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˜ OFICINA ESPANOLA DE PATENTES Y MARCAS

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k ES 2 059 370 kInt. Cl. : C12N 15/86

11 N.◦ de publicaci´ on: 5

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˜ ESPANA

C12N 7/00 A61K 39/245 C07K 15/00

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TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA

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kN´umero de solicitud europea: 87303512.5 kFecha de presentaci´on : 22.04.87 kN´umero de publicaci´on de la solicitud: 0 243 155 kFecha de publicaci´on de la solicitud: 28.10.87

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54 T´ıtulo: Un virus herpes simplex recombinante, vacunas y m´ etodos.

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73 Titular/es: Arch Development Corporation

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72 Inventor/es: Roizman, Bernard

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74 Agente: Ungr´ıa Goiburu, Bernardo

30 Prioridad: 25.04.86 US 856052

1101 East 58th Street Chicago, Illinois 60637, US

45 Fecha de la publicaci´ on de la menci´on BOPI:

16.11.94

45 Fecha de la publicaci´ on del folleto de patente:

16.11.94

Aviso:

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En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicaci´on en el Bolet´ın europeo de patentes, de la menci´on de concesi´on de la patente europea, cualquier persona podr´a oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposici´on deber´a formularse por escrito y estar motivada; s´olo se considerar´a como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposici´ on (art◦ 99.1 del Convenio sobre concesi´on de Patentes Europeas). Venta de fasc´ ıculos: Oficina Espa˜ nola de Patentes y Marcas. C/Panam´ a, 1 – 28036 Madrid

ES 2 059 370 T3 DESCRIPCION

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Algunos virus y pl´ asmidos identificados aqu´ı por su n´ umero de acceso han sido depositados en la Colecci´on Americana de Cultivos Tipo, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 U.S.A. conforme a las condiciones del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Dep´ osito de Microorganismos para los Fines del Procedimiento de Patentes. Esta invenci´on se refiere a cepas de virus recombinantes, vacunas v´ıricas vivas, m´etodos de fabricaci´ on de las cepas y vacunas y m´etodos de inmunizaci´ on de un hu´esped contra virus. M´ as concretamente, esta invenci´on se refiere a cepas de virus herpes recombinantes, m´etodos de fabricaci´ on de las cepas recombinantes y vacunas y m´etodos de inmunizaci´ on de un hu´esped humano contra virus herpes simplex tipos I y II (designados VHS-1 y VHS-2, respectivamente) utilizando las vacunas. Ambos serotipos distinguibles de virus herpes simplex (VHS-1 y VHS-2) causan infecci´ on y enfermedad desde simples ampollas en los labios que cursan con fiebre relativamente baja hasta infecciones genitales serias e infecciones generalizadas de reci´en nacidos. El herpes simplex ha sido reconocido crecientemente como un agente etiol´ogico en la encefalitis humana. Hace tiempo que se busca una vacuna de virus vivos no transformantes, que pueda o no establecer infecciones latentes y que sea eficaz contra ambos tipos de virus herpes simplex. En principio, los virus hacen que las c´elulas infectadas produzcan prote´ınas espec´ıficas. Estas interaccionan entre s´ı y con prote´ınas celulares, ADN o ARN originando la producci´on de la progenie v´ırica, destruyendo la c´elula infectada y extendiendo la infecci´ on a c´elulas previamente no infectadas. Algunas de estas prote´ınas tambi´en estimulan la respuesta inmune del hu´esped. VHS-1 y VHS-2 est´ an relacionados inmunol´ ogicamente, pero la mayor parte de sus prote´ınas llevan caracter´ısticas que los distinguen y permiten su diferenciaci´on. V´ease Morse y col., “Anatomy of Herpes Simplex Virus (HSV) DNA:X. Mapping of Viral Genes by Analysis of Polypeptides and Functions Specified by HSV-1 x HSV-2 Recomags. 389-410 (mayo 1978), cuya descripci´on se incorpora aqu´ı como binants”, J. Virol., vol. 26, n◦ 2, p´ referencia. Se sabe a partir de la formaci´ on de progenie recombinante que prote´ınas de VHS-1 pueden interaccionar con prote´ınas de VHS-2 para formar progenie infecciosa. Tambi´en se sabe que la inmunidad a la infecci´on por VHS est´ a determinada por la respuesta del hu´esped a varias prote´ınas.

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Una cepa de virus u ´ til en una vacuna contra VHS-1 y VHS-2 tendr´ a que ser no virulenta, estable (es decir, no revertir al estado virulento), proporcionar inmunidad demostrada a provocaciones masivas de cepas de tipo nativo de ambos VHS-1 y VHS-2, tener baja patog´enesis y no habr´ an de ser capaces de transformar c´elulas hu´esped. En algunos casos, puede ser deseable que el virus de la vacuna desaparezca despu´es de la inmunizaci´ on de un hu´esped, pero en otros casos puede ser deseable que el virus permanezca en una forma latente en el hu´esped. Hasta ahora, no se ha conocido ninguna vacuna eficaz contra ambos tipos de virus herpes simplex que presenten las caracter´ısticas deseables indicadas anteriormente.

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Un objeto de la invenci´on es proporcionar cepas de virus recombinantes vivos y vacunas que incorporan dichas cepas, eficaces contra VHS-1 y VHS-2 (de tipo nativo) virulentos, productores de enfermedad, m´etodos para producir las vacunas y m´etodos para inmunizar un hu´esped humano utilizando las vacunas. Seg´ un la presente invenci´ on, se proporciona un virus herpes simplex (VHS) recombinante, caracterizado porque el genoma del virus comprende un mutante del genoma de VHS-1 en donde est´ a suprimida la porci´ on de dicho genoma de VHS-1 que es responsable de la neurovirulencia aunque no esencial para el crecimiento y que est´a localizado en o cerca de las secuencias repetidas invertidas internas de dicho genoma de VHS-1 y en donde, entre los puntos de dicha supresi´ on de dicho genoma mutante, est´ a insertada una porci´ on del genoma de VHS-2 que es responsable de la codificaci´ on de una o m´ as glicoprote´ınas inductoras de inmunidad. La invenci´on tambi´en incluye un m´etodo para preparar un virus herpes simplex (VHS) recombinante, caracterizado porque comprende las etapas de:

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(a) suprimir del genoma del VHS-1 de origen la porci´ on de dicho genoma que es responsable de neurovirulencia aunque no es esencial para el crecimiento y que est´ a localizada en o cerca de las secuencias repetidas invertidas internas de dicho genoma de dicho VHS-1 para proporcionar un primer genoma mu2

ES 2 059 370 T3 tante;

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(b) insertar en dicho primer genoma mutante entre los puntos finales de dicha supresi´on de la etapa (a) una porci´ on del genoma de VHS-2 que es responsable de la codificaci´ on de una o m´ as glicoprote´ınas inductoras de inmunidad de dicho VHS-2 para proporcionar un segundo genoma mutante; (c) cotransfectar dicho segundo genoma mutante con el genoma de dicho VHS-1 de origen en condiciones que permitan la recombinaci´on en sitios de homolog´ıa de las secuencias de ADN para producir una progenie recombinante;

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(d) seleccionar un genoma recombinante que carece de la porci´on suprimida en la etapa (a); y (e) determinar en dicho genoma seleccionado la presencia de dicho gen codificante de glicoprote´ına insertado en la etapa (b). 15

Las realizaciones de la invenci´on se describir´ an de forma m´ as particular a t´ıtulo de ejemplo y con referencia a los dibujos adjuntos, en que:

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la Figura 1 es una representaci´ on esquem´atica de la construcci´ on de pl´ asmidos pRB3410, pRB3498 y pRB3575 utilizados para construir las cepas de virus recombinantes ilustrativas de la invenci´ on. La l´ınea superior representa la ordenaci´ on de la secuencia de ADN de VHS-1. Las cajas representan secuencias de repetici´ on invertidas ab, b’a’a’c’ y ca. VHS-2 tiene una estructura similar;

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la Figura 2 es una serie de representaciones esquem´aticas que demuestran las etapas en la construcci´ on de las cepas de virus recombinantes ilustrativas R7017 y R7020 de la invenci´on;

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la Figura 3 es una serie de representaciones esquem´aticas que ilustran las ordenaciones de las secuencias de las cepas virales recombinantes R7017 y R7020 de la Figura 2. La interrupci´on en el fragmento N de EcoRI pretende indicar el sitio de la supresi´on en el gen de timidina-quinasa. Las nuevas bandas en el nexo de uni´ on novedoso entre los componentes L y S se designan Bandas 1 y 2, respectivamente;

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la Figura 4A es una fotomicrograf´ıa de mapas de endonucleasas de restricci´ on EcoRI de los respectivos genomas de un virus VHS-1 de tipo nativo, cepas de virus recombinantes R7017 y R7020 de las Figuras 2 y 3, y pl´ asmido pRB3498. La Figura 4B es una representaci´on a pluma y tinta de las bandas de la Figura 4A; las Figuras 5 y 6 son representaciones gr´ aficas que representan la virulencia en ratones de cepas recombinantes R7017 y R7020, respectivamente, a varias dosificaciones, como se describe en detalle en el Ejemplo 2;

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las Figuras 7 y 8 son representaciones gr´ aficas que muestran la protecci´ on en ratones contra la provocaci´on por VHS conferida por inoculaci´ on con virus recombinante R7017, a diversas dosis protectoras, como se describe detalladamente en el Ejemplo 3; 45

las Figuras 9 y 10 son representaciones gr´aficas que muestran la protecci´ on en ratones contra la provocaci´on por VHS conferida por inoculaci´ on con virus recombinante R7020, a diversas dosis, como se describe detalladamente en el Ejemplo 3;

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las Figuras 11 y 12 son representaciones gr´aficas de la protecci´on en ratones contra la provocaci´ on por VHS conferida por inoculaci´ on con VHS-1(F), a diversas dosis, como se describe en el Ejemplo 3.

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En las Figuras, se aplican las abreviaturas siguientes: E-EcoRI; P-PvuII; H-HindIII; X-XbaI; BBamHI; Bg-BglII; y S-SacI, para sitios para endonucleasas de restricci´ on. TK-timidina quinasa; gG2HSV-2, para gen de la glicoprote´ına G; gD2-HSV-2, para gen de la glicoprote´ına D. Las h´elices indican secuencias de vectores. El s´ımbolo “v” representa la posici´on del poli-ligante.

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A continuaci´ on se describe la preparaci´ on de dos virus recombinantes ilustrativos que comprenden genomas de virus herpes simplex tipo 1 (VHS-1) portadores de genes de virus de herpes simplex tipo 2 (VHS-2). Estos recombinantes, designados aqu´ı como R7017 (ATCC VR2121) y R7020 (ATCC VR2123), est´an dise˜ nados para cumplir los requisitos de cepas adecuadas para inmunizaci´ on contra VHS-1 y VHS-2, y tambi´en se pueden utilizar como vectores de genes for´aneos. Los recombinantes ilustrativos, como est´an construidos, no contienen otros genes for´ aneos aparte de los genes de VHS-2. 3

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La estructura de ADN de VHS est´a descrita en la bibliograf´ıa. V´ease Wadsworth y col., J. Virol., ags. 1487-1497 (1979); Hayward y col. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, vol. 72, n◦ 11 vol. 15, n◦ 6, p´ ags. 389-410 (1978). Los genomas de a 4243-4247 (1975); y Morse y col. J. Virol., vol. 26, n◦ 2, p´ VHS-1 y VHS-2 comprenden en cada caso dos componentes unidos covalentemente, designados L y S. Cada componente comprende secuencias u ´ nicas (U1 para el componente L, Us para el componente S) flanqueadas por repeticiones invertidas. Las repeticiones invertidas de los componentes L se designan ab y b’a’. Las repeticiones invertidas de los componentes S se designan a’c’ y ca. Una propiedad adicional de ambos ADN de VHS-1 y VHS-2 es que los componentes L y S est´an invertidos uno respecto del otro, de modo que dan cuatro is´ omeros que difieren u ´ nicamente en su orientaci´on relativa de los 2 componentes (v´ease Wadsworth y col., 1975; y Hayward y col., 1975, ambas referencias citadas anteriormente). Estos cuatro is´omeros han sido designados como “prototipo” (P); “inversi´ on de componente S” (Is ); “inversi´ on de componente L”(IL); e “inversi´on de ambos componentes L y S” (ISL ).

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Como describen Centifanto-Fitzgerald y col., J. Exp. Med. vol. 155, p´ ags. 475-489 (1982), se ha establecido que el extremo de la derecha del componente L del ADN de VHS contiene genes cuya mutaci´ on conduce a p´erdida de neurovirulencia as´ı como a la aptitud de causar lesiones en la c´ ornea. Estos genes han sido mapeados aproximadamente entre 0,70 y 0,83, pero su localizaci´ on exacta no era conocida previamente. Estudios realizados por Poffenberger y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 80, p´ ags. 2690-2694 (1983) y por Poffenberger y Roizman, J. Virol., vol. 53, p´ ags. 587-595 (1985) han establecido que las repeticiones invertidas internas (b’a’a’c’) no son esenciales para el crecimiento de VHS-1 en cultivo de c´elulas. Espec´ıficamente, se construy´o un virus VHS-1 recombinante (designado I358, ATTC VR2122) en el que una porci´ on de las secuencias u ´ nicas en el extremo derecho del componente L as´ı como la mayor parte de las repeticiones invertidas en la uni´on entre los componentes L y S en la ordenaci´ on del prototipo se sustituyeron por una secuencia peque˜ na de ADN derivada del fragmento HindIII O, situado normalmente en el extremo izquierdo del componente L, y el gen de timidina-quinasa (TK). La supresi´on de aproximadamente 13 Kpb de ADN de VHS-1 de las repeticiones invertidas de los componentes L y S en I358 sugirieron que este virus, o un derivado de este virus, podr´ıa servir potencialmente como vector de ADN de VHS o ADN for´ aneo con tal que se pudieran insertar secuencias adicionales de ADN sin afectar al paquete del genoma. El recombinante I358 por s´ı mismo no es adecuado como vector principalmente debido a la duplicaci´on de las secuencias HindIII O. Como las secuencias HindIII O en el nuevo nexo de uni´on entre los componentes L y S son repeticiones directas de las secuencias contenidas en el fragmento HindIII O en sus posiciones naturales, las secuencias entre las repeticiones HindIII O se suprimen espont´ aneamente y se acumulan genomas defectuosos en c´elulas y cultivo infectados. Los genomas defectuosos podr´ıan interferir potencialmente con genomas est´andar e impedir el crecimiento o´ptimo del virus. Incluso si se reconstituyera el genoma I358 eliminando las secuencias HindIII O duplicadas en la nueva uni´ on de los componentes L-S, no estar´ıa claro que los genes responsables de la neurovirulencia del virus fueran suprimidos. Incluso si se suprimen, los virus como tales ser´ıan adecuados para inmunizaci´ on contra VHS-1 s´ olo y no contra VHS-2. Para proteger contra VHS-2 ser´ıa necesario duplicar al menos alguno de los genes de ese virus codificantes de glicoprote´ına. La respuesta inmune principal frente a VHS-2 y VHS-1 est´ a dirigida contra las prote´ınas de la superficie del virus. Las prote´ınas de la superficie del virus son glicoprote´ınas virales insertadas en la envoltura viri´ onica y en el interior de la membrana plasm´ atica de las c´elulas infectadas. Actualmente se conocen al menos 6 glicoprote´ınas virales que son especificadas por VHS-1 y VHS-2. Estas son glicoprote´ınas B, C y H mapeadas en el componente L y glicoprote´ınas D, E y G mapeadas en el componente S. De estos genes de glicoprote´ınas, aquellos que activan los anticuerpos neutralizantes y presumiblemente aquellos que inducen inmunidad son la glicoprote´ına D mapeada en el componente S y en menor grado las glicoprote´ınas B y C mapeadas en el componente L. Diversos estudios han sugerido que el anticuerpo neutralizante m´as fuerte es activado por glicoprote´ına D. Esta glicoprote´ına, incluso por s´ı misma, induce alguna protecci´ on en sistemas de animales experimentales. Las glicoprote´ınas G, D y E est´ an cerca unas de otras en el mapa del componente S de ADN de VHS. Para que un virus recombinante confiriera protecci´ on contra ambos VHS-1 y VHS-2, se insert´o un fragmento de ADN de VHS-2 portador de los genes de las glicoprote´ınas D y G en un virus recombinante de acuerdo con la invenci´ on. Este recombinante se construy´ o a partir de recombinante I358 por elimi4

ES 2 059 370 T3 naci´on de las secuencias exclusivas del componente L, el gen TK y las secuencias HindIII O del genoma de I358.

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Una propiedad deseable de las vacunas potenciales contra VHS es que no contengan dominios transformamtes. Los dominios transformantes se definen como aquellos que confieren a las c´elulas receptoras la capacidad de ser transformadas morfol´ ogicamente y de establecer tumores al trasplantarlas en animales experimentales. Todas las regiones transformantes en el genoma de VHS-2 est´an mapeadas en el componente L de ADN de VHS-2. Las correspondientes secuencias del genoma de VHS-1 no inmortalizan o confieren propiedades transformantes malignas a las c´elulas. El fragmento de ADN que lleva los genes que codifican las glicoprote´ınas D y G no contienen secuencias conocidas capaces de transformar c´elulas en cultivo. Existe mucha bibliograf´ıa acerca de que los virus TK− (es decir, virus que carecen de un gen TK) tienen una capacidad reducida de establecer infecciones latentes en animales experimentales. El virus de origen de I358 (designado ∆305, descrito en Poffenberger y col. (1983), y Poffenberger y Roizman (1985), citados antes) no establecen latencia en animales experimentales, as´ı que es razonable esperar que los derivados de I358 que carecen del gen TK tambi´en fracasar´ıan en el establecimiento de latencia. Sin embargo, la cuesti´ on que exist´ıa antes de la invenci´ on era si los virus TK− , aunque con capacidad reducida para establecer latencia, conferir´ıan protecci´ on. Por lo tanto, se han construido los recombinantes R7017 (ATCC VR2121) y R7020 (ATCC VR2123) de acuerdo con la invenci´ on. Ambos genomas virales contienen una supresi´ on de aproximadamente 500 pb dentro del dominio del gen TK entre los sitios BglII y SacI, ambos inclusive. Sin embargo, en el caso de R7020, se insert´ o un gen TK, no en su posici´on natural sino en una nueva uni´ on entre los componentes L y S. La raz´ on de esto fue evitar la posibilidad de que la restauraci´on del gen TK en su sitio natural pudiera incrementar la virulencia del recombinante. Los resultados de los ensayos demuestran que ambos recombinantes son capaces de conferir protecci´ on contra la provocaci´ on por virus de tipo nativo y estaban atenuados con respecto a neurovirulencia en ratones. Si se desea, se puede insertar un gen for´ aneo (distinto y adem´ as del gen codificante de glicoprote´ına de VHS-2) en el genoma recombinante y expresar de acuerdo con el procedimiento descrito en el documento EP-A-0176170. Procedimiento para construir virus recombinantes

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Seg´ un la invenci´ on, se han preparado virus herpes simplex recombinantes, en cada caso con un genoma que es un mutante del genoma VHS-1, y que son eficaces como vacunas contra ambos VHS-1 y VHS-2 virulentos, y que tambi´en pueden actuar como vectores de genes for´ aneos. 40

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En el genoma recombinante, est´a suprimida la parte del mismo que es responsable de la falta de virulencia pero no es esencial para el crecimiento y que est´ a situada en o cerca de las secuencias repetidas invertidas internas del genoma de VHS-1 en la ordenaci´ on del prototipo. Concretamente, se ha encontrado que la supresi´ on en el genoma de VHS-1 de todas las secuencias entre el extremo derecho del gen α27 y la regi´ on promotora del gen α4 es suficiente para atenuar el genoma sin inhibir su capacidad para propagarse, mientras que proporciona espacio suficiente para la inserci´on de material gen´etico sin afectar al paquete del genoma. Despu´es de la supresi´ on identificada antes, entre los puntos extremos de la supresi´ on del genoma mutante se inserta un gen del genoma de VHS-2 que es responsable de la codificaci´ on de una o m´ as glicoprote´ınas que inducen inmunidad (v.g., glicoprote´ınas B, C o D). Preferiblemente, se inserta el gen codificante de la glicoprote´ına D de VHS-2. Este gen puede estar asociado con todos o parte de los genes adyacentes que codifican las glicoprote´ınas G y E de VHS-2.

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Despu´es de las etapas anteriores de supresi´on e inserci´on, el genoma mutante resultante se cotransfecta con el genoma de VHS-1 de origen en condiciones que permiten recombinaci´on en sitios de homolog´ıa de las secuencias de ADN para producir progenie recombinante. Despu´es la progenie se somete a ensayo para seleccionar genomas recombinantes que carecen de la porci´ on suprimida del genoma de origen y los genomas seleccionados se someten a ensayo para determinar la presencia del gen codificante de la glicoprote´ına de VHS-2 insertado. En general, la porci´ on suprimida del genoma de VHS-1 (v.g., alrededor de 500 pares de bases entre los 5

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sitios BglII y SacI, ambos inclusive, del gen de timidina-quinasa) har´a al gen de timidina-quinasa incapaz de expresar una enzima funcional. En una forma del genoma recombinante, se inserta un gen de timidina quinasa en el genoma mutante en un sitio distinto a su sitio natural bajo la regulaci´ on de un promotor, tal como la regi´on promotora del gen α4 del genoma VHS-1. (El gen de timidina quinasa puede ser un genoma de uno cualquiera de VHS-1 o VHS-2). Las fusiones de promotores han sido descritas en la bibliograf´ıa. V´ease, por ejemplo, Post y col. Cell, vol. 24, p´ ags. 555-565 (1981). Los detalles de los procedimientos de laboratorio utilizados para preparar dos virus recombinantes ilustrativos (R7017 y R7020) de la invenci´ on se describen a continuaci´ on. En ambos casos la clonaci´on se llev´o a cabo utilizando procedimientos convencionales de laboratorio tales como los descritos detalladamente en Maniatis y col. Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1982). La solicitud de patente estadounidense n◦ de serie 302.497, presentada el 16 de Septiembre de 1981, a nombre de Roizman y Post, y su contraparte publicaci´ on de patente europea n◦ 74.808 (23 de marzo de 1983), cuyas descripciones respectivas se incorporan aqu´ı como referencia, describen un procedimiento para la inserci´ on, supresi´ on y sustituci´on de secuencias de ADN que tiene utilidad en la presente invenci´on.

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Los pl´ asmidos y las cepas de virus no identificados por el n´ umero de acceso ATCC (as´ı como algunos identificados por el n´ umero de acceso ATCC) no son cr´ıticos para el procedimiento descrito, pero fueron seleccionados por conveniencia, ya que los bancos de fragmentos de VHS son muy asequibles y bien coags. nocidos en la t´ecnica. V´ease, por ejemplo, Post y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 77, n◦ 7, p´ 4201-4205 (1980).

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Los virus de origen de tipo nativo utilizados aqu´ı fueron VHS-1 cepa F [VHS-1(F)] (ATCC VR733) y VHS-2 cepa G [VHS-2(G)] (ATCC VR 734). Los bancos de fragmentos fueron preparados a partir de los respectivos genomas de estos dos virus por t´ecnicas convencionales.

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El recombinante R7017 se construy´ o a partir del recombinante I358, identificado anteriormente. El objetivo fue eliminar del ADN de I358 todas las secuencias situadas entre el extremo del gen α27 y la regi´on promotora del gen α4. En el caso del virus de tipo nativo, esto incluye lo siguiente: (a) genes no identificados situados entre el gen α27 y el gen α0; (b) una copia del gen α0 situada en las repeticiones invertidas internas;

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on (c) una copia del gen γ134,5 situada entre el gen α0 y una o m´ as secuencias a que forman la uni´ natural entre los componentes L y S;

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(d) todas las secuencias a y una copia de las secuencias designadas como C’ y situadas entre la secuencia a y el extremo 3’ del gen α4; y (e) todas las secuencias codificantes del gen α4 y la copia de las secuencias no codificantes 5’ transcritas y del gen α4 situado en las repeticiones invertidas internas hasta el sitio de corte BamHI entre los fragmentos BamHI Y y BamHI N.

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En el caso de ADN de I358, algunas de estas secuencias ya estaban omitidas. Otras secuencias adicionales que se eliminaron son las siguientes:

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(a) un n´ umero no identificado de secuencias entre el extremo del gen α27 y el extremo derecho del gen α0; (b) una porci´ on del fragmento HindIII O reiterado en el genoma I358 y responsable de la generaci´ on de genomas defectuosos, como describen Poffenberger y Roizman (1985), cita ya mencionada; y

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(c) el gen TK situado en posici´ on adyacente a las secuencias del fragmento HindIII O. Con el fin de hacer las supresiones deseadas, se construy´ o un pl´ asmido designado pRB3410 (ATCC 53350). El pl´ asmido pRB3410 contiene un poli-ligante en el que se insert´o el gen α27 y el promotor del gen α4 para servir como secuencias flanqueantes para recombinaci´on. El poli-ligante tambi´en conten´ıa sitios convenientes para endonucleasas de restricci´on, para la inserci´ on de genes, entre las secuencias flanqueantes. En el caso de recombinante R7017, el fragmento HindIII L que contiene los genes codificantes de glicoprote´ınas D y G de VHS-2 se insert´ o en las secuencias del poli-ligante. 6

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El recombinante R7020 difiere del recombinante R7017 en que contiene las secuencias estructurales y las secuencias no codificantes 5’ transcritas del gen TK intercaladas entre el fragmento insertado HindIII L y el promotor α4. El gen TK es regulado por el promotor α. 5

Construcci´ on del recombinante R7017

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El pl´ asmido pRB3410 se construy´o en 2 etapas, como se muestra esquem´aticamente en la Figura 1. Primero, el fragmento BamHI-SacI de 2,4 Kpb de BamHI B contenido en el pl´asmido pRB404 se insert´o como un fragmento BamHI-EcoRI de pRB404 en el sitio HindIII del pl´ asmido pUC13 por tratamiento con polimerasa T4. [El pl´ asmido pRB404 es una fuente rutinaria conveniente del gen α27 intacto, y lleva el gen α27 en forma de un peque˜ no fragmento BamHI-SalI del fragmento BamHI B de VHS-1. Se prepar´ o por digesti´ on de BamHI con SalI, tratado con polimerasa y clonado en pRB1 (un derivado de pBR322, ATCC 31344) como un fragmento EcoRI (pRB1) es pBR322 con el sitio SalI eliminado por digesti´ on con nucleasa). El pl´ asmido pUC13 es bien conocido y es asequible en el mercado a partir de Pharmacia, Inc., Piscataway, New Jersey, U.S.A.] Despu´es, el fragmento EcoRI-PvuII de 1,8 Kpb del fragmento BamHI N de VHS-1 (F) contenido en el pl´ asmido pRB403 (ATCC 39719) se insert´o en el sitio EcoRI de pUC13, tambi´en despu´es del tratamiento con polimerasa T4. (El pl´asmido pRB403 lleva el extremo izquierdo de BamHI clonado como fragmento BamHI-PvuII en pBR322. Esta es una fuente conveniente del promotor del gen α4 ya que es m´as peque˜ no que el fragmento BamHI N entero). El fragmento BamHI-SacI de 2,4 KB contiene el gen α27 entero incluyendo su propio promotor mientras que el fragmento EcoRI-PvuII contiene s´olo el promotor para el gen α4. V´ease Post y col. (1981), citado anteriormente, y Kristie y col. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 81, p´ ags. 4065-4069 (1984). En el genoma de tipo nativo, los dos fragmentos est´ an separados por aproximadamente 8 KB de BamHI B y los fragmentos enteros BamHI S, BamHI P y BamHI Y dentro de las repeticiones invertidas internas del componente S. El pl´ asmido pRB3410 se construy´o de modo que conten´ıa un poli-ligante con sitios de corte para endonucleasas de restricci´on u ´ nicos entre el gen α27 y el promotor α4 de modo que se pod´ıan insertar secuencias adicionales de ADN en sitios y situarlas dentro del genoma viral de I358 utilizando la homolog´ıa flanqueante proporcionada por el gen α27 y el promotor α4. En el sitio XbaI del poli-ligante en pRB3410 se insert´ o el fragmento HindIII L de 9,5 Kpb de HSV-2(G) despu´es del tratamiento con polimerasa. Este fragmento fue purificado en agarosa despu´es de la electroforesis del producto de digesti´on con HindIII del pl´ asmido pRB804 que conten´ıa el fragmento HindIII L de VHS-2(G) clonado en el sitio HindIII del pl´ asmido pACYC177 (ATCC 37031). [El pl´ asmido pRB804 es un clon del fragmento HindIII L de VHS-2 clonado en el sitio HindIII de pACYC177. Contiene las regiones codificantes intactas de gG, gD y una porci´ on de la secuencia codificante de gE de VHS-2. El pl´asmido pACYC177 es f´ acilmente asequible y se puede utilizar en vez del pl´asmido pBR322, si se desea. V´ease Chang y col., J. Bacteriol. vol. 134, p´ ag. 1141 (1978)]. Los fragmentos de pRB403 y pRB404 proporcionaron secuencias hom´ ologas flanqueantes para los diversos episodios de recombinaci´ on que siguen. El pl´asmido recombinante resultante pRB3498 (ATCC 53348) se cotransfect´ o con ADN de I358 intacto en c´elulas de piel de conejo (v´ease la Figura 2). La progenie de la transfecci´on se cultiv´o en placas sobre c´elulas 143TK− en presencia de medio que conten´ıa una mezcla de 199-V suplementado con suero bovino fetal al 3% y bromouracildesoxirrib´ osido (BUdR). La progenie de I358 fue destruida por BUdR ya que el o virus es TK+ . El virus recombinante TK− (designado R7017) que creci´o en presencia de BUdR se purific´ en placa y se ensay´o por an´ alisis con endonucleasas de restricci´on para confirmar la estructura predicha (Figuras 3 y 4) y por los inmunoensayos superficiales potenciados con biotina-avidina (Kousoulas y col., Virology, vol. 135, p´ ags. 379-395, 1984) con anticuerpo monoclonal H966 espec´ıfico para VHS-2(G) frente a glicoprote´ına G (Roizman y col., Virology, vol. 133, p´ ags. 242-247, 1984) para determinar la presencia del gen de la glicoprote´ına G de VHS-2(G). V´ease la Tabla 1, m´as adelante. El virus recombinante R7017 corresponde a un virus recombinante R3410 (ATCC VR2124) pero que contiene el fragmento HindIII L de VHS-2. El virus R3410 podr´ıa ser preparado por cotransfecci´ on de I358 con pl´ asmido pRB3410 o, alternativamente, I358 puede ser cotransfectado con pRB3410 que contiene el fragmento HindIII L de VHS-2 insertado para dar un derivado de R3410 recombinante que contiene adicionalmente el fragmento VHS-2 L. Este u ´ltimo virus recombinante se designa R7017. Construcci´ on de recombinante R7020 El fragmento SacI-HindIII de 1,8 Kpb del fragmento HindIII L de VHS-2(G) m´ as pr´ oximo al promotor 7

ES 2 059 370 T3

5

α4 en el genoma viral de R7017 se clon´o como un fragmento SacI a partir de pRB3498 en el sitio SacI del pl´ asmido pUC18 (ATCC 37353). (pUC18 es asequible en el mercado a partir de Pharmacia, Inc. Piscataway, New Jersey, EEUU). Se cort´ o un gen TK regulado por α4 como un fragmento PvuII del pl´ asmido pRB316 (Post y col., 1981, citado anteriormente) y se clon´o en el sitio HindIII del pl´ asmido pRB3498 utilizando polimerasa T4 para dar el pl´asmido pRB3575 (ATCC 53349) (Figura 1). (El pl´asmido pRB316 es una fuente conveniente de gen TK α-regulado. Este pl´ asmido lleva BamHI N de VHS-1 fusionado al fragmento BamHI-BglII m´as grande de BamHI Q clonado en pBR322. En esta fusi´ on, el promotor del gen α4 est´a fusionado a las secuencias codificantes y no codificantes 5’ transcritas del gen TK de modo que el gen quim´erico resultante est´ a regulado como un gen α en vez de β.)

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El pl´asmido pRB3575 se construy´o de modo que hubiera m´ ultiples sitios de clonaci´on para la inserci´ on de secuencias adicionales entre las regiones de homolog´ıa flanqueante con el genoma viral de R7017. El pl´ asmido recombinante pRB3575 se cotransfect´o con ADN viral de R7017 y el recombinante R7020 TK+ resultante se aisl´o en base a su capacidad de propagarse en c´elulas 143TK− en presencia de medio HAT (v´eanse las Figuras 2 y 3). El recombinante se verific´ o por an´ alisis de restricci´on de ADN, utilizando EcoRI (Figuras 3 y 4) y la placa se purific´ o cuatro veces. Los recombinantes R7017 y R7020 se ensayaron con diversos anticuerpos monoclonales como se muestra en la Tabla 1. Tabla 1

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Reactividad de virus con anticuerpos monoclonales 25

Anticuerpo

VHS-1 (F)

VHS-2 (G)

R7017

R7020

Glicoprote´ına

30

600 H966 H1301 H1379 H1380

+ + + +

+ + -

+ + + + +

+ + + + +

gE-1 gC-2 gE-1,2 gC-1 gD-1

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40

45

Los siguientes ejemplos espec´ıficos se dan con el fin de demostrar la capacidad de infecci´ on, la capacidad de establecer latencia, la inmunog´enesis y la falta de virulencia de los dos virus recombinantes de la invenci´on. Otro ejemplo demuestra la virulencia comparativa de uno de los virus recombinantes ilustrativos antes y despu´es de pasos en serie en cerebro de rat´on. Ejemplo 1 - Capacidad de infeccion de los virus R7017 y R7020 por ruta ocular en ratones

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Ratones Balb/c/Cenlco de seis semanas de edad (IFFA-Credo, Les Oncisns, Francia) fueron inoculados en ambos ojos con virus R7017 o R7020 bajo anestesia con pentobarbitona. La c´ ornea fue escarificada con 10 golpes ligeros con una aguja hipod´ermica y ba˜ nada con 10 µl de suspensi´ on de virus. Se cerraron los p´ arpados y masajearon suavemente. Dos horas m´as tarde, los ratones fueron anestesiados de nuevo y se lavaron los ojos con 50 µl de una soluci´on de inmunoglobulinas patr´ on humanas al 16% (Instituto Merieux, Lyon, Francia) diluidas 1/10 en soluci´ on salina fisiol´ ogica. La soluci´on de inmunoglobulina se verti´ o y aspir´ o del ojo cinco veces. El fluido en exceso de descart´ o quedando aproximadamente 10 µl en el ojo. El fin de la soluci´ on de inmunoglobulina era neutralizar el virus que no penetraba en la c´ornea. Se recogieron muestras para ensayo del virus los d´ıas 1, 2, 3, 4 y 7, inmediatamente despu´es de desangramiento de los ratones bajo anestesia. Se tom´ o muestra de la pel´ıculalacrimosa lavando el ojo con 8

ES 2 059 370 T3 soluci´on tamp´ on fosfato suplementada con glucosa y suero bovino inactivado (PBS Glu SVI). Aproximadamente 50 µl de vertieron y aspiraron del ojo cinco veces y se transfirieron en 1 ml de PBS Glu SVI. Se extirparon as´epticamente los ganglios trigeminales despu´es de disecci´on apropiada y se transfirieron en 1 ml de PBS GLu SVI, se homogeneizaron y se sometieron a tres ciclos de congelaci´ on y descongelaci´on. 5

Todas las muestras se mantuvieron en ba˜ no de hielo y se trataron dentro de una hora despu´es del sacrificio de los ratones.

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Se cultivaron en placa 0,5 ml de la diluci´on de pel´ıcula lacrimosa o de la suspensi´on de tejido gangli´ onico sobre 25 cm2 de capa de c´elulas Vero y se dejaron absorber durante una hora a 37◦ C en un sacudidor rotatorio. Se descart´ o el in´ oculo y la capa de c´elulas se aliment´o con 5 ml de medio 199 suplementado con 1% de suero bovino y una mezcla de polimixina y nistatina.

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Los cultivos fueron examinados diariamente para valorar el efecto citop´ atico t´ıpico sobre VHS durante 7 d´ıas. En los cultivos positivos, se estim´o y puntu´ o el n´ umero de focos citop´aticos los dos primeros d´ıas de desarrollo de las placas. Los resultados se muestran en las Tablas 2 y 3, siguientes.

20

Tabla 2 Capacidad de infecci´ on de virus R7017 y R7020 por ruta ocular en ratones(c)

25

R7017(a)106,3 ufp/ojo)

R7020(b)(107,2 ufp/ojo)

D´ıa 30

1 2 3 4 7

35

Pel´ıcula lacrimosa

Ganglios trigeminales

Pel´ıcula lacrimosa

Ganglios trigeminales

6/6 5/6 3/6 3/6 1/6

0/6 0/6 0/6 0/6 0/6

6/6 5/6 5/6 5/6 0/6

1/6 0/6 0/6 1/6 0/6

40

(a) Ensayo n◦ 46 (b) Ensayo n◦ 45 45

(c) Todos los resultados se dan como n´ umero de muestras positivas/n´ umero de muestras ensayadas

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55

60

9

ES 2 059 370 T3 Tabla 3 Capacidad de infecci´ on de virus R7017 y R7020 por ruta ocular en ratones 5

Recuperaci´on de virus (c)

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D´ıa D´ıa D´ıa D´ıa D´ıa

15

1 2 3 4 7

R7017(a)

R7020(b)