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˜ OFICINA ESPANOLA DE PATENTES Y MARCAS

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k kInt. Cl. : C12N 15/74

11 N´ umero de publicaci´on:

2 185 972

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˜ ESPANA

C12N 1/21, A23C 9/12 A23L 1/03, C07K 14/35 C12N 15/31, C12N 15/62

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TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA

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kN´umero de solicitud europea: 97936612.7 kFecha de presentaci´on: 22.08.1997 kN´umero de publicaci´on de la solicitud: 0 925 364 kFecha de publicaci´on de la solicitud: 30.06.1999

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54 T´ıtulo: Sistema de expresi´ on regulable en bacterias productoras de ´ acido l´ actico.

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73 Titular/es: Bioteknologisk Institut

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72 Inventor/es: Madsen, Soeren Michael;

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74 Agente: Dur´ an Moya, Lu´ıs Alfonso

30 Prioridad: 06.09.1996 US 711434

Kogle All´ e2 2970 Hoersholm, DK

45 Fecha de la publicaci´ on de la menci´on BOPI:

01.05.2003

45 Fecha de la publicaci´ on del folleto de patente:

ES 2 185 972 T3

01.05.2003

Aviso:

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Vrang, Astrid; Arnau, Jos´ e; Ravn, Peter; Groenvald Johnsen Mads y Israelsen, Hans

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En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicaci´on en el Bolet´ın europeo de patentes, de la menci´on de concesi´on de la patente europea, cualquier persona podr´a oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposici´on deber´a formularse por escrito y estar motivada; s´olo se considerar´a como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposici´ on (art. 99.1 del Convenio sobre concesi´on de Patentes Europeas). Venta de fasc´ ıculos: Oficina Espa˜ nola de Patentes y Marcas. C/Panam´ a, 1 – 28036 Madrid

ES 2 185 972 T3 DESCRIPCION Sistema de expresi´on regulable en bacterias productoras de a´cido l´ actico. 5

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La presente invenci´on da a conocer sistemas de expresi´ on regulables en bacterias productoras de a´cido l´actico novedosos basados en la modificaci´ on de secuencias reguladoras existentes de forma natural, de manera que puede regularse la expresi´ on de genes obteni´endose una producci´on de productos gen´eticos a los niveles deseados. Las bacterias productoras de a´cido l´ actico recombinantes que poseen dichos sistemas de expresi´ on son u ´ tiles en la fabricaci´ on de productos alimentarios, en la producci´ on de piensos o como cepas de producci´ on en la fabricaci´ on de productos gen´eticos hom´ologos o heter´ologos, incluyendo productos gen´eticos farmac´eutica o inmunol´ogicamente activos. Las bacterias productoras de ´acido l´ actico recombinantes que expresan los determinantes antig´enicos tal como se dan a conocer en la presente invenci´on, son u ´tiles como vacunas vivas. Antecedentes y tecnica previa Durante siglos, se han utilizado los fermentos l´acticos de las bacterias productoras de ´acido l´ actico en la producci´ on de alimentos debido a su capacidad para convertir, mediante fermentaci´ on, los az´ ucares en ´acidos org´ anicos, predominantemente ´acido l´ actico, y en diversos metabolitos asociados con el desarrollo en los productos alimentarios fermentados de un sabor y olor deseables. Diversas bacterias productoras de a´cido l´ actico producen de forma inherente enzimas hidrol´ıticos entre los que se incluyen peptidasas, proteasas y enzimas lipol´ıticos, cuya producci´on puede, por ejemplo, contribuir al desarrollo del sabor deseado en los quesos. Sin embargo, para la producci´ on industrial de un amplio abanico de productos alimentarios fermentados tales como los bien conocidos productos l´acteos tradicionales incluyendo el yogourt, la leche acid´ ofila, la mantequilla y los quesos; los vegetales fermentados; los productos c´arnicos fermentados y los piensos, se necesitan un gran n´ umero de fermentos l´acticos de bacterias productoras de a´cido l´ actico, cada uno adaptado a los diferentes tipos de productos alimentarios particulares. Dichos fermentos se seleccionan actualmente a partir de cepas naturales de bacterias productoras de a´cido l´ actico en base a caracter´ısticas tales como su capacidad para fermentar los az´ ucares presentes en el producto alimentario que se desea fermentar, los requisitos espec´ıficos de temperatura de crecimiento y la producci´ on de los compuestos aromatizantes deseados, haciendo la combinaci´on espec´ıfica de sus caracter´ısticas que un cultivo natural espec´ıficamente seleccionado sea u ´ til para la producci´on de un producto alimentario concreto pero que habitualmente sea menos u ´til para la producci´on de otros. Obviamente, este procedimiento utilizado en la actualidad para el desarrollo de cultivos de bacterias productoras de a´cido l´ actico u ´ tiles mediante la selecci´on de cepas existentes de forma natural es lento y costoso. Adem´as, ha resultado dif´ıcil conseguir cepas para fermentos l´ acticos que combinen todas las caracter´ısticas requeridas en un nivel ´optimo. En la actualidad, este problema se soluciona habitualmente mediante la utilizaci´on de fermentos l´ acticos formados por m´ ultiples cepas productoras de ´acido l´ actico seleccionadas de manera que cada una de ellas posea una o varias de las caracter´ısticas deseadas para un producto alimentario particular. La necesidad de utilizaci´on de dichos cultivos mezclados aumenta obviamente los costes de fabricaci´on de los fermentos l´acticos de bacterias productoras de a´cido l´ actico. En base a su tradicional y prolongada aplicaci´ on en la fabricaci´ on de productos alimentarios y al hecho de que se consideran no pat´ ogenas, las bacterias productoras de a´cido l´ actico se reconocen generalmente como ingredientes alimentarios seguros (GRAS), incluso si se encuentran presentes en un producto alimentario fermentado en forma de bacterias vivas a concentraciones muy elevadas, tales como 108 a 109 por gramo. Actualmente, se reconoce ampliamente que existe una necesidad industrial substancial para hallar m´etodos econ´omica y t´ecnicamente m´as viables para desarrollar bacterias productoras de a´cido l´ actico mejoradas para ser utilizadas en fermentos l´acticos para alimentos humanos o animales o para la producci´ on de productos gen´eticos deseados, incluyendo el conseguir bacterias productoras de a´cido l´ actico que sean u ´ tiles en un amplio abanico de aplicaciones. Es evidente que la tecnolog´ıa del ADN recombinante puede proporcionar los medios para cubrir esta necesidad. En este contexto, es crucial que las bacterias productoras de a´cido l´ actico para la producci´on alimentaria, que se desarrollan mediante la introducci´on de los genes deseados con la utilizaci´on de la ingenier´ıa gen´etica, puedan seguir siendo consideradas como seguras para el consumo. Por tanto se considera esencial por parte de la industria alimentaria que las bacterias productoras de a´cido l´ actico recombinante contengan esencialmente s´olo ADN originario de bacterias productoras de ´acido l´ actico, incluyendo el ADN de pl´asmidos extracromos´omicos salvajes hallados frecuentemente en las cepas de fermentos l´acticos o ADN de bacterias no productoras de a´cido l´ actico, 2

ES 2 185 972 T3 que no confiera a las cepas recombinantes rasgos fenot´ıpicos peligrosos.

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Se han producido diversos intentos para obtener bacterias productoras de a´cido l´ actico mejoradas gen´eticamente. La mayor´ıa de estos intentos se han dirigido a la construcci´ on de vectores de expresi´on recombinantes que codifican los productos gen´eticos deseados y son capaces de replicarse en bacterias productoras de a´cido l´ actico. Sin embargo, en pocas ocasiones estos intentos han dado lugar a vectores que contengan u ´nicamente ADN originario de bacterias productoras de ´acido l´ actico.

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Adem´as de su utilizaci´on como fermentos l´acticos para alimentos, las bacterias productoras de ´acido l´actico pueden utilizarse como cepas productoras para la fabricaci´ on de productos gen´eticos funcionales biol´ ogicamente deseados tales como compuestos farmac´eutica o inmunol´ogicamente activos.

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Tal como se ha mencionado anteriormente, la presente invenci´on da a conocer novedosos sistemas de expresi´on gen´etica regulables en bacterias productoras de a´cido l´ actico, basados en la modificaci´ on de secuencias reguladoras existentes de forma natural que se encuentran unidas o asociadas operativamente con un gen, de manera que la expresi´ on del gen puede alterarse significativamente. Los sistemas de expresi´on gen´etica regulables o inducibles son muy importantes para la expresi´ on de genes que codifican prote´ınas que son (i) t´ oxicas para el organismo hu´esped, (ii) necesarias en grandes cantidades, (iii) utilizadas para estudiar el efecto de funciones de un gen particular sobre el metabolismo o regulaci´on celular o (iv) producidas en un momento concreto o bajo condiciones ambientales concretas. Mientras que los sistemas de expresi´on inducibles se han desarrollado para su utilizaci´on en E. coli, se han descrito pocos sistemas de expresi´on inducibles para su utilizaci´on en bacterias productoras de a´cido l´actico.

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Un ejemplo de sistema de expresi´on inducible en bacterias productoras de ´acido l´ actico es el basado en la utilizaci´on del promotor lac para la transcripci´ on de los genes lac de Lactococcus lactis. El promotor lac puede reprimirse mediante el represor LacR, pudiendo obtenerse una inducci´ on seis veces mayor de la transcripci´on al substituir la glucosa por lactosa en el medio de cultivo (van Rooijen y otros, 1992). Este sistema de expresi´on existente de forma natural se ha combinado con el sistema ARN polimerasa T7/promotor T7 de E. coli (Wells y otros, 1993 a, b; Steidler y otros, 1995). El promotor lac controla la expresi´on de la ARN polimerasa T7, la cual reconoce al promotor T7, permitiendo la expresi´ on inducible de los genes clonados m´as abajo del promotor T7. Este sistema ha sido utilizado en la producci´on del fragmento C de la toxina tet´ anica y de la interleuquina-2 de origen murino.

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Otro ejemplo es la utilizaci´on del promotor dnaJ en la transcripci´on del gen dnaJ del L. lactis, que ha sido utilizada para generar la expresi´ on inducible de una prote´ına heter´ologa tras una inducci´on por choque t´ermico (van Asseldonk y otros, 1993). El aumento de la temperatura de 30◦ C a 42◦C dio lugar una inducci´ on cuatro veces mayor de la transcripci´ on del gen. 40

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Otros ejemplos de sistemas de expresi´on inducibles en bacterias productoras de a´cido l´ actico incluyen la utilizaci´on de se˜ nales de expresi´on espec´ıficas de fagos obtenidas de bacteri´ ofagos l´ıticos de L. lactis que pueden aplicarse para expresar genes heter´ologos tras la infecci´on por el fago (O’Sullivan y otros, 1996), y sistemas basados en la inducci´ on de la expresi´ on gen´etica mediante la suplementaci´on del medio de cultivo bacteriano con una substancia inductora como por ejemplo el antibi´ otico antitumoral t´ oxico Mitomicina C (Nauta y otros, 1996) o una bacteriocina como por ejemplo la nisina (Ruyter y otros, 1996, Patente europea EP 0712 935 A2). Por todo ello, todos los m´etodos conocidos para controlar la expresi´ on gen´etica en bacterias productoras de ´acido l´ actico se basan en la adici´on al medio de cultivo de compuestos inductores o bacteri´ofagos o en cambios de la temperatura, es decir en factores a˜ nadidos ex´ ogenamente que no pueden ser aceptables de acuerdo con los requisitos de las normativas de seguridad o que no son econ´omica o industrialmente viables en el contexto de la utilizaci´on a nivel industrial de las bacterias productoras de a´cido l´ actico en la fabricaci´ on de alimentos para humanos o animales o en la fabricaci´on de productos gen´eticos deseados.

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Recientemente se ha descubierto que es posible aislar promotores de bacterias productoras de a´cido l´actico inducibles o regulables por la presencia/ausencia o la concentraci´on de uno o m´ as factores ambientales asociados con los m´etodos convencionales de producci´ on industrial de bacterias productoras de a´cido l´ actico tales como el pH, la temperatura de crecimiento, la composici´on del medio de cultivo incluyendo la fuerza i´ onica/contenido de NaCl, la presencia/ausencia de precursores de nucle´ otidos de purina y/o la fase/velocidad de crecimiento de las bacterias (WO 94/16086, Israelsen y otros, 1995).

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Es evidente que los sistemas de expresi´on regulables basados en dichos factores ambientales o condiciones de crecimiento mencionados anteriormente, y que se encuentran presentes habitualmente en los medios de cultivo industriales para bacterias productoras de a´cido l´ actico ya sea al inicio o durante el proceso de cultivo, representan un enfoque altamente atractivo para la regulaci´ on de la producci´ on de productos gen´eticos hom´ologos o heter´ologos en las bacterias productoras de ´acido l´ actico. Sin embargo, para que la aplicaci´ on de estos sistemas de expresi´on regulable tenga ´exito, el promotor seleccionado debe ser efectivo y dar lugar a una producci´ on de la prote´ına deseada en una cantidad lo suficientemente grande bajo condiciones industriales como para facilitar una producci´ on o proceso de fabricaci´ on econ´omicamente viables. Sin embargo, se ha observado que estos, por otra parte u ´ tiles, promotores regulables de bacterias productoras de ´acido l´ actico, existentes de forma natural podr´ıan poseer solamente una actividad promotora relativamente d´ebil. Recientemente se ha descubierto que la actividad de estos promotores de bacterias productoras de a´cido l´ actico naturales inducibles o regulables puede aumentarse modificando la regi´ on de nucle´ otidos en la que se encuentra el promotor y, de forma m´as importante, que puede obtenerse dicho aumento de la actividad del promotor sin reducir o eliminar la inductibilidad provocada por los factores condicionantes del crecimiento mencionados previamente. La invenci´on tambi´en ha hecho posible dar a conocer unos grupos o paneles formados por bacterias productoras de a´cido l´ actico que producen el producto gen´etico deseado a diferentes niveles bajo las mismas condiciones. De forma adicional, tambi´en se ha observado que la modificaci´ on de las secuencias de la regi´on del promotor puede dar lugar a cepas que poseen un nivel de expresi´on modulado bajo condiciones de inducci´ on en comparaci´ on con la regulaci´ on ejercida por la regi´ on correspondiente del promotor no modificada. Resumen de las caracter´isticas de la invencion

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Por tanto, en un primer aspecto, la presente invenci´ on hace referencia a un m´etodo para la construcci´ on de un vector de expresi´ on capaz de ser replicado en una c´elula bacteriana productora de a´cido l´actico, estando dicho vector formado por: 30

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(i) una regi´ on promotora formada por (a) un elemento de secuencia promotor cuya funci´ on es regulable por un factor seleccionado del grupo formado al menos por el pH, la temperatura de crecimiento, el contenido de ox´ıgeno, un cambio de temperatura que promueva la expresi´ on de genes de choque t´ermico, la composici´on del medio de cultivo incluyendo la fuerza i´ onica/contenido de NaCl, la presencia/ausencia de constituyentes celulares esenciales o precursores de los mismos, la fase de crecimiento de las bacterias y la velocidad de crecimiento de las mismas y (b) al menos un elemento de secuencia de nucle´otidos adicional, poseyendo la secuencia de dicho elemento un efecto regulador sobre la expresi´ on de un gen unido de forma operativa a la regi´ on promotora, y (ii) al menos un lugar de restricci´ on.

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el m´etodo comprende las etapas de: (1) aislar de una c´elula bacteriana una regi´ on promotora formada por un elemento de secuencia (a) y un elemento de secuencia (b), 45

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(2) modificar la secuencia de al menos uno de dichos elementos secuencia de manera que se obtenga una regi´on promotora modificada que, unida de forma operativa a un gen que se desee expresar, haga que la expresi´ on de dicho gen se multiplique al menos por cinco respecto a la expresi´on, bajo condiciones ambientales esencialmente id´enticas, del mismo gen bajo el control de la regi´on promotora no modificada, no reduci´endose o elimin´ andose la regulaci´ on por parte de dichos factores mediante dicha modificaci´ on. En aspectos adicionales se da a conocer un vector de expresi´ on que es capaz de replicarse en una bacteria productora de a´cido l´ actico, siendo seleccionado dicho vector del grupo formado por pAMJ553, pAMJ567 y pAMJ586 depositados respectivamente con los n´ umeros de registro DSM 11135, DSM 11136 y DSM11137 y un m´etodo para construir una bacteria productora de a´cido l´ actico, comprendiendo dicho m´etodo la construcci´ on de un vector de expresi´ on de acuerdo con el m´etodo anterior y la transformaci´ on de una bacteria productora de a´cido l´ actico con dicho vector. En a´ un otro aspecto, la presente invenci´ on hace referencia a una bacteria productora de ´acido l´ actico recombinante que comprende un vector de expresi´ on seleccionado del grupo formado por pAMJ553, pAMJ567 y pAMJ586 depositados respectivamente bajo los n´ umeros de registro DSM 11135, DSM 11136 y DSM 11137. 4

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Tambi´en se da a conocer un m´etodo para obtener un fermento l´ actico, comprendiendo dicho m´etodo las etapas de construir una bacteria productora de a´cido l´ actico utilizando el m´etodo anterior y obtener un concentrado congelado de la misma y un fermento l´ actico productor de a´cido l´ actico formado por una bacteria productora de a´cido l´ actico recombinante que comprende un vector de expresi´on seleccionado del grupo formado por pAMJ553, pAMJ567 y pAMJ586 depositados respectivamente bajo los n´ umeros de registro DSM 11135, DSM 11136 y DSM 11137. La invenci´on tambi´en da a conocer un m´etodo para la producci´ on de un producto alimentario para animales o un pienso, comprendiendo dicho m´etodo la adici´ on a las materias primas del producto alimentario o a los componentes del pienso de un fermento l´actico de bacterias productoras de ´acido l´ actico tal como se da a conocer en la presente invenci´on. En a´ un otros aspectos, la presente invenci´on hace referencia a un m´etodo para la producci´ on de un producto gen´etico farmac´euticamente activo, comprendiendo dicho m´etodo cultivar cualquiera de las c´elulas bacterianas productoras de ´acido l´ actico anteriores de acuerdo con la invenci´on, poseyendo dichas c´elulas un gen que codifica un producto gen´etico farmac´euticamente activo, bajo condiciones en las que el gen es expresado y aislar el producto gen´etico y a un m´etodo de producci´ on de un producto gen´etico inmunol´ ogicamente activo, comprendiendo dicho m´etodo cultivar una c´elula bacteriana productora de ´acido l´ actico que comprende un gen que codifica un producto gen´etico inmunol´ ogicamente activo bajo condiciones en las que el gen es expresado y aislar el producto gen´etico. Espec´ıficamente, se da a conocer un m´etodo de producci´ on de polip´eptidos derivados de especies de Mycobacterium tales como M. tuberculosis.

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Descripci´ on detallada de la presente invenci´ on

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Un objetivo primario de la presente invenci´on es dar a conocer una bacteria productora de a´cido l´ actico en la cual la expresi´on de los genes deseados bajo el control de una regi´on promotora, que comprende al menos una se˜ nal o secuencia reguladora, es inducible y/o regulable por uno o m´ as factores ambientales o condicionantes del crecimiento y es alterada por la modificaci´ on de la se˜ nal o secuencia reguladora. Tal como se utiliza en la presente invenci´on, el t´ermino “bacteria productora de a´cido l´ actico” designa una bacteria gram positiva, microaer´ ofila o anaerobia la cual fermenta az´ ucares con la producci´ on de ´acidos entre los que se incluyen el ´acido l´ actico como ´acido producido de forma predominante, el a´cido ac´etico y el ´acido propi´ onico. Las bacterias productoras de a´cido l´ actico m´as u ´ tiles a nivel industrial se encuentran entre los Lactococcus spp., Streptococcus spp., Lactobacillus spp., Leuconostoc spp., Pediococcus spp.,Brevibacterium spp. y Propionibacterium spp. Adicionalmente, las bacterias que producen ´acido l´ actico pertenecientes al grupo de las bacterias anaerobias estrictas denominadas bifidobacterias, es decir Bifidobacterium spp., las cuales se utilizan frecuentemente como fermentos l´ acticos alimentarios solas o en combinaci´on con bacterias productoras de a´cido l´ actico, se incluyen generalmente en el grupo de bacterias productoras de a´cido l´ actico. El vector de expresi´on de acuerdo con la presente invenci´ on comprende en su regi´on promotora un elemento de secuencia promotor, cuya actividad o funci´ on es inducible y/o regulable por la presencia/ausencia de la concentraci´ on de uno o m´ as factores ambientales o condicionantes del crecimiento asociados con los m´etodos de producci´ on industrial mediante bacterias productoras de a´cido l´ actico. En el presente contexto, la expresi´on “secuencia promotor” se utiliza en el sentido convencional para designar el lugar donde puede unirse la ARN polimerasa.

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La regi´ on promotora puede, de acuerdo con la presente invenci´ on, derivarse de cualquier c´elula bacteriana, pero en las realizaciones preferentes se deriva de especies de bacterias productoras de ´acido l´ actico, incluyendo las especies anteriores y los Bifidobacterium spp. En las realizaciones u ´ tiles, la regi´ on promotora se deriva de una regi´ on promotora de Lactococcus lactis incluyendo el Lactococcus lactis subespecie lactis, por ejemplo la cepa designada MG1363 [esta cepa tambi´en se cita en la literatura como Lactococcus lactis subespecie cremoris (Nauta y otros., 1996)] y el Lactococcus lactis subespecie lactis biovar. diacetylactis. Una regi´ on promotora inducible existente de forma natural que puede ser modificada de acuerdo con la presente invenci´ on puede aislarse mediante cualquiera de los m´etodos convencionales para la identificaci´ on y aislamiento de secuencias de nucle´otidos que comprenden una secuencia promotor y secuencias que poseen un efecto sobre la actividad del promotor. Ejemplos de dichas regiones promotoras que, de acuerdo con la presente invenci´ on, son u ´tiles como materiales de partida se dan a conocer en el documento WO 94/16086 incluyendo una regi´ on que comprende el promotor P170. T´ıpicamente, dicho 5

ES 2 185 972 T3 material de partida formado por una regi´ on promotora posee un tama˜ no que se encuentra entre los 50 y 10.000 pares de bases, tal como un tama˜ no entre 50 y 2000 pares de bases incluyendo un tama˜ no entre los 50 y 200 pares de bases. 5

Preferentemente, los factores ambientales o condicionantes de crecimiento anteriores se seleccionan entre el pH, la temperatura de crecimiento, el contenido de ox´ıgeno, un cambio de temperatura que provoca la expresi´on de genes de choque t´ermico, la composici´on del medio de cultivo incluyendo la fuerza i´onica/contenido de NaCl, la presencia/ausencia de constituyentes celulares esenciales o precursores de los mismos, la fase de crecimiento de las bacterias o la velocidad de crecimiento de las mismas.

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Se entiende que cuando se trata de un promotor u ´nico, cuya inducci´ on o regulaci´ on est´a controlada por una o m´ as substancias presentes en un medio de cultivo convencional, las substancias que no son componentes normales de dicho medio, tales como los antibi´oticos o las bacteriocinas, no se incluyen generalmente, de acuerdo con la presente invenci´on, como factores ambientales o condicionantes del crecimiento. La regi´ on promotora del vector de acuerdo con la presente invenci´ on comprende, tal como se ha mencionado anteriormente, al menos un elemento de secuencia de nucle´ otidos, cuya posici´ on, orientaci´ on, presencia y/o secuencia posee un efecto regulador sobre la expresi´ on de un gen unido operativamente a la regi´ on promotora. Tal como se usa en la presente invenci´on, la expresi´ on “secuencia de nucle´otidos adicional” puede incluir una secuencia que codifica un lugar de uni´ on de ribosomas, un lugar de uni´ on de factores de transcripci´on, un lugar de uni´ on de represores, un lugar mediador de la expresi´ on gen´etica autorregulada o atenuada, una secuencia de ADN que puede transcribirse en un ARNm que posea una afinidad alterada por los ribosomas o una afinidad alterada por las nucleasas, una secuencia de ADN que comprenda un terminal de la transcripci´ on o cualquier otra secuencia capaz de modular y/o aumentar la expresi´on gen´etica. En el presente contexto, este t´ermino tambi´en incluir´ a las secuencias de ADN en la regi´ on promotora que carecen de una funci´ on reconocida espec´ıficamente, tales como, por ejemplo, las secuencias situadas entre o adyacentes a -10 y -35 secuencias del promotor y otras secuencias de consenso.

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De acuerdo con la presente invenci´ on, la posici´ on, orientaci´ on, presencia y/o ausencia de al menos una de dichas secuencias promotor y de los elementos secuencia de nucle´otidos adicionales del vector de expresi´ on se modifican respecto a la posici´on, orientaci´ on, presencia y/o ausencia de su elemento no modificado correspondiente.

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As´ı, las modificaciones contempladas de las secuencias de la regi´on promotora incluyen cualquier modificaci´on de las mismas que afecte la frecuencia de iniciaci´on de la transcripci´ on. Ello se obtiene mediante la substituci´ on, deleci´on y/o inserci´on de uno o m´ as nucle´otidos utilizando cualquier t´ecnica convencional utilizada para este objetivo incluyendo la mutag´enesis aleatoria o dirigida para obtener, por ejemplo, mutaciones puntuales por ejemplo utilizando la PCR o un elemento transponible.

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Tambi´en pueden realizarse, de acuerdo con la presente invenci´on, modificaciones adicionales de la regi´on promotora en una o m´ as de las secuencias de nucle´otidos adicionales anteriores utilizando cualquiera de las t´ecnicas previamente citadas, tal como se describir´a en detalle en los ejemplos siguientes. 45

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Se entender´a que es posible obtener un vector de expresi´on de acuerdo con la presente invenci´ on en el que son modificadas tanto la secuencia promotor como una secuencia de nucle´ otidos adicional. En una realizaci´ on preferente, el vector de acuerdo con la presente invenci´on es uno en el que la modificaci´on de al menos uno de los elementos anteriores da lugar a que la expresi´ on de un gen que se encuentra unido operativamente a la regi´on promotora se altera respecto a la expresi´on del mismo gen bajo el control de la regi´ on promotora no modificada. En el presente contexto, la expresi´on “expresi´ on alterada” se utiliza para indicar que la cantidad de producto gen´etico producida es diferente a la cantidad de producto gen´etico producida cuando se utiliza, bajo condiciones ambientales y de crecimiento esencialmente id´enticas, una bacteria que comprende el mismo gen bajo el control de la correspondiente regi´on promotora no modificada de la cual se deriva la regi´ on promotora modificada. En una realizaci´ on preferente, la anterior modificaci´ on de un elemento de secuencia promotor y/o de un elemento de secuencia de nucle´otidos adicional da lugar al aumento de la expresi´ on del gen que se encuentra bajo el control de la regi´ on promotora modificada, dando lugar a un aumento de la cantidad de producto gen´etico producido en comparaci´ on con la cantidad producida por una bacteria en la que el mismo gen se encuentra bajo el control de la regi´on promotora no modificada a partir de la cual se deriva la regi´ on promotora modificada. Preferentemente, la producci´ on del producto gen´etico se multiplica al 6

ES 2 185 972 T3 menos por dos, de forma m´ as preferente al menos por tres, y de forma incluso m´ as preferente al menos por cuatro. Pueden obtenerse aumentos incluso mayores multiplic´ andose la producci´ on al menos por cinco, m´as preferentemente al menos por diez e incluso m´as preferentemente al menos por cincuenta incluyendo multiplicaciones por cien tales como al menos por doscientos. 5

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El vector de expresi´on de acuerdo con la presente invenci´ on comprende al menos un lugar de restricci´on para la inserci´ on de secuencias de nucle´otidos u ´tiles incluyendo un gen que codifique un producto gen´etico deseado de manera que se obtenga la expresi´on del gen bajo el control de la regi´ on promotora modificada, es decir el gen se inserta de manera que queda unido operativamente a la regi´on promotora. El gen tal como se ha definido anteriormente puede ser un gen hom´ ologo o heter´ologo incluyendo genes derivados de diferentes bacterias productoras de a´cido l´ actico. Puede ser ventajoso que el producto gen´etico al ser expresado por el gen insertado se transloque al exterior de la membrana celular o incluso se libere en el medio de cultivo. Ello requiere que el gen est´e precedido de una secuencia de nucle´ otidos que codifique una funcionalidad de p´eptido se˜ nal o que el gen sea parte de una secuencia h´ıbrida que codifique una prote´ına de fusi´ on que sea secretable debido a que una de las partes fusionadas posea una secuencia l´ıder. Por tanto, el gen insertado en un vector de acuerdo con la presente invenci´on puede, si es necesario, comprender una secuencia de nucle´otidos tal que codifique un p´eptido se˜ nal, es decir una secuencia se˜ nal. El p´eptido se˜ nal puede estar unido funcionalmente a un prop´eptido. En las realizaciones u ´ tiles, el gen, insertado de este modo, que codifica un producto gen´etico deseado se selecciona a partir de los genes que codifican lipasas, peptidasas, proteasas, nucleasas, productos gen´eticos involucrados en el metabolismo hidrocarbonado, productos gen´eticos involucrados en el metabolismo del citrato, productos gen´eticos involucrados en la resistencia a bacteri´ofagos, enzimas l´ıticos, prote´ınas v´ıricas tales como las prote´ınas de la c´apside, prote´ınas de la superficie celular microbiana y bacteriocinas. El gen tambi´en puede corresponder a los genes que codifican productos gen´eticos que confieren resistencia a antibi´oticos o bacteriocinas tales como, por ejemplo, la nisina o la pediocina. En realizaciones espec´ıficas, el vector comprende un gen que codifica la β-galactosidasa. Como ejemplos de estos vectores se incluyen los pl´asmidos pAMJ553, pAMJ567 y pAMJ586, depositados el 4 de Septiembre de 1996 en la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Alemania con los n´ umeros de registro DSM 11135, DSM 11136 y DSM 11137 respectivamente. Estos tres vectores que contienen el mismo gen de la β-galactosidasa expresan el producto gen´etico del mismo a diferentes niveles bajo las mismas condiciones ambientales o de crecimiento debido a diferentes modificaciones de la regi´on promotora tal como se describe en el Ejemplo 6 y por tanto, son un ejemplo de un grupo de vectores de expresi´ on en los que un gen es expresado a diferentes niveles. Como otros ejemplos de este tipo de grupo de vectores se incluyen los vectores pSMA607, pSMA609 y pSMA610 tal como se describe en el ejemplo 7, los cuales est´ an dotados de un p´eptido se˜ nal, y los vectores pSMA604, pSMA605 y pSMA606 correspondientes a los vectores anteriores pSMA607, pSMA609 y pSMA610 con la diferencia que carecen del p´eptido se˜ nal.

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En realizaciones especialmente interesantes, el vector comprende un gen que codifica un producto gen´etico biol´ ogicamente funcional entre los que se incluyen enzimas que regulan la formaci´on de los compuestos aromatizantes, toxinas, polip´eptidos inmunol´ ogicamente activos, polip´eptidos farmac´euticamente activos y polip´eptidos antimicrobiol´ ogicamente activos. En este sentido como ejemplos de enzimas interesantes que regulan directa o indirectamente la formaci´on de compuestos aromatizantes (aroma) en las bacterias productoras de ´acido l´ actico tales como el acetaldeh´ıdo, la aceto´ına, el 2,3 butilenglicol y el diacetilo, se incluyen la piruvato-formato liasa, la alcohol deshidrogenasa, la piruvato descarboxilasa, la α-acetolactato sintetasa, la lactato deshidrogenasa y la acetaldeh´ıdo deshidrogenasa. Entre los productos gen´ eticos inmunol´ ogicamente activos se incluye cualquier secuencia que comprenda al menos un epitopo. Estas secuencias pueden ser u ´ tiles como vacunas y/o agentes diagn´osticos, y pueden derivarse de cualquier organismo pat´ ogeno contra el que exista la necesidad de inmunizar un animal, tal como un mam´ıfero, incluyendo el hombre. Se entender´ a que el epitopo expresado por el gen insertado debe poder ser secretado fuera de la c´elula en el medio de cultivo o poder ubicarse en la superficie exterior del organismo hu´esped de manera que sea posible aplicar la misma c´elula hu´esped como vacuna. Alternativamente, el epitopo puede ser producido intracelularmente, en cuyo caso se aislar´ aa partir de la c´elula. Otro medio interesante de expresar un epitopo es insertar la secuencia de nucle´otidos que codifica el epitopo dentro de otro gen que se inserta en el vector de manera que se expresa el epitopo en una forma inmunol´ ogicamente activa como parte de una prote´ına de fusi´ on.

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En una realizaci´ on espec´ıfica, el vector de acuerdo con la invenci´ on comprende una secuencia que codifica un determinante antig´enico o epitopo micobacteriano, es decir un oligo o polip´eptido in7

ES 2 185 972 T3 munol´ ogicamente activo que posee, al ser administrado a un animal incluyendo el hombre, un efecto estimulador de la respuesta inmune celular y/o humoral.

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En particular, dicha secuencia de codificaci´on puede derivarse de un organismo que pertenezca al grupo de las especies Mycobacterium al que generalmente se denomina “complejo tuberculosis” y en el que se incluyen Mycobacterium tuberculosis, M. bovis y M. africanum. Estos productos gen´eticos antig´enicos de origen micobacteriano son potencialmente u ´tiles como vacunas contra la tuberculosis y/o como reactivos diagn´ osticos en el test d´ermico de la tuberculosis. Es evidente que la producci´on industrial de vacunas y agentes activos diagn´ osticos para su utilizaci´on en humanos y animales en un organismo seguro y no pat´ ogeno tal como las bacterias productoras de a´cido l´ actico ser´ıa altamente ventajoso. Tal como se describe en los ejemplos siguientes, la presente invenci´ on ha hecho posible la utilizaci´on de las bacterias productoras de a´cido l´ actico transformadas con un vector de acuerdo con la invenci´ on como cepas productoras en la fabricaci´on de polip´eptidos micobacterianos incluyendo polip´eptidos portadores de epitopos. De este modo, se ha hallado que los polip´eptidos micobacterianos pueden ser producidos por una bacteria productora de a´cido l´ actico de acuerdo con la invenci´ on, la cual secreta los polip´eptidos en el medio de cultivo en una cantidad de al menos 30 mg/l, contempl´andose rendimientos superiores tales como al menos 50 mg/l o al menos 100 mg/l, por ejemplo al menos 500 mg/l incluyendo un rendimiento de al menos 1000 mg/l. Adem´ as de modular la expresi´ on de polip´eptidos micobacterianos de acuerdo con la invenci´on para obtener niveles mayores de expresi´on, puede obtenerse un aumento en el rendimiento de la obtenci´on de estos ant´ıgenos mediante la inserci´on de dos o m´ as copias de la secuencia de codificaci´on. En otras realizaciones u ´ tiles, el gen insertado dentro del vector es un gen que codifica un anticuerpo ya sea monoclonal o policlonal. Dicho gen puede derivarse de un origen animal incluyendo p´ ajaros, mam´ıferos y seres humanos. Adem´as de las secuencias anteriores que forman parte del vector de expresi´ on de acuerdo con la presente invenci´on, el vector tambi´en puede comprender un marcador gen´etico que permita, por ejemplo, el mantenimiento estable del vector en la c´elula hu´esped. La selecci´on del marcador adecuado depender´ a de la utilizaci´on particular del vector y es f´ acilmente realizable por los expertos en la t´ecnica. Como ejemplos de marcadores gen´eticos u ´ tiles se incluyen marcadores auxotr´oficos que sean complementarios o genes que medien la resistencia a antibi´oticos o bacteriocinas. De acuerdo con la presente invenci´ on se da a conocer, en un aspecto adicional de la misma, una bacteria productora de a´cido l´ actico recombinante transformada con un vector tal como se ha descrito anteriormente. En las realizaciones u ´ tiles, el vector se encuentra contenido en un pl´asmido que puede replicarse en una bacteria productora de a´cido l´ actico o, si se prefiere, el vector o elementos independientes del mismo pueden integrarse dentro del cromosoma de la c´elula hu´esped, por ejemplo mediante la utilizaci´ on de una t´ecnica de integraci´on tipo Campbell en la cual un vector comprende al menos un elemento de secuencia de nucle´ otidos hom´ ologo a una secuencia de nucle´otidos codificada a nivel cromos´ omico, facilitando de este modo la integraci´on del vector dentro del cromosoma mediante un acontecimiento recombinante que involucra secuencias hom´ ologas. Tambi´en es posible construir una bacteria productora de a´cido l´ actico recombinante en la cual se produce al menos un acontecimiento recombinante adicional, incluyendo los acontecimientos recombinantes que dan lugar a la escisi´on de secuencias de ADN cromos´omico.

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La bacteria productora de a´cido l´ actico recombinante tal como se ha definido previamente puede seleccionarse del grupo formado por Lactococcus spp. incluyendo el Lactococcus lactis spp. lactis, el Lactococcus lactis spp. diacetylactis y el Lactococcus lactis spp. cremoris, Streptococcus spp. incluyendo el Streptococcus salivarius spp. thermophilus, Lactobacillus spp. incluyendo el Lactobacillus acidophilus, el Lactobacillus plantarum, el Lactobacillus delbr¨ uckii spp. bulgaricus y el Lactobacillus helveticus, Leuconostoc spp. incluyendo el Leuconostoc oenos, Pediococcus spp., Brevibacterium spp., Propionibacterium spp. y Bifidobacterium spp. incluyendo el Bifidobacterium bifidum. En a´ un otro aspecto, la presente invenci´ on hace referencia a una c´elula bacteriana productora de a´cido l´ actico recombinante que comprende como elementos interconectados operativamente, poseyendo la posici´on, orientaci´ on, presencia y/o secuencia de al menos uno de ellos un efecto regulador sobre la expresi´on de un gen de la c´elula que codifica un producto gen´etico deseado: (i) el gen que codifica el producto gen´etico deseado, (ii) un elemento de secuencia promotor, cuya funci´ on es inducible o regulable por factores ambientales o condicionantes del crecimiento tal como se ha definido previamente y (iii) al menos un elemento de secuencia de nucle´otidos adicional, habi´endose modificado la posici´ on, orientaci´ on, presencia y/o secuencia de al menos uno de dichos elementos respecto a la posici´on, orientaci´ on, presencia y/o secuencia del elemento no modificado de manera que se altera el nivel de expresi´on del gen. Los 8

ES 2 185 972 T3 m´etodos de modificaci´on de cualquiera de estos elementos son los mismos descritos previamente para las secuencias correspondientes del vector de expresi´on de acuerdo con la invenci´ on.

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Se entender´a que cada uno de los elementos interconectados operativamente anteriores puede estar ubicado en el mismo o en diferentes replicones de la c´elula, incluy´endose dentro del t´ermino “replic´on” cromosomas, pl´ asmidos y bacteri´ ofagos. La bacteria productora de a´cido l´ actico puede seleccionarse de cualquiera de las especies de bacterias productoras de a´cido l´ actico previamente citadas.

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Las bacterias productoras de a´cido l´ actico recombinantes tal como se dan a conocer en la presente invenci´on pueden ser u ´tiles como fermentos l´acticos para la fabricaci´ on de productos alimentarios entre los que se incluyen productos l´acteos, productos c´ arnicos y productos de origen vegetal y en la conservaci´ on de piensos. En este u ´ ltimo contexto, las bacterias recombinantes presentes son particularmente interesantes como inoculantes en cosechas que deban ser ensiladas. Cuando las bacterias vayan a utilizarse con este objetivo deben proporcionarse convenientemente en forma de concentrados bacterianos secos o congelados que contengan por ejemplo entre 1010 y 1012 unidades formadoras de colonias (UFCs) por gramo de concentrado. Estos concentrados se proporcionan t´ıpicamente en forma de composiciones de fermentos l´acticos liofilizados o congelados que comprenden adem´as de las bacterias productoras de a´cido l´actico, una serie de aditivos que contribuyen a obtener una elevada concentraci´ on de c´elulas viables y una vida de almacenamiento adecuada de la composici´on, entre los que se incluyen crioprotectores o aditivos que ayudan a la r´ apida actividad de las c´elulas de la composici´on cuando ´esta se a˜ nade al material que se desea fermentar tal como nutrientes o agentes tamp´ on. Un aspecto interesante de la presente invenci´on es que pueden proporcionarse fermentos l´acticos modificados de acuerdo con la presente invenci´ on de manera que una o m´as de las v´ıas metab´olicas de los az´ ucares y/o del citrato de las c´elulas del cultivo han sido modificadas mediante la modificaci´ on de la expresi´on de genes que controlan directa o indirectamente la formaci´ on de los compuestos aromatizantes deseados tales como el diacetilo, el acetaldeh´ıdo o el 2,3 butilenglicol.

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El fermento l´actico de acuerdo con la presente invenci´ on puede, si se desea, comprender una mezcla de cepas diferentes de bacterias productoras de a´cido l´ actico tal como se definen en el presente documento. Dicha mezcla de cepas puede comprender cepas individuales en las que un gen deseado, que se encuentra bajo el control de regiones promotoras modificadas de forma diferente derivadas de la misma regi´ on promotora existente de forma natural, se expresa a diferentes niveles bajo las mismas condiciones. Alternativamente, la mezcla de cepas puede comprender un grupo o panel de cepas en las cuales la expresi´on del gen deseado se encuentra bajo el control de regiones promotoras modificadas originadas a partir de regiones promotoras existentes de forma natural diferentes y que responden de forma diferente a factores ambientales reguladores o condicionadores del crecimiento. Alternativamente, un cultivo mezclado de bacterias productoras de a´cido l´ actico de acuerdo con la invenci´ on puede comprender genes diferentes que codifiquen productos gen´eticos diferentes. Una utilizaci´ on interesante adicional de las bacterias productoras de a´cido l´ actico tal como se definen en la presente invenci´on es en la fabricaci´ on de composiciones activas probi´oticamente. El t´ermino “activa probi´ oticamente” indica que las bacterias seleccionadas con este objetivo poseen caracter´ısticas que les permiten colonizar el tracto gastrointestinal y ejercer de este modo un efecto regulador positivo sobre la flora microbiana en dicho h´ abitat. Este efecto puede reconocerse por una mejor´ıa en la conversi´on de alimentos o comida en los humanos o animales a los que se administran las bacterias, o como un aumento de la resistencia contra microorganismos patog´enicos invasores.

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Adem´as, se contempla que las bacterias productoras de a´cido l´ actico de la presente invenci´on pueden ser u ´ tiles como cepas de producci´on en la producci´ on industrial de un amplio abanico de productos gen´eticos deseados tales como los mencionados previamente. 55

El fermento l´actico de bacterias productoras de ´acido l´ actico de acuerdo con la presente invenci´ on es u ´ til en los m´etodos de producci´ on de un producto alimentario tal como se ha mencionado anteriormente. El fermento l´actico puede utilizarse dentro de los m´etodos convencionales de producci´ on de alimentos que incluyen la etapa de acidificar o fermentar las materias primas del producto alimentario utilizando una bacteria productora de a´cido l´ actico.

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El fermento l´actico de bacterias productoras de ´acido l´ actico tal como se da a conocer en la presente invenci´on tambi´en puede ser u ´ til en fermentos l´ acticos para la conservaci´on de piensos. En este u ´ltimo 9

ES 2 185 972 T3 contexto, los fermentos l´acticos son particularmente interesantes como inoculantes a˜ nadidos a cosechas tales como forrajes o ma´ız que deban ser ensiladas.

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Una utilizaci´ on interesante adicional de las bacterias productoras de a´cido l´ actico de acuerdo con la presente invenci´on es como cepas productoras en la fabricaci´on de productos gen´eticos deseados incluyendo productos gen´eticos farmac´euticamente activos. En este sentido, se da a conocer, tal como se ha mencionado anteriormente, un m´etodo para la producci´ on de productos gen´eticos farmac´euticamente activos que comprende las etapas de cultivar una c´elula bacteriana productora de a´cido l´ actico de acuerdo con la presente invenci´on comprendiendo dicha c´elula un gen que codifica un producto gen´etico farmac´euticamente activo bajo condiciones en las que el gen es expresado y aislar dicho producto gen´etico. Los genes que vayan a expresarse en las bacterias productoras de ´acido l´ actico recombinantes previamente descritas pueden aislarse de cualquier fuente animal incluyendo mam´ıferos, humanos, p´ ajaros y peces. Como ejemplos t´ıpicos de productos gen´eticos interesantes pueden citarse en este sentido las proteasas, los activadores e inhibidores de las proteasas, las citoquinas, los enzimas o las hormonas pept´ıdicas, aunque deber´a entenderse que cualquier producto gen´etico que posea actividad farmac´eutica queda dentro del a´mbito de la presente invenci´ on. Una clase de productos gen´eticos particularmente interesante que puede ser producida de acuerdo con la presente invenci´on es la formada por los productos gen´eticos inmunol´ ogicamente activos. En este sentido, la invenci´on da a conocer en uno de sus aspectos, tal como se ha mencionado anteriormente, un m´etodo para la producci´ on de este tipo de productos inmunol´ ogicamente activos, utilizando como c´elula productora una c´elula bacteriana productora de a´cido l´ actico de acuerdo con la invenci´ on. En este contexto, la expresi´on “producto gen´etico inmunol´ ogicamente activo” incluye ant´ıgenos, epitopos, polip´eptidos que comprenden un epitopo, anticuerpos tales como los anticuerpos monoclonales, y fragmentos y/o derivados de los mismos. Tambi´en se contempla que pueden producirse, de acuerdo con el presente m´etodo, substancias biol´ ogicamente activas que pueden modular o estimular el sistema inmunol´ogico. En realizaciones espec´ıficas, el producto gen´etico inmunol´ ogicamente activo es un oligo o polip´eptido derivado de una especie pat´ ogena bacteriana o v´ırica tal como un producto gen´etico derivado de una especie de Mycobacterium tal como se describe en los ejemplos siguientes. Como ejemplos espec´ıficos se incluyen los p´eptidos denominados generalmente en la t´ecnica como p´eptidos de filtrados precoces de cultivos derivados del M. tuberculosis tales como el ant´ıgeno MPT64 (Oettinger y otros, 1995) o el polip´eptido ESAT-6 (Sørensen y otros, 1995).

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Los compuestos inmunol´ogicamente activos producidos de acuerdo con la presente invenci´ on puede procesarse adicionalmente en, por ejemplo, composiciones de vacunas, agentes terap´euticos, agentes diagn´ osticos o pron´ osticos de acuerdo con m´etodos bien conocidos en los campos respectivos. 40

A continuaci´ on, la presente invenci´ on ser´a ilustrada en mayor detalle en los siguientes ejemplos y dibujos en los que:

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La Figura 1 es un mapa f´ısico de la regi´on cromos´omica situada m´ as arriba del punto de inserci´ on Tn917-LTV1 en la cepa integrante PA170 (tambi´en denominada en el documento WO 94/16086 como P139-170 o 170). Los numerales indican las posiciones de los pares de bases respecto al punto de inserci´on. Las flechas indican la orientaci´on y localizaci´ on de los cebadores de PCR utilizados para la construcci´on de la cepa AMJ547. Solo se muestran los lugares de restricci´ on relevantes. La Figura no est´ a realizada a escala;

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la Figura 2 es un mapa f´ısico que muestra los fragmentos de PCR insertados dentro del vector sonda promotor pAK80. Los numerales indican las posiciones de los pares de bases respecto al punto de inserci´on Tn917 en el cromosoma de la cepa integrante PA170. Las flechas indican la orientaci´on y localizaci´ on de los cebadores de PCR utilizados para la construcci´on de las cepas AMJ547, AMJ561, AMJ554, AMJ553, AMJ552 y AMJ553, respectivamente. La figura no est´ a realizada a escala;

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la Figura 3 es un mapa f´ısico que muestra los fragmentos de PCR insertados dentro del vector sonda promotor pAK80. Los numerales indican posiciones de los pares de bases respecto al punto de inserci´ on Tn917 en el cromosoma de PA170. Las flechas indican la orientaci´on y localizaci´ on de los cebadores de PCR utilizados para la construcci´ on de las cepas AMJ553, AMJ569, AMJ568, AMJ567, AMJ566, AMJ565, AMJ577, AMJ558, y AMJ579, respectivamente. La figura no est´ a realizada a escala; la Figura 4 es un mapa f´ısico que muestra los fragmentos de ADN insertados dentro de pAK80 dando 10

ES 2 185 972 T3 lugar a la construcci´on de la cepa AMJ586. Las flechas indican la orientaci´ on y localizaci´ on de los cebadores de PCR utilizados para la construcci´ on. Los numerales indican las posiciones de los pares de bases respecto al punto de inserci´ on Tn917 en el cromosoma de PA170. Solo se muestran los lugares de restricci´on relevantes. La figura no est´ a realizada a escala; 5

las Figuras 5, 6 y 7 ilustran la actividad β-galactosidasa y la densidad celular respecto al tiempo obtenidas en la fermentaci´ on de las cepas AMJ553, AMJ567 y AMJ586, respectivamente;

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la Figura 8 es un mapa f´ısico de la regi´on m´as arriba y m´ as abajo, respectivamente, del punto de inserci´on Tn917-LTV1 en el integrante PA170. El punto de inserci´ on se indica por un 0 y los numerales indican las posiciones de los pares de bases respecto a este punto. Se indican los lugares de restricci´on y los cebadores utilizados para las reacciones de PCR inversa. La figura no est´a realizada a escala; la Figura 9 muestra la actividad nucleasa y la densidad celular respecto al tiempo obtenidos durante la fermentaci´ on de la cepa AMJ627; la Figura 10A muestra la secuencia de ADN del fragmento de ADN de 170 pares de bases en el pl´ asmido pAMJ553, que contiene el promotor P170 (n◦ de identificaci´on de secuencia 26). La base n◦ 1 se define como la primera base m´as arriba desde el punto de inserci´ on de Tn917 en el integrante PA170, el punto de inicio de la transcripci´ on se indica mediante un asterisco en la posici´on 114 encima de la secuencia. La regi´on del promotor -10 expandida putativa est´ a subrayada; la Figura 10B es un aumento de la secuencia salvaje situada entre los pares de bases n◦ 60 y n◦ 80. La mutaci´on o mutaciones identificadas en cada mutante se muestran debajo de la secuencia de ADN salvaje (n◦ de identificaci´on de secuencias 27, 28, 29 y 30 respectivamente); la Figura 11 muestra a la izquierda el an´alisis mediante electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS (“SDS-PAGE”) de las prote´ınas secretadas por la cepa AMJ715 (MPT64). Carril 1: marcadores de peso molecular (SeeBlueT M , Novex); carril 2: sobrenadante concentrado 40 veces obtenido de AMJ715; 3, filtrado precoz de M. tuberculosis H37Rv. A la derecha, an´alisis mediante transferencia Western de las prote´ınas secretadas por la cepa AMJ715. Carril 2: sobrenadante concentrado 40 veces obtenido de AMJ715. Las flechas muestran la localizaci´on del ant´ıgeno MPT64 de M. tuberculosis; la Figura 12 ilustra a la izquierda el an´ alisis mediante electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS (“SDS-PAGE”) de las prote´ınas secretadas por la cepa AMJ700 (ESAT-6). Carriles 1: marcadores de on recombinante ESAT-6 a partir de E. coli; carril peso molecular (Mark12T M , Novex); carril 2: preparaci´ 3: sobrenadante concentrado 20 veces obtenido de AMJ700; carril 4: sobrenadante concentrado 40 veces obtenido de AMJ700 y a la derecha el an´ alisis mediante transferencia Western de las prote´ınas secretadas por la cepa AMJ700. Los carriles 2, 3 y 4 se corresponden con lo descrito para el an´ alisis SDS-PAGE. La flecha muestra la localizaci´on de ESAT-6. la Figura 13 muestra a la izquierda el an´alisis mediante electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS (SDS-PAGE) de las prote´ınas secretadas por la cepa AMJ717 (ESAT-6-ESAT-6). Carril 1: marcadores de on recombinante ESAT-6 a partir de E. coli; carril peso molecular (SeeBlueT M , Novex); carril 2: preparaci´ 3: sobrenadante concentrado 40 veces obtenido de la cepa AMJ717 y a la derecha el an´alisis mediante transferencia Western de las prote´ınas secretadas por la cepa AMJ717 (ESAT-6-ESAT-6). Los carriles 2, 3 y 4 se corresponden con lo descrito para el an´ alisis en SDS-PAGE. Las flechas muestran la localizaci´on de ESAT-6-ESAT-6. Para la comprensi´on de la presente invenci´ on, se hace referencia al documento WO 94/16086 que se incorpora a la presente invenci´on a modo de referencia. En los ejemplos siguientes, se han incorporado los ejemplos 4, 6, 8 y 13 del documento WO 94/16086 como ejemplos de referencia 1, 2, 3 y 4 respectivamente para ilustrar el clon integrante P139-170 y el vector sonda promotor pAK80. (Las referencias a ejemplos, figuras o tablas realizadas en los ejemplos de referencia son las del documento WO 94/16086). Ejemplo de referencia 1 Producci´ on de un conjunto de inserciones de Tn 917 en Lactococcus lactis

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Para preparar un conjunto de inserciones de Tn917 en Lactococcus lactis se sigui´o el procedimiento siguiente:

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ES 2 185 972 T3

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Se inocul´ o una colonia u ´nica de Lactococcus lactis spp. lactis MG1614 que contiene pTV32 en medio GM17 y se cultiv´o durante 8 a 10 generaciones con selecci´ on para Cmr . Un uno por ciento de estas c´elulas se cultiv´o durante 8 a 10 generaciones en medio GM17 con selecci´on para Emr . La temperatura se mantuvo a 30◦C. Las c´elulas resultantes se cultivaron en placas de agar GM17 con selecci´on para Emr . Se seleccionaron de forma aleatoria 19 colonias realiz´andose la preparaci´ on y digesti´on del ADN gen´ omico in situ en bloques de agarosa tal como se describe en el Ejemplo 3. La Figura 5 y la tabla 3 muestran que 12 de los 18 clones (la digesti´on de un clon dio lugar a fragmentos que pod´ıan visualizarse como bandas separadas) pose´ıan el transpos´ on insertado en la misma localizaci´on del cromosoma, indicando que el cultivo estaba dominado por un integrante u ´nico.

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TABLA 3 Integrantes TV32 en L. lactis spp. lactis MG1614 a partir de un cultivo con un integrante dominante

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Grupo

Objetivo de TV32: fragmento cromos´omico SmaI (kb)

Longitud de fragmento (kb) de los fragmentos objetivo digeridos con SmaI con TV32 insertadoa)

Miembro del grupo (n◦ del integrante)

1 2 3 4

600 600 600 310

540 475 400 190

E15 E4 E13, E16 E1, E3, E6, E7, E8, E10, E11, E12, E14, E17, E18, E19 E9b)

5

200 140 175

x+x x+x 160 + x

20

25

30

6

+ + + +

70 (= 610) x 210 (= 610) 140 (= 330)

E2

a) indica un fragmento que no pudo detectarse en los geles de PFGE 35

b) integrante doble Para evitar la existencia de un integrante dominante en el cultivo se seleccion´ o el procedimiento siguiente: 40

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La cepa MG1614 se transform´o con pTV32 tal como se ha descrito en el Ejemplo 1. Las c´elulas transformadas se cultivaron en placas de agar SGM17 conteniendo 1 µg/ml de eritromicina. Tras una incubaci´ on a 30◦C durante 48 horas, 20 placas, cada una con aproximadamente 100 colonias, se replicaron en placas de agar GM17 con selecci´on para Emr . Las placas replicadas se incubaron a 30◦C durante 30 horas. Se repiti´ o la etapa de replicaci´on y las colonias se lavaron y agruparon. Del cultivo agrupado, se seleccionaron de forma aleatoria 18 integrantes y se analizaron mediante PFGE tal como se ha descrito previamente. En base a la localizaci´on de las inserciones Tn917 en los fragmentos cromos´omicos SmaI, los 18 integrantes se dividieron en 13 grupos de los cuales ninguno conten´ıa m´ as de 2 inserciones (Figura 6 y tabla 4). Se concluy´ o por tanto que el cultivo agrupado conten´ıa un conjunto de transposones con inserciones TV32 en la cepa MG1614 de forma casi aleatoria.

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(Ver TABLA 4 en p´agina siguiente)

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ES 2 185 972 T3 TABLA 4 Integrantes TV32 en Lactococcus lactis spp. lactis MG1614 de un cultivo con inserciones TV32 casi aleatorias 5

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Longitud de fragmento (kb) de los fragmentos objetivo digeridos con SmaI con TV32 insertadoa)

Miembro del grupo (n◦ del integrante)

Grupo

Objetivo de TV32: fragmento cromos´omico SmaI (kb)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

600 600 600 600 600 600 600 310 200 140 140 140 120

540 + 70 (= 610) 530 + 80 (= 610) 520 + 90 (= 610) 510 + 100 (= 610) 470 + 120 (= 590) 460 + 140 (= 600) 375 + 220 (= 595) 185 + 140 (= 325) 175 + x 110 + x 105 + x x+x x+x

K10, K20 K3, K12 K9, K18 K13 K14 K17 K4, K6 K2 K11 K1 K5, K16 K7 k8

a) indica un fragmento que no pudo detectarse en los geles PFGE 30

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Se a˜ nadi´ o glicerol est´eril al cultivo agrupado a una concentraci´ on de hasta un 25 % y se almacen´ o esta mezcla a -80◦ C. Se prepar´ o un cultivo agrupado que conten´ıa un conjunto de inserciones LTV1 casi aleatorias en Lactococcus lactis spp. lactis MG1363 esencialmente tal como se ha descrito previamente. Sin embargo, previamente al lavado y agrupamiento de las colonias se realiz´o lo siguiente: Se a˜ nadieron a las placas utilizadas para la segunda replicaci´ on 320 µg/ml de X-gal. En la segunda placa de replicaci´on se observaron 242 colonias con diferentes intensidades de azul. Por el contrario, menos del 5 % de estas colonias eran azules en placas de agar GM17 conteniendo 40 µg/ml de X-gal incubadas durante m´ as de 48 horas. (40 µg/ml de X-gal es la concentraci´ on est´andar para la identificaci´ on de la expresi´on de lacZ en E. coli). Las 242 colonias azules que aparec´ıan en la placa que conten´ıa 320 µg/ml de X-gal se recultivaron en l´ınea para obtener colonias u ´nicas en GM17 con 1 µg/ml de eritromicina y 320 µg/ml de X-gal sigui´endose de un nuevo recultivo en l´ınea en el mismo medio. Una u ´ nica colonia de cada uno de estos subcultivos se inocul´ o en medio GM17 l´ıquido suplementado con 1 µg/ml de eritromicina y nadi´endose glicerol est´eril a una concentraci´ on del 25 % a cada se incubaron durante una noche a 30◦C, a˜ uno de estos subcultivos para su almacenamiento a -80◦ C. Estos 242 clones se referir´an a partir de este momento como conjunto de fusi´ on de promotores n◦ 1 (PFC-1). Uno de los clones PFC-1 de Lactococcus lactis spp. lactis MG1363 con la denominaci´ on P139-170 se deposit´ o en el DSM-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-38124, Braunschweig, Alemania el 21 de diciembre de 1992 bajo el n´ umero de registro DSM 7360. Ejemplo de referencia 2 Construcci´ on de un vector sonda-promotor para bacterias productoras de a´cido l´ actico

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Una herramienta u ´ til para analizar las condiciones que activan un gen y determinar su nivel de expresi´on es una sonda promotor. Se ha construido un vector sonda-promotor para Lactococcus, pGKV210, basado en la cloramfenicol acetil transferasa y dirigido por el replic´ on pWVO1 (van der Vossen y otros, 1985). Desafortunadamente, este vector solo proporciona una resistencia ligeramente aumentada al cloramfenicol cuando los promotores se clonan en el mismo (van der Vossen y otros, 1987). La traducci´ on 13

ES 2 185 972 T3 del ARNm que contiene el gen cat-86 se activa por el cloramfenicol (Alexieva y otros, 1988) de manera que el nivel de enzima medido es dependiente de dos factores, la potencia del promotor y la eficiencia de la activaci´on. Adem´ as, el replic´on pWVO1 se replica mediante la replicaci´on en c´ırculo giratorio, y por tanto es susceptible de inestabilidad segregacional dependiente del tama˜ no (Kiewiet y otros, 1993). 5

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Se construy´o un vector sonda-promotor para Lactococcus y presumiblemente para otras bacterias productoras de a´cido l´ actico basado en los genes de la β-galactosidasa del Leuconostoc mesenteroides subespecie cremoris, el replic´on pl´ asmido citrato del Lactococcus lactis subespecie lactis biovariedad diacetylactis y en un marcador de resistencia a la eritromicina. Este vector se denomin´ o pAK80. La clonaci´ on del promotor para el conjunto de ARNt adyacente al gen tma de CHCC285 demostr´o que este vector funciona. La construcci´on resultante, pAK90, produce niveles extremadamente elevados de β-galactosidasa en MG1363. Se clonaron los genes de la β-galactosidasa de Leuconostoc mesenteroides subespecie cremoris y se hall´ o que eran pr´ acticamente id´enticos al gen de la β-galactosidasa del Leuconostoc lactis (David y otros, 1992). Se ha demostrado que ambos genes se expresan en Escherichia coli y en la cepa MG1363 de Lactococcus lactis. Se elimin´ o el promotor del gen de la β-galactosidasa mediante la reacci´ on en cadena de la polimerasa (PCR) y se substituy´ o por un poliligador, permitiendo la clonaci´on de diversos fragmentos de ADN y el an´ alisis de la actividad del promotor. Esta construcci´ on se clon´o en un vector transportador que contiene el replic´on pl´ asmido citrato de L. lactis subespecielactis biovariedad diacetylactis, el replic´on pACYC184 para E. coli y un marcador gen´etico (resistencia a la eritromicina) para ambos organismos. La clonaci´on de un promotor de ARNt en el poliligador dio lugar a niveles elevados de β-galactosidasa en MG1363, demostrando que el vector funciona seg´ un lo planificado. A. Materiales y m´etodos 1. Cepas bacterianas, pl´ asmidos y medios de cultivo

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MG1363 es una cepa de Lactococcus lactis libre de pl´ asmidos (Gasson, 1983). Para la clonaci´on se utiliz´o Escherichia coli DH5α [supE44 lac∆U169 hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi-1 re1A1 Φ80lacZ∆m15] (Hanahan, 1983). Los vectores de clonaci´on y los marcadores relevantes que se utilizaron fueron: pVA891 [resistencia a la eritromicina; EmR ] (Macrina y otros, 1983), y pIC19H [resistencia a la ampicilina; AmpR ] (Marsh y otros, 1984). Los diferentes pl´asmidos construidos durante la construcci´on del vector sonda-promotor se describen a continuaci´ on. Las cepas de Lactococcus se cultivaron a 30◦C en medio GM17. Las cepas de E. coli se cultivaron en medio LB a 37◦C. Los antibi´oticos se utilizaron a las concentraciones siguientes: para E. coli; eritromicina, 250 µg/ml; y ampicilina 50 µg/ml; para Lactococcus; eritromicina 1 µg/ml. 2. Preparaci´ on y transformaci´ on de pl´ asmidos

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El pl´asmido de ADN para la secuenciaci´on y electroporaci´ on se prepar´ o con el kit de pl´ asmidos Qiagen (Diagen, Dusseldorf, Alemania). Las preparaciones de pl´ asmidos a peque˜ na escala para Lactococcus se realizaron esencialmente seg´ un Isralesen y otros (1993).

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Los pl´ asmidos se introdujeron en MG1363 mediante electroporaci´on de las c´elulas competentes cultivadas con glicina esencialmente seg´ un Holo y Nes (1989). 3. Ensayos de β-galactosidasa

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La actividad del promotor se determin´o determinando la actividad β-galactosidasa en cultivos realizados en medio G1.5M17 durante la noche. Se centrifug´ o 1 ml de cultivo a 10.000 x g durante 10 minutos.

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14

ES 2 185 972 T3 El pellet se resuspendi´ o en 500 µl de tamp´ on Z (Miller, 1972). Se mezclaron 100 µl de suspensi´on celular con 400 µl de tamp´ on Z, 12,5 µl de SDS al 0,1 % y 25 µl de CHCl3 en un mezclador Vortex durante 10 segundos. Tras el mezclado en Vortex la suspensi´on se trat´ o tal como se describe en el ejemplo 7. Los resultados se muestran en la Tabla 7. 5

Los resultados del ensayo se muestran en unidades Miller. Una unidad Miller = (1000 x A420 ) / (tiempo x volumen x A600 ) (siendo el tiempo en minutos y el volumen en ml). B. Construcci´ on de pAK66 10

Se obtuvieron dos cebadores de PCR que permitieron la amplificaci´ on de la regi´ on de replicaci´on completa del pl´ asmido citrato. Estos cebadores pose´ıan las siguientes secuencias: Cebador 1 5’ TGAATTCAGAGGTTTGATGACTTTGACC 3’ (n◦ de identificaci´on de secuencia 1) 15

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Cebador 4 5’ GGAATTCCTAACAAAAGACTATTAACGC 3’ (n◦ de identificaci´on de secuencia 2) El cebador 1 corresponde a los nucle´ otidos 610-621 y el cebador 4 es complementario a los nucle´ otidos 2340-2361 de la regi´ on de replicaci´on del pl´ asmido citrato (Jahns y otros, 1991). Ambos contienen lugares EcoRI en su extremo 5’ para facilitar la clonaci´ on. El producto de amplificaci´ on de 1,7 kb se clon´ o en forma de fragmento EcoRI en pIC19H dando lugar a pKR41. A continuaci´ on, este fragmento EcoRI se movi´o al u ´ nico lugar EcoRI de pVA891 dando lugar al vector transportador pAK66 el cual es capaz de replicarse en E. coli y L. lactis MG1363. La construcci´on de pKR41 ha sido descrita en un manuscrito remitido para su publicaci´on (Pedersen y otros, 1993).

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C. Clonaci´ on del gen de la β-galactosidasa de Leuconostoc mesenteroides subesp. Cremoris

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Durante el proceso de clonaci´on y secuenciaci´on de IS1165 a partir de la cepa DB1165 de Leuconostoc mesenteroides subesp. cremoris obtuvimos un clon denominado pSB1 (Johansen y Kibenich, 1992). Este clon conten´ıa un inserto de 5,8 kb en el poliligador de pIC19H. En condiciones normales, la clonaci´on de pIC19H destruye la actividad β-galactosidasa y las colonias con el inserto son de color blanco en X-gal. pSB1 era extra˜ na en el sentido de que daba lugar a colonias azules en X-gal. El an´ alisis de secuencia del ADN revel´o que el inserto en pSB1 conten´ıa el gen de la β-galactosidasa de Leuconsotoc mesenteroides subesp. cremoris y que ´este era pr´ acticamente id´entico al de Leuconostoc lactis (David y otros, 1992). ´ Unicamente se detectaron tres diferencias de los 830 bp secuenciados. D. Construcci´ on de pAK67.7

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Esta construcci´on supuso la substituci´on del promotor de la β-galactosidasa por un poliligador y la inserci´on de codones de terminaci´ on en los tres marcos de lectura hacia adelante y se ilustra en la Figura 8. El promotor se elimin´o mediante PCR utilizando dos cebadores: lac-1 ATAGATCTGCAGGATCCCGGGTAACTTTGAAAGGATATTCCTC (n◦ de identificaci´on de secuencia: 3)

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lac-2 ATTGAGGGTATACGGTGGGCG (n◦ de identificaci´on de secuencia: 4) La parte subrayada de lac-1 es id´entica al inicio del gen de la β-galactosidasa y contiene el lugar de uni´ on a ribosomas. El resto de la secuencia contiene una serie de lugares de restricci´on entre los que se incluye Bg1II. El cebador lac-2 se hibrida al gen de la β-galactosidasa, 20 bp m´ as abajo del u ´nico lugar NcoI. La amplificaci´on mediante PCR de estos cebadores amplifica desde el lugar de uni´on a ribosomas hasta justo por encima del lugar NcoI produciendo un fragmento de 360 bp que contiene diversos lugares de restricci´ on en un extremo y un lugar NcoI en el otro extremo no poseyendo ning´ un promotor ni ning´ un otro tipo de secuencia de regulaci´on del gen de la β-galactosidasa. Este fragmento de 360 bp se purific´ o, digiri´o con Bg1II y NcoI y se clon´ o dentro de pSB1 digerido con BG1II/NcoI. El pl´ asmido resultante se denomin´ o pAK67 y presentaba el siguiente poliligador precediendo al gen de la β-galactosidasa:

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ES 2 185 972 T3

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a: (n◦ de identificaci´on de secuencia: 6) b: (n◦ de identificaci´on de secuencia: 7) c: (n◦ de identificaci´on de secuencia: 8)

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El an´ alisis de secuencia de ADN mostr´o que este poliligador estaba presente y que no se hab´ıan introducido alteraciones en el gen de la β-galactosidasa debido a errores durante la PCR. Como puede observarse en la secuencia anterior, existen dos marcos de lectura abiertos que transcurren a lo largo del poliligador dentro del gen de la β-galactosidasa. Dado que ´estos pueden interferir potencialmente con la expresi´ on de la β-galactosidasa a partir de promotores insertados en el poliligador, se decidi´o introducir codones de terminaci´ on en los tres marcos de lectura hacia adelante. Ello se llev´o a cabo mediante la obtenci´ on de dos oligonucle´ otidos con las secuencias siguientes: Terminador-1 GGGTCTAGATTA (n◦ de identificaci´on de secuencia: 9) Terminador-2 TAATCTAGACCC (n◦ de identificaci´on de secuencia: 10)

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Estos oligonucle´otidos son complementarios y se hibridar´ an dando lugar a un fragmento de 12 bp de ADN de doble cadena que contiene un lugar de restricci´ on XbaI. Este peque˜ no fragmento se clon´o en el lugar SmaI de pKA67. Estos oligonucle´ otidos se dise˜ naron de forma que se retuviera el lugar SmaI, existiera un nuevo lugar XbaI en los pl´ asmidos con este peque˜ no inserto y se introdujeran codones de terminaci´on dentro de los dos marcos de lectura abiertos. La clonaci´ on se realiz´ o digiriendo pAK67 con SmaI, tratando con fosfatasa y ligando con una mezcla de dos oligonucle´ otidos que hab´ıan sido tratados con quinasa y a los que se hab´ıa permitido hibridarse entre s´ı. Se purificaron los transformantes y se analizaron adicionalmente aquellos en los que el pl´asmido hab´ıa ganado un lugar XbaI. El an´ alisis de secuencia de ADN revel´o que un clon, denominado pAK67.7, pose´ıa la estructura deseada:

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(Ver Secuencia en p´ agina siguiente) 60

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ES 2 185 972 T3

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a: (n◦ de identificaci´on de secuencia: 12) 25

b: (n◦ de identificaci´on de secuencia: 13) c: (n◦ de identificaci´on de secuencia: 14) E. Construcci´ on de pAK80

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La etapa final en la producci´ on del vector sonda-promotor fue la combinaci´on del gen de la βgalactosidasa manipulado con un replic´ on y un marcador gen´etico para Lactococcus. Ello se consigui´o mediante la digesti´on de pAK67.7 con HindIII y SalI y lig´andolo dentro de pAK66, el cual tambi´en hab´ıa sido digerido con HindIII y SalI. Entre los pl´ asmidos producidos, el vector sondapromotor exactamente igual al originalmente dise˜ nado fue pAK80. El pl´ asmido pAK80 contenido por Lactococcus lactis spp. lactis MG1363 se deposit´o en la DSMDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Alemania en 27 de Agosto de 1993 bajo el n´ umero de registro DSM 8496. F. An´ alisis de pAK80 utilizando dos promotores de ARNt regulables

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Se aisl´o un fragmento de ADN de Lactococcus lactis subesp. lactis adyacente al gen tma de CHCC285 y se observ´o que conten´ıa un grupo de genes ARNt precedidos por una regi´ on promotora (Figuras 11 y 12) que comprend´ıa dos promotores potenciales (PI, nucle´otidos 107-134; PII, nucle´ otidos 215-242). Los promotores PI y PII, contenidos en un fragmento HindIII-ScaI de 501 bp aislado a partir del clon pLN39 se clonaron insertando dicho fragmento en pAK80 digerido con HindIII y SmaI, frente al gen de la β-galactosidasa carente de promotores de Leuconostoc mesenteroides subesp. cremoris. Tras realizar la ligadura, MG1363 se electropor´ o y las c´elulas se cultivaron en medio de regeneraci´on (Holo y Nes, 1989) que conten´ıa eritromicina y X-gal. Se obtuvieron un total de siete colonias azules. El an´alisis de pl´ asmidos revel´o que las siete colonias pose´ıan pl´ asmidos id´enticos y que todas conten´ıan la inserci´on deseada en pAK80. Se aisl´ o un pl´ asmido y se design´ o pAK90. Las determinaciones de β-galactosidasa revelaron que MG1363/pAK90 produc´ıa 5000 unidades Miller de enzima, mientras que MG1363/pAK80 produc´ıa 1 unidad Miller. Por tanto, la regi´ on que precede a los genes ARNt contiene un promotor muy potente. La b´ usqueda de secuencias con similitudes con la secuencia de la regi´on promotora anterior (Figura 13) revel´ o una secuencia consenso de promotores precediendo los operones ARNr y los operones ARNt de las especies Lactococcus incluyendo una secuencia conservada (motivo) AGTT, no descrita previamente.

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ES 2 185 972 T3

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Esta secuencia finaliza 5 bp m´as arriba de la regi´ on -35 y no se encuentra conservada en los promotores ARNt y ARNr de Escherichia coli o Bacillus subtilis. En todas las especies de Lactococcus en las que se hall´ o que este motivo AGTT preced´ıa a promotores potenciales ARNr o ARNt, se aislaron todos estos promotores a partir de pl´ asmidos en los cuales se hab´ıan insertado dichos promotores frente al gen cat-86 que codifica la cloramfenicol acetiltransferasa. Dado que este enzima se expresa escasamente en Lactococcus lactis, solo puede obtenerse resistencia al cloramfenicol en este organismo mediante la clonaci´on de promotores potentes frente al gen cat-86. Por tanto parece que el motivo AGTT se halla u ´nicamente en promotores potentes de Lactococcus lactis. Los dos promotores anteriores PI y PII contienen secuencias conservadas que se asume que est´an implicadas en el control estricto (Figura 13) y por tanto, parece que estos promotores son promotores regulables. Un fragmento de 1,0 kb HindIII-EcoRI obtenido a partir de pLN39 se insert´ o dentro del pl´ asmido pCI3340 digerido con HindIII y EcoRI y el pl´ asmido resultante pLN40 se introdujo en Lactococcus lactis MG1363. pLN40/MG1363 se deposit´o en la DSM-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Cellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Alemania el 22 de Diciembre de 1993 bajo el n´ umero de registro DSM 8858. G. Conclusiones Este ejemplo describe la construcci´ on de un vector sonda-promotor novedoso para Lactococcus y presumiblemente para otras bacterias productoras de a´cido l´ actico. Este vector presenta diversas ventajas sobre los vectores descritos previamente. Se basa en el replic´on pl´ asmido citrato del Lactococcus lactis subespecie lactis biovariedad diacetylactis, un pl´ asmido de replicaci´ on theta, y por tanto m´ as estable. El gen indicador escogido no se encuentra sujeto a control post-transcripcional por lo que los niveles de enzima pueden medirse sin la presencia de inductores. Este hecho contrasta con los pl´ asmidos basados en el gen cat-86 en los cuales, el cloramfenicol activa, de hecho, la traducci´on del ARNm (Alexieva y otros, 1988). Las determinaciones enzim´ aticas y los ensayos en placa del gen indicador son sencillos siendo procedimientos est´andar en la mayor´ıa de laboratorios. Ejemplo de referencia 3

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Clonaci´ on de fragmentos de ADN que contienen un promotor de bacterias productoras de a ´cido l´ actico y evaluaci´ on de la actividad promotora en Lactococcus lactis A. Clonaci´ on en E. coli de fragmentos EcoRI que contienen ADN de Lactococcus lactis y el replic´ on ColE1 a partir de integrantes Tn 917-LTV1

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Se prepararon fragmentos cromos´ omicos EcoRI que conten´ıan ADN de lactococcus, lacZ, cat, bla y el replic´on ColE1, de acuerdo con el m´etodo descrito en el Ejemplo 5 a partir de los integrantes Tn917-LTV1 enumerados en la Tabla 5 siguiente. A continuaci´on se religaron los fragmentos y se introdujeron en E. coli DH5α mediante transformaci´on tal como se describe en Maniatis y otros (1982). Los pl´ asmidos resultantes con fragmentos de integrantes Tn917-LTV1 se denominaron p[n◦ del integrante], por ejemplo p86, p143 y pSB. Todos los integrantes Tn917-LTV1 a partir de los cuales se aislaron los fragmentes se encuentran en Lactococcus lactis MG1363 excepto SB el cual es un Tn917-LTV1 en Lactococcus lactis MG1614.

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55

(Ver TABLA 5 en p´agina siguiente)

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18

ES 2 185 972 T3 TABLA 5 Par´ ametros de regulaci´ on de la expresi´ on de β-galactosidasa en los integrantes seleccionados. par´ ametros se deducen a partir de los ensayos en placa 5

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N◦ de integrante

Par´ ametro

86 143 159 162 163 170 172 179 187 188 189 192 199 201 202 222 224 241 242 SB

arg./pH temperatura/velocidad de crecimiento temperatura/velocidad de crecimiento arg./pH arg./pH; pO2 temperatura/velocidad de crecimiento; arg./pH temperatura/velocidad de crecimiento arg./pH; NaCl/fuerza i´ onica temperatura/velocidad de crecimiento temperatura/velocidad de crecimiento NaCl/fuerza i´onica temperatura/velocidad de crecimiento; arg./pH NaCl/fuerza i´onica; arg./pH temperatura/velocidad de crecimiento temperatura/velocidad de crecimiento arg./pH arg./pH NaCl/fuerza i´onica arg./pH temperatura/velocidad de crecimiento; arg./pH

Los

B. Subclonaci´ on pl´ asmidos con un fragmento de integrantes Tn 917-LTV1 en el vector de selecci´ on de promotores pGKV210 pGKV210 es un vector de selecci´ on de promotores que contienen un gen erm como marcador de selecci´on y un gen cat-86 carente de promotores precedido por un poliligador (van der Vossen y otros, 1987). El gen cat-86 se expresa si se inserta con la orientaci´on correcta en el poliligador un fragmento de ADN que porte un promotor. El nivel de resistencia al cloramfenicol conferida al hu´esped depende de la potencia del promotor. Todos los pl´asmidos con un fragmento de integrante poseen un lugar ClaI situado en el ADN originado de la parte lacZ de Tn917-LTV1. Para clonar los fragmentos EcoRI-ClaI a partir de pl´ asmidos, primeramente se introdujo un lugar ClaI en el poliligador de pGKV210 del siguiente modo: Se clon´ o el ligador de ADN sint´etico: 5’ GATCGCCATCGATGGC 3’ (n◦ de identificaci´on de secuencia: 15)

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3’ CGGTAGCTACCGCTAG 5’ (n◦ de identificaci´on de secuencia: 16) que contiene un lugar ClaI en el u ´ nico lugar BamHI de pGKV210 tal como se describe en Maniatis y otros (1982). El pl´ asmido obtenido se denomin´ o pGKV210(ClaI). 50 ng de pGKV210(ClaI) digeridos con ClaI y EcoRI se mezclaron y ligaron con 200 ng del fragmento purificado ClaI-EcoRI tal como se ha definido previamente. Ello se realiz´o con los fragmentos ClaI-EcoRI obtenidos a partir de los siguientes pl´ asmidos con fragmento de integrantes: p143, p162, p163, p170, p172, p224, p237, p242 y pSB. p162 contiene un lugar ClaI adicional situado en el ADN originario de Lactococcus. El fragmento desde el lugar EcoRI de este pl´ asmido hasta el lugar ClaI adicional se insert´ o en pGKV210(ClaI). Todo el trabajo de recombinaci´ on de ADN de este Ejemplo se realiz´o de acuerdo con Maniatis y otros (1982). Las construcciones derivadas de pGKV210 resultantes se denominaron pGKV210 [n◦ del integrante], por ejemplo pGKV210:143, pGKV210:162 y pGKV210:SB. Los derivados de pGKV210 se introdujeron 19

ES 2 185 972 T3

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en E. coli MC1000 (F-, araD139 (∆ara-leu) 7679, galU, galK(∆lac)X74, rpsL(Strr), thi) seg´ un el m´etodo descrito en el Ejemplo 5. Los derivados de pGKV210 se extrajeron tal como se describe en Maniatis y otros (1982) a partir de la cepa hu´esped transformada. Por cada derivado de pGKV extra´ıdo, se introdujo 1 µg de ADN en Lactococcus lactis MG1363 de acuerdo con el m´etodo descrito en el Ejemplo 1. Los transformantes resultantes (derivados pGKV/MG1363) se denominaron pGKV210 : [n◦ del integrante]/MG1363, por ejemplo pGKV210:143/MG1363. Se determin´ o la actividad promotora de los fragmentos clonados anteriores y de los derivados de pGKV210 previamente publicados en Lactococcus lactis IL1403 (van der Vossen y otros, 1987) mediante cultivo en placa nocturno de los derivados pGKV/MG1363 en placas GM17 suplementadas con 5 mg/l de eritromicina y concentraciones crecientes de cloramfenicol. Las concentraciones de cloramfenicol utilizadas fueron 4, 6, 8, 12, 16 y 20 mg/l, respectivamente. En las placas con 4-8 mg/l de cloramfenicol se cultivaron 50 µl de cultivo diluido 104 veces en suspensi´on acuosa de NaCl al 0,9 %. En las placas con 12-20 mg/l de cloramfenicol se cultivaron 100 µl de cultivo diluido 104 veces en suspensi´on acuosa andose la de NaCl al 0,9 %. Las placas se incubaron a 30◦ C durante aproximadamente 80 horas determin´ concentraci´on m´ axima de cloramfenicol que segu´ıa permitiendo el crecimiento del cultivo. Los resultados se muestran el la Tabla 6 siguiente. ´ Unicamente dos derivados de pGKV/MG1363 fueron resistentes a concentraciones superiores a los 4 mg/l de cloramfenicol. Sin embargo se hallaron dificultades en la interpretaci´on de los resultados, por ejemplo debido a la aparici´ on de colonias peque˜ nas, y parece que este ensayo es inadecuado para promotores de potencia media o d´ebil. pGKV244/IL1403 y pGKV259/IL1403 produjeron 0,2 y 5,1 unidades, respectivamente, cuando se ensay´ o su actividad cloramfenicol acetiltransferasa (van der Vossen y otros, 1987)

25

TABLA 6 Niveles de cloramfenicol (Cm) m´ aximas que permiten el crecimiento de la cepa MG1363 conteniendo pGKV210 y derivados pGKV210

30

35

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Pl´ asmido contenido por MG1363

Concentraci´on de Cm (g/ml)

pGKV210 pGKV244 pGKV259 pGKV210:143 pGKV210:162 pGKV210:163 pGKV210:170 pGKV210:172 pGKV210:224 pGKV210:237 pGKV210:242 pGKV210:SB