: lineal ´ (ii) TIPO DE MOLECULA: p´eptido

30

´ (iii) HIPOTETICO: S´I (iv) ANTISENTIDO: NO (v) TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal

35

(vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Virus Vaccinia

40

(B) CEPA: Copenhagen ´ EN EL GENOMA: (viii) POSICION ´ EN EL MAPA: -23.2 (B) POSICION

45

(C) UNIDADES: % G ´ DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5: (xi) DESCRIPCION

50

55

60

7

ES 2 191 663 T3

5

10

15

20

25

30

´ SOBRE LA SEQ ID NO: 6: (2) INFORMACION 35

(i) CARACTER´ISTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 132 amino´ acidos (B) TIPO: amino´ acido

40

(C) TIPO DE CADENA: doble (D) TOPOLOG´IA: lineal

45

´ (ii) TIPO DE MOLECULA: p´eptido ´ (iii) HIPOTETICO: S´I (iv) ANTISENTIDO: NO

50

(v) TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal (vi) FUENTE ORIGINAL:

55

(A) ORGANISMO: Virus de la viruela porcina (B) CEPA: Kasza ´ EN EL GENOMA: (viii) POSICION

60

´ EN EL MAPA: -23.2 (B) POSICION (C) UNIDADES: % G 8

ES 2 191 663 T3

´ DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6: (xi) DESCRIPCION

5

10

15

20

25

30

35

´ SOBRE LA SEQ ID NO: 7: (2) INFORMACION (i) CARACTER´ISTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 101 amino´ acidos

40

(B) TIPO: amino´ acido (C) TIPO DE CADENA: doble

45

(D) TOPOLOG´IA: lineal ´ (ii) TIPO DE MOLECULA: p´eptido ´ (iii) HIPOTETICO: S´I

50

(iv) ANTISENTIDO: NO (v) TIPO DE FRAGMENTO: C-terminal

55

(vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Virus Vaccinia (B) CEPA: Copenhagen

60

´ EN EL GENOMA: (viii) POSICION ´ EN EL MAPA: -23.2 (B) POSICION 9

ES 2 191 663 T3

(C) UNIDADES: % G ´ DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7: (xi) DESCRIPCION 5

10

15

20

25

30

´ SOBRE LA SEQ ID NO: 8: (2) INFORMACION (i) CARACTER´ISTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 100 amino´ acidos

35

(B) TIPO: amino´ acido (C) TIPO DE CADENA: doble 40

(D) TOPOLOG´IA: lineal ´ (ii) TIPO DE MOLECULA: p´eptido ´ (iii) HIPOTETICO: S´I

45

(iv) ANTISENTIDO: NO (v) TIPO DE FRAGMENTO: C-terminal 50

(vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Virus de la viruela porcina (B) CEPA: Kasza

55

´ EN EL GENOMA: (viii) POSICION ´ EN EL MAPA: -23.2 (B) POSICION 60

(C) UNIDADES: % G ´ DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8: (xi) DESCRIPCION 10

ES 2 191 663 T3

5

10

15

20

25

´ SOBRE LA SEQ ID NO: 9: (2) INFORMACION (i) CARACTER´ISTICAS DE LA SECUENCIA:

30

(A) LONGITUD: 102 pares de bases (B) TIPO: ´acido nucleico (C) TIPO DE CADENA: doble

35

(D) TOPOLOG´IA: circular ´ (ii) TIPO DE MOLECULA: DNA (gen´ omico)

40

´ (iii) HIPOTETICO: NO (iv) ANTISENTIDO: NO (vi) FUENTE ORIGINAL:

45

(A) ORGANISMO: Pl´ asmido (vii) FUENTE INMEDIATA:

50

(B) CLON: 520-17.5 (Uni´ on A) ´ SOBRE LA PUBLICACION: ´ (x) INFORMACION (A) AUTORES: Ferrari, Franco A

55

Trach, Kathleen Hoch, James A

60

(B) T´ITULO: Sequence Analysis of the spoOB Locus Revels a Polycistronic Transcription Unit (C) REVISTA: J. Bacteriol.

11

ES 2 191 663 T3 (D) VOLUMEN: 161 ´ (E) EDICION: 2 5

´ (F) PAGINAS: 556-562 (G) FECHA: Febrero, 1985 ´ DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9: (xi) DESCRIPCION

10

15

´ SOBRE LA SEQ ID NO: 10: (2) INFORMACION (i) CARACTER´ISTICAS DE LA SECUENCIA: 20

(A) LONGITUD: 102 pares de bases (B) TIPO: ´acido nucleico

25

(C) TIPO DE CADENA: doble (D) TOPOLOG´IA: circular ´ (ii) TIPO DE MOLECULA: DNA (gen´ omico)

30

´ (iii) HIPOTETICO: NO (iv) ANTISENTIDO: NO

35

(vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Pl´ asmido (vii) FUENTE INMEDIATA:

40

(B) CLON: 520-17.5 (Uni´ on A) (ix) CARACTER´ISTICAS:

45

(A) NOMBRE/CLAVE: CDS ´ (B) LOCALIZACION: 85..99 ´ /inicio de los codones = 85 (D) OTRA INFORMACION:

50

/funci´ on = “comienzo de la traduci´ on de la prote´ına h´ıbrida” /producto = “p´eptido con N-terminal”

55

/n´ umero = 1 /nombre est´ andar = “Traducci´ on de la secuencia de DNA sint´etico” (ix) CARACTER´ISTICAS:

60

(A) NOMBRE/CLAVE: CDS ´ (B) LOCALIZACION: 100..102 12

ES 2 191 663 T3

´ ´ experimental (C) METODO DE IDENTIFICACION: ´ /parcial (D) OTRA INFORMACION: 5

/inicio de los codones = 100 /funci´ on = “enzima marcadora” 10

/producto = “Beta-Galactosidasa” /evidencia = EXPERIMENTAL /gen = “lacz”

15

/n´ umero = 2 /cita = ([1]) 20

´ SOBRE LA PUBLICACION: ´ (x) INFORMACION (A) AUTORES: Ferrari, Franco A Trach, Kathleen

25

Hoch, James A (B) T´ITULO: Sequence Analysis of the spoOB Locus Revels a Polycistronic Transcription Unit 30

(C) REVISTA: J. Bacteriol. (D) VOLUMEN: 161 ´ (E) EDICION: 2

35

´ (F) PAGINAS: 556-562 (G) FECHA: Febrero, 1985

40

´ DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10: (xi) DESCRIPCION

45

50

´ SOBRE LA SEQ ID NO: 11: (2) INFORMACION (i) CARACTER´ISTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 5 amino´ acidos

55

(B) TIPO: amino´ acido (D) TOPOLOG´IA: lineal 60

´ (ii) TIPO DE MOLECULA: prote´ına ´ DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11: (xi) DESCRIPCION 13

ES 2 191 663 T3

5

´ SOBRE LA SEQ ID NO: 12: (2) INFORMACION (i) CARACTER´ISTICAS DE LA SECUENCIA:

10

(A) LONGITUD: 1 amino´ acido (B) TIPO: amino´ acido (D) TOPOLOG´IA: lineal

15

´ (ii) TIPO DE MOLECULA: prote´ına ´ DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 12: (xi) DESCRIPCION

20

25

´ SOBRE LA SEQ ID NO: 13: (2) INFORMACION (i) CARACTER´ISTICAS DE LA SECUENCIA:

30

(A) LONGITUD: 103 pares de bases (B) TIPO: ´acido nucleico (C) TIPO DE CADENA: doble

35

(D) TOPOLOG´IA: circular ´ (ii) TIPO DE MOLECULA: DNA (gen´ omico)

40

´ (iii) HIPOTETICO: NO (iv) ANTISENTIDO: NO (vi) FUENTE ORIGINAL:

45

(A) ORGANISMO: Pl´ asmido (vii) FUENTE INMEDIATA:

50

(B) CLON: 520-17.5 (Uni´ on C) (ix) CARACTER´ISTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS

55

´ (B) LOCALIZACION: 1..72 ´ ´ experimental (C) METODO DE IDENTIFICACION:

60

´ /parcial (D) OTRA INFORMACION: /inicio de los codones = 1

14

ES 2 191 663 T3 /funci´ on = “enzima marcadora” /producto = “Beta-Galactosidasa” 5

/evidencia = EXPERIMENTAL /gen = “lacz” /n´ umero = 1

10

/cita = ([1]) (ix) CARACTER´ISTICAS: 15

(A) NOMBRE/CLAVE: CDS ´ (B) LOCALIZACION: 73..78 ´ ´ experimental (C) METODO DE IDENTIFICACION:

20

´ /inicio de los codones = 73 (D) OTRA INFORMACION: /funci´ on = “final de la traduci´ on de la prote´ına h´ıbrida”

25

/producto = “p´eptido con C-terminal” /evidencia = EXPERIMENTAL /n´ umero = 2

30

/nombre est´ andar = “Traducci´ on de la secuencia de DNA sint´etico” ´ SOBRE LA PUBLICACION: ´ (x) INFORMACION 35

(A) AUTORES: Ferrari, Franco A Trach, Kathleen Hoch, James A

40

(B) T´ITULO: Sequence Analysis of the spoOB Locus Revels a Polycistronic Transcription Unit (C) REVISTA: J. Bacteriol.

45

(D) VOLUMEN: 161 ´ (E) EDICION: 2 ´ (F) PAGINAS: 556-562

50

(G) FECHA: Febrero, 1985 ´ DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 13: (xi) DESCRIPCION 55

60

15

ES 2 191 663 T3

5

10

´ SOBRE LA SEQ ID NO: 14: (2) INFORMACION (i) CARACTER´ISTICAS DE LA SECUENCIA: 15

(A) LONGITUD: 24 amino´ acidos (B) TIPO: amino´ acido

20

(D) TOPOLOG´IA: lineal ´ (ii) TIPO DE MOLECULA: prote´ına ´ DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 14: (xi) DESCRIPCION

25

30

35

´ SOBRE LA SEQ ID NO: 15: (2) INFORMACION (i) CARACTER´ISTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 2 amino´ acidos

40

(B) TIPO: amino´ acido (D) TOPOLOG´IA: lineal

45

´ (ii) TIPO DE MOLECULA: prote´ına ´ DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 15: (xi) DESCRIPCION

50

´ SOBRE LA SEQ ID NO: 16: (2) INFORMACION 55

(i) CARACTER´ISTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 48 pares de bases

60

(B) TIPO: ´acido nucleico (C) TIPO DE CADENA: doble

16

ES 2 191 663 T3 (D) TOPOLOG´IA: circular ´ (ii) TIPO DE MOLECULA: DNA (gen´ omico) 5

´ (iii) HIPOTETICO: NO (iv) ANTISENTIDO: NO (vi) FUENTE ORIGINAL:

10

(A) ORGANISMO: Pl´ asmido (vii) FUENTE INMEDIATA: 15

(B) CLON: 520-17.5 (Uni´ on D) ´ DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 16: (xi) DESCRIPCION

20

´ SOBRE LA SEQ ID NO: 17: (2) INFORMACION 25

(i) CARACTER´ISTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 57 pares de bases

30

(B) TIPO: ´acido nucleico (C) TIPO DE CADENA: doble (D) TOPOLOG´IA: circular

35

´ (ii) TIPO DE MOLECULA: DNA (gen´ omico) ´ (iii) HIPOTETICO: NO

40

(iv) ANTISENTIDO: NO (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Pl´ asmido

45

(vii) FUENTE INMEDIATA: (B) CLON: 538-46.26 (Uni´ on A)

50

55

´ DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 17: (xi) DESCRIPCION

´ SOBRE LA SEQ ID NO: 18: (2) INFORMACION (i) CARACTER´ISTICAS DE LA SECUENCIA:

60

(A) LONGITUD: 102 pares de bases (B) TIPO: ´acido nucleico

17

ES 2 191 663 T3 (C) TIPO DE CADENA: doble (D) TOPOLOG´IA: circular 5

´ (ii) TIPO DE MOLECULA: DNA (gen´ omico) ´ (iii) HIPOTETICO: NO (iv) ANTISENTIDO: NO

10

(vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Pl´ asmido 15

(vii) FUENTE INMEDIATA: (B) CLON: 538-46.16 (Uni´ on B) (ix) CARACTER´ISTICAS:

20

(A) NOMBRE/CLAVE: CDS ´ (B) LOCALIZACION: 91..102 25

´ ´ experimental (C) METODO DE IDENTIFICACION: ´ /parcial (D) OTRA INFORMACION: /inicio de los codones = 91

30

/funci´ on = “enzima marcadora” /producto = “Beta-Galactosidasa” 35

/evidencia = EXPERIMENTAL /gen = “lacz” /n´ umero = 2

40

/cita = ([1]) (ix) CARACTER´ISTICAS: 45

(A) NOMBRE/CLAVE: CDS ´ (C) LOCALIZACION: 76..90 ´ /parcial (D) OTRA INFORMACION:

50

/inicio de los codones = 76 /funci´ on = “comienzo de la traduci´ on de la prote´ına h´ıbrida” 55

/producto = “p´eptido con N-terminal” /n´ umero = 1 /nombre est´ andar = “Traducci´ on de la secuencia de DNA sint´etico”

60

´ SOBRE LA PUBLICACION: ´ (x) INFORMACION

18

ES 2 191 663 T3 (A) AUTORES: Ferrari, Franco A Trach, Kathleen 5

Hoch, James A (B) T´ITULO: Sequence Analysis of the spoOB Locus Revels a Polycistronic Transcription Unit (C) REVISTA: J. Bacteriol.

10

(D) VOLUMEN: 161 ´ (E) EDICION: 2 15

´ (F) PAGINAS: 556-562 (G) FECHA: Febrero, 1985 ´ DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 18: (xi) DESCRIPCION

20

25

´ SOBRE LA SEQ ID NO: 19: (2) INFORMACION 30

(i) CARACTER´ISTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 5 amino´ acidos (B) TIPO: amino´ acido

35

(D) TOPOLOG´IA: lineal ´ (ii) TIPO DE MOLECULA: prote´ına

40

45

´ DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 19: (xi) DESCRIPCION

´ SOBRE LA SEQ ID NO: 20: (2) INFORMACION (i) CARACTER´ISTICAS DE LA SECUENCIA:

50

(A) LONGITUD: 4 amino´ acidos (B) TIPO: amino´ acido (D) TOPOLOG´IA: lineal

55

´ (ii) TIPO DE MOLECULA: prote´ına ´ DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 20: (xi) DESCRIPCION

60

19

ES 2 191 663 T3 ´ SOBRE LA SEQ ID NO: 21: (2) INFORMACION (i) CARACTER´ISTICAS DE LA SECUENCIA: 5

(A) LONGITUD: 206 pares de bases (B) TIPO: ´acido nucleico (C) TIPO DE CADENA: doble

10

(D) TOPOLOG´IA: circular ´ (ii) TIPO DE MOLECULA: DNA (gen´ omico)

15

´ (iii) HIPOTETICO: NO (iv) ANTISENTIDO: NO (vi) FUENTE ORIGINAL:

20

(A) ORGANISMO: Pl´ asmido (vii) FUENTE INMEDIATA: 25

(B) CLON: 538-46.16 (Uni´ on C) (ix) CARACTER´ISTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS

30

´ (B) LOCALIZACION: 1..63 ´ ´ experimental (C) METODO DE IDENTIFICACION:

35

´ /parcial (D) OTRA INFORMACION: /inicio de los codones = 1 /funci´ on = “enzima marcadora”

40

/producto = “Beta-Galactosidasa” /evidencia = EXPERIMENTAL 45

/n´ umero = 1 /cita = ([1]) (ix) CARACTER´ISTICAS:

50

(A) NOMBRE/CLAVE: CDS ´ (B) LOCALIZACION: 64..69 55

´ ´ experimental (C) METODO DE IDENTIFICACION: ´ /inicio de los codones = 64 (D) OTRA INFORMACION: /funci´ on = “final de la traduci´ on de la prote´ına h´ıbrida”

60

/producto = “p´eptido con C-terminal”

20

ES 2 191 663 T3 /evidencia = EXPERIMENTAL /nombre est´ andar = “Traducci´ on de la secuencia de DNA sint´etico” 5

(ix) CARACTER´ISTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS ´ (B) LOCALIZACION: 177..185

10

´ ´ experimental (C) METODO DE IDENTIFICACION: ´ /inicio de los codones = 177 (D) OTRA INFORMACION:

15

/funci´ on = “comienzo de la traduci´ on de la prote´ına h´ıbrida” /producto = “p´eptido con N-terminal” /evidencia = EXPERIMENTAL

20

/nombre est´ andar = “Traducci´ on de la secuencia de DNA sint´etico” (ix) CARACTER´ISTICAS: 25

(A) NOMBRE/CLAVE: CDS ´ (B) LOCALIZACION: 186..206 ´ ´ experimental (C) METODO DE IDENTIFICACION:

30

´ /parcial (E) OTRA INFORMACION: /inicio de los codones = 186

35

/funci´ on = “glucoprote´ına” /producto = “PRV gp50” /evidencia = EXPERIMENTAL

40

/gen = “gp50” /n´ umero = 3 45

/cita = ([2]) ´ SOBRE LA PUBLICACION: ´ (x) INFORMACION (A) AUTORES: Ferrari, Franco A

50

Trach, Kathleen Hoch, James A 55

(B) T´ITULO: Sequence Analysis of the spoOB Locus Revels a Polycistronic Transcription Unit (C) REVISTA: J. Bacteriol. (D) VOLUMEN: 161

60

´ (E) EDICION: 2

21

ES 2 191 663 T3 ´ (F) PAGINAS: 556-562 (F) FECHA: Febrero, 1985 5

´ SOBRE LA PUBLICACION: ´ (x) INFORMACION (A) AUTORES: Petrovskis, Erik A Timmins, James G

10

Armentrout, Marty A Marchioli, Carmine C 15

Jr. Yancy, Robert J Post, Leonard E

20

(B) T´ITULO: DNA Sequence of the Gene for Pseudorabies Virus gp50, a Glycoprotein without N-linked Glycosylation (C) REVISTA: J. Virol. (D) VOLUMEN: 59

25

´ (E) EDICION: 2 ´ (F) PAGINAS: 216-223

30

(G) FECHA: Agosto, 1986 ´ DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 21: (xi) DESCRIPCION

35

40

45

´ SOBRE LA SEQ ID NO: 22: (2) INFORMACION 50

(i) CARACTER´ISTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 21 amino´ acidos

55

(B) TIPO: amino´ acido (D) TOPOLOG´IA: lineal ´ (ii) TIPO DE MOLECULA: prote´ına

60

´ DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 22: (xi) DESCRIPCION

22

ES 2 191 663 T3

5

10

´ SOBRE LA SEQ ID NO: 23: (2) INFORMACION (i) CARACTER´ISTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 2 amino´ acidos

15

(B) TIPO: amino´ acido (D) TOPOLOG´IA: lineal

20

´ (ii) TIPO DE MOLECULA: prote´ına ´ DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 23: (xi) DESCRIPCION

25

´ SOBRE LA SEQ ID NO: 24: (2) INFORMACION 30

(i) CARACTER´ISTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 3 amino´ acidos (B) TIPO: amino´ acido

35

(D) TOPOLOG´IA: lineal ´ (ii) TIPO DE MOLECULA: prote´ına

40

45

´ DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 24: (xi) DESCRIPCION

´ SOBRE LA SEQ ID NO: 25: (2) INFORMACION (i) CARACTER´ISTICAS DE LA SECUENCIA:

50

(A) LONGITUD: 7 amino´ acidos (B) TIPO: amino´ acido (D) TOPOLOG´IA: lineal

55

´ (ii) TIPO DE MOLECULA: prote´ına ´ DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 25: (xi) DESCRIPCION

60

23

ES 2 191 663 T3 ´ SOBRE LA SEQ ID NO: 26: (2) INFORMACION (i) CARACTER´ISTICAS DE LA SECUENCIA: 5

(A) LONGITUD: 101 pares de bases (B) TIPO: ´acido nucleico (C) TIPO DE CADENA: doble

10

(D) TOPOLOG´IA: circular ´ (ii) TIPO DE MOLECULA: DNA (gen´ omico)

15

´ (iii) HIPOTETICO: NO (iv) ANTISENTIDO: NO (vi) FUENTE ORIGINAL:

20

(A) ORGANISMO: Pl´ asmido (vii) FUENTE INMEDIATA: 25

(B) CLON: 538-46.16 (Uni´ on D) (ix) CARACTER´ISTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS

30

´ (B) LOCALIZACION: 1..15 ´ /parcial (D) OTRA INFORMACION:

35

/inicio de los codones = 1 /funci´ on = “glucoprote´ına” /producto = “PRV gp63”

40

/gen = “gp63” /n´ umero = 1 45

/cita = ([1]) ´ SOBRE LA PUBLICACION: ´ (x) INFORMACION (A) AUTORES: Petrovskis, Erik A

50

Timmins, James G Post, Leonard E 55

(B) T´ITULO: Use of Lambda-gt11 to Isolate Genes for two Pseudorabies Virus Glycoproteins with homology to Herpes Simplex Virus and Varicella-Zoster Virus Glycoproteins (C) REVISTA: J. Virol.

60

(D) VOLUMEN: 60 ´ (E) EDICION: 1 24

ES 2 191 663 T3

´ (F) PAGINAS: 185-193 (G) FECHA: octubre, 1986 5

´ DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 26: (xi) DESCRIPCION

10

15

´ SOBRE LA SEQ ID NO: 27: (2) INFORMACION (i) CARACTER´ISTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 5 amino´ acidos

20

(B) TIPO: amino´ acido (D) TOPOLOG´IA: lineal

25

´ (ii) TIPO DE MOLECULA: prote´ına ´ DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 27: (xi) DESCRIPCION

30

´ SOBRE LA SEQ ID NO: 28: (2) INFORMACION 35

(i) CARACTER´ISTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 57 pares de bases (B) TIPO: ´acido nucleico

40

(C) TIPO DE CADENA: doble (D) TOPOLOG´IA: circular 45

´ (ii) TIPO DE MOLECULA: DNA (gen´ omico) ´ (iii) HIPOTETICO: NO (iv) ANTISENTIDO: NO

50

(vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Pl´ asmido 55

(vii) FUENTE INMEDIATA: (B) CLON: 538-46.16 (Uni´ on E) ´ DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 28: (xi) DESCRIPCION

60

25

ES 2 191 663 T3 ´ SOBRE LA SEQ ID NO: 29: (2) INFORMACION (i) CARACTER´ISTICAS DE LA SECUENCIA: 5

(A) LONGITUD: 1907 pares de bases (B) TIPO: ´acido nucleico (C) TIPO DE CADENA: doble

10

(D) TOPOLOG´IA: lineal ´ (ii) TIPO DE MOLECULA: cDNA para mRNA

15

´ (iii) HIPOTETICO: NO (iv) ANTISENTIDO: NO (vi) FUENTE ORIGINAL:

20

(A) ORGANISMO: Virus de la enfermedad de Newcastle (B) CEPA: B1 25

(vii) FUENTE INMEDIATA: (B) CLON: 137-23.803 (PSY1142) ´ EN EL GENOMA: (viii) POSICION

30

´ EN EL MAPA: ∼ 50 % (B) POSICION (C) UNIDADES: % G

35

(ix) CARACTER´ISTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS ´ (B) LOCALIZACION: 92..1822

40

´ /inicio de los codones = 92 (D) OTRA INFORMACION: /producto = “hemaglutinina-Neuraminidasa de NDV”

45

/gen = “HN” /n´ umero = 1 ´ DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 29: (xii) DESCRIPCION

50

55

60

26

ES 2 191 663 T3

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

27

ES 2 191 663 T3

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

28

ES 2 191 663 T3

5

10

15

20

25

30

´ SOBRE LA SEQ ID NO: 30: (2) INFORMACION (i) CARACTER´ISTICAS DE LA SECUENCIA: 35

(A) LONGITUD: 577 amino´ acidos (B) TIPO: amino´ acido 40

(D) TOPOLOG´IA: lineal ´ (ii) TIPO DE MOLECULA: prote´ına ´ DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 30: (xi) DESCRIPCION

45

50

55

60

29

ES 2 191 663 T3

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

30

ES 2 191 663 T3

5

10

15

20

25

30

35

40

´ SOBRE LA SEQ ID NO: 31: (2) INFORMACION (i) CARACTER´ISTICAS DE LA SECUENCIA:

45

(A) LONGITUD: 57 pares de bases (B) TIPO: ´acido nucleico (C) TIPO DE CADENA: doble

50

(D) TOPOLOG´IA: circular ´ (ii) TIPO DE MOLECULA: DNA (gen´ omico)

55

´ (iii) HIPOTETICO: NO (iv) ANTISENTIDO: NO (vi) FUENTE ORIGINAL:

60

(A) ORGANISMO: Pl´ asmido (vii) FUENTE INMEDIATA: 31

ES 2 191 663 T3

(B) CLON: 538-46.16 (Uni´ on A) ´ DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 31: (xi) DESCRIPCION 5

10

´ SOBRE LA SEQ ID NO: 32: (2) INFORMACION (i) CARACTER´ISTICAS DE LA SECUENCIA: 15

(A) LONGITUD: 108 pares de bases (B) TIPO: ´acido nucleico

20

(C) TIPO DE CADENA: doble (D) TOPOLOG´IA: lineal ´ (ii) TIPO DE MOLECULA: DNA (gen´ omico)

25

´ (iii) HIPOTETICO: NO (iv) ANTISENTIDO: NO

30

(vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: pl´ asmido (vii) FUENTE INMEDIATA:

35

(B) CLON: 538-46.26 (Uni´ on B) (ix) CARACTER´ISTICAS:

40

(A) NOMBRE/CLAVE: ex´ on ´ (B) LOCALIZACION: 88..102 ´ /inicio de los codones = 88 (D) OTRA INFORMACION:

45

/funci´ on = “comienzo de la traduci´ on de la prote´ına h´ıbrida” /producto = “p´eptido con N-terminal”

50

/n´ umero = 1 /nombre est´ andar = “Traducci´ on de la secuencia de DNA sint´etico” (ix) CARACTER´ISTICAS:

55

(A) NOMBRE/CLAVE: CDS ´ (B) LOCALIZACION: 103..108

60

´ ´ experimental (C) METODO DE IDENTIFICACION: ´ /parcial (C) OTRA INFORMACION:

32

ES 2 191 663 T3 /inicio de los codones = 103 /producto = “hemaglutinina-Neuraminidasa de NDV” 5

/evidencia = EXPERIMENTAL /gen = “HN” /n´ umero = 2

10

´ DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 32: (xi) DESCRIPCION

15

20

´ SOBRE LA SEQ ID NO: 33: (2) INFORMACION (i) CARACTER´ISTICAS DE LA SECUENCIA:

25

(A) LONGITUD: 2 amino´ acidos (B) TIPO: amino´ acido (D) TOPOLOG´IA: lineal

30

´ (ii) TIPO DE MOLECULA: prote´ına ´ DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 33: (xi) DESCRIPCION

35

40

´ SOBRE LA SEQ ID NO: 34: (2) INFORMACION (i) CARACTER´ISTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 108 pares de bases

45

(B) TIPO: ´acido nucleico (C) TIPO DE CADENA: doble

50

(D) TOPOLOG´IA: circular ´ (ii) TIPO DE MOLECULA: DNA (gen´ omico) ´ (iii) HIPOTETICO: NO

55

(iv) ANTISENTIDO: NO (vi) FUENTE ORIGINAL:

60

(A) ORGANISMO: pl´ asmido (vii) FUENTE INMEDIATA:

33

ES 2 191 663 T3 (B) CLON: 538-46.26 (Uni´ on C) (ix) CARACTER´ISTICAS: 5

(A) NOMBRE/CLAVE: CDS ´ (B) LOCALIZACION: 70..84 ´ /inicio de los codones = 88 (D) OTRA INFORMACION:

10

/funci´ on = “comienzo de la traduci´ on de la prote´ına h´ıbrida” /producto = “p´eptido con N-terminal” 15

/n´ umero = 1 /nombre est´ andar = “Traducci´ on de la secuencia de DNA sint´etico” (ix) CARACTER´ISTICAS:

20

(A) NOMBRE/CLAVE: CDS ´ (B) LOCALIZACION: 85..108 25

´ ´ experimental (C) METODO DE IDENTIFICACION: ´ /parcial (D) OTRA INFORMACION: /inicio de los codones = 85

30

/funci´ on = “enzima marcadora” /producto = “Beta-Galactosidasa” 35

/evidencia = EXPERIMENTAL /gen = “lacz” /n´ umero = 2

40

/cita = ([1]) ´ SOBRE LA PUBLICACION: ´ (x) INFORMACION 45

(A) AUTORES: Ferrari, Franco A Trach, Kathleen Hoch, James A

50

(B) T´ITULO: Sequence Analysis of the spoOB Locus Revels a Polycistronic Transcription Unit (C) REVISTA: J. Bacteriol.

55

(D) VOLUMEN: 161 ´ (E) EDICION: 2 ´ (F) PAGINAS: 556-562

60

(G) FECHA: Febrero, 1985

34

ES 2 191 663 T3 ´ DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 34: (xi) DESCRIPCION

5

10

´ SOBRE LA SEQ ID NO: 35: (2) INFORMACION (i) CARACTER´ISTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 5 amino´ acidos

15

(B) TIPO: amino´ acido (D) TOPOLOG´IA: lineal 20

´ (ii) TIPO DE MOLECULA: prote´ına ´ DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 35: (xi) DESCRIPCION

25

´ SOBRE LA SEQ ID NO: 36: (2) INFORMACION 30

(i) CARACTER´ISTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 8 amino´ acidos

35

(B) TIPO: amino´ acido (D) TOPOLOG´IA: lineal ´ (ii) TIPO DE MOLECULA: prote´ına

40

´ DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 36: (xi) DESCRIPCION

45

´ SOBRE LA SEQ ID NO: 37: (2) INFORMACION 50

(i) CARACTER´ISTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 108 pares de bases (B) TIPO: ´acido nucleico

55

(C) TIPO DE CADENA: doble (D) TOPOLOG´IA: circular

60

´ (ii) TIPO DE MOLECULA: DNA (gen´ omico) ´ (iii) HIPOTETICO: NO

35

ES 2 191 663 T3 (iv) ANTISENTIDO: NO (vi) FUENTE ORIGINAL: 5

(A) ORGANISMO: pl´ asmido (vii) FUENTE INMEDIATA: (B) CLON: 538-46.26

10

(ix) CARACTER´ISTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS

15

´ (B) LOCALIZACION: 1..54 ´ ´ experimental (C) METODO DE IDENTIFICACION: ´ /parcial (D) OTRA INFORMACION:

20

/inicio de los codones = 1 /funci´ on = “enzima marcadora” 25

/producto = “Beta-Galactosidasa” /evidencia = EXPERIMENTAL /gen = “lacz”

30

/n´ umero = 1 /cita = ([1]) 35

(ix) CARACTER´ISTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS ´ (B) LOCALIZACION: 55..63

40

´ ´ experimental (C) METODO DE IDENTIFICACION: ´ /inicio de los codones = 55 (D) OTRA INFORMACION:

45

/funci´ on = “final de la traduci´ on de la prote´ına h´ıbrida” /producto = “p´eptido con C-terminal” /evidencia = EXPERIMENTAL

50

/n´ umero = 2 /nombre est´ andar = “Traducci´ on de la secuencia de DNA sint´etico” 55

´ DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 37: (xi) DESCRIPCION

60

36

ES 2 191 663 T3

5

10

´ SOBRE LA SEQ ID NO: 38: (2) INFORMACION 15

(i) CARACTER´ISTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 18 amino´ acidos (B) TIPO: amino´ acido

20

(D) TOPOLOG´IA: lineal ´ (ii) TIPO DE MOLECULA: prote´ına

25

´ DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 38: (xi) DESCRIPCION

30

35

´ SOBRE LA SEQ ID NO: 39: (2) INFORMACION (i) CARACTER´ISTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 2 amino´ acidos

40

(B) TIPO: amino´ acido (D) TOPOLOG´IA: lineal

45

´ (ii) TIPO DE MOLECULA: prote´ına ´ DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 39: (xi) DESCRIPCION

50

´ SOBRE LA SEQ ID NO: 40: (2) INFORMACION 55

(i) CARACTER´ISTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 57 pares de bases

60

(B) TIPO: ´acido nucleico (C) TIPO DE CADENA: doble

37

ES 2 191 663 T3 (D) TOPOLOG´IA: circular ´ (ii) TIPO DE MOLECULA: DNA (gen´ omico) 5

´ (iii) HIPOTETICO: NO (iv) ANTISENTIDO: NO (vi) FUENTE ORIGINAL:

10

(A) ORGANISMO: pl´ asmido (vii) FUENTE INMEDIATA: 15

(B) CLON: 538-46.26 (Uni´ on E) ´ DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 40: (xi) DESCRIPCION

20

´ SOBRE LA SEQ ID NO: 41: (2) INFORMACION 25

(i) CARACTER´ISTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 27 pares de bases (B) TIPO: ´acido nucleico

30

(C) TIPO DE CADENA: doble (D) TOPOLOG´IA: lineal 35

´ (ii) TIPO DE MOLECULA: DNA (gen´ omico) ´ (iii) HIPOTETICO: N (iv) ANTISENTIDO: N

40

(vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: virus de la pseudorrabia\cebador nucleot´ıdico sint´etico 45

´ DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 41: (xi) DESCRIPCION

50

´ SOBRE LA SEQ ID NO: 42: (2) INFORMACION (i) CARACTER´ISTICAS DE LA SECUENCIA: 55

(A) LONGITUD: 19 pares de bases (B) TIPO: ´acido nucleico

60

(C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOG´IA: lineal

38

ES 2 191 663 T3 ´ (ii) TIPO DE MOLECULA: DNA (gen´ omico) ´ (iii) HIPOTETICO: N 5

(iv) ANTISENTIDO: N (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: virus de la pseudorrabia\cebador nucleot´ıdico sint´etico

10

´ DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 42: (xi) DESCRIPCION

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

39